物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

この手順の全体的な目標は、ナノ多孔質金のマイクロパターンを作製し、細胞培養との適合性を実証することです。これは、最初にステンシルまたはフォトリトグラフマスクを作成することによって実現されます。2番目のステップは、マスクを介して金と銀を共スパッタリングして、ナノ多孔質金の前駆体合金をパターン化することです。

次に、金銀合金パターンを硝酸で脱合金化して、ナノ多孔質金コーティングを生成します。最後のステップは、ナノ多孔質の金マイクロパターン上で細胞を培養し、最終的にそれらを免疫染色することです:画像分析と組み合わせた蛍光および走査型電子顕微鏡法を使用して、細胞材料の相互作用を定量化します。カーボンナノチューブのようなナノ構造コーティングを作成するための他の方法に対するこの技術の主な利点は、ナノ多孔質金が微細加工適合性、高い有効表面積、タイルベースの化学による官能化の容易さ、電気伝導性、および生体適合性から恩恵を受けることです。

この方法は、材料ナノ構造が電気的、機械的、生物学的、化学的特性に及ぼす影響など、材料科学および生物工学分野の重要な質問に答えることができます。この方法は、ナノ構造が細胞形態に及ぼす影響についての洞察を提供します。また、バイオセンサーの開発、ドラッグデリバリーシステム、エネルギー貯蔵プラットフォームなど、他のシステムにも適用できます。

この手順は、1インチ×3インチの顕微鏡スライドと小さなカバースリップをピラニア溶液で洗浄し、小さなカバースリップを磁器免疫染色ボートにロードし、ボートと顕微鏡スライドをピラニア溶液に浸すことから始めます。クリーニング手順の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。洗浄後、サンプルを結晶化皿に移し、di水で3分間すすぎます。

糸くずの出ないタオルにサンプルを置き、窒素ガンでブロードライして、ミリメートルスケールのパターンを作成します。厚さ250ミクロンのシリコーンエラストマーシートを生検パンチで打ち抜きます。加工されたエラストマーシートを70%イソプロパノールに浸して洗浄し、窒素ガンで乾燥させます。

次に、パンチシートを糸くずの出ないタオルの上に置き、クリーニングしたカバースリップをステンシルの上に位置合わせしますampステンシルの表面をステンシルに向けます。カバースリップ付きのステンシルをキャリアウェーハに転写し、サブミリメートルスケールのパターンを作成します。洗浄した顕微鏡を置き、回転するチャックにスライドさせ、窒素ガンで微粒子を吹き飛ばします。

1.5ミリリットルのヘキサメチルジランをスライドガラスに分注します。.プラスチック製ピペットを使用して、スライドを500 RPMで5秒間、1500 RPMで30秒間連続して回転させることにより、ヘキサメチルジランを広げます。完成したら、スライドを115°Cのホットプレートで7分間焼き、次に5分間冷まします。

次に、ポジ写真を4ミリリットル分注ぎます。スライドガラスに抵抗します。スライドを前述の条件で回転させることにより、フォトレジストを広げます。

スライドを115°Cのホットプレートで1.5分間焼き、UV暴露とベーキング後に取り出します。露光した写真を溶解します。スライドをポジ写真に沈めて抵抗します。

現像液を少なくとも3.5分間抵抗します。終了したら、スライドをDI水で十分にすすぎ、光学顕微鏡で現像パターンを検査します。次に、金、銀、クロムのスパッタを独立して堆積できるスパッタリングマシンにサンプルをロードします。

25ミリトンのアルゴンヌ処理雰囲気下で50ワットで90秒間サンプルを洗浄した後、10ミリトンのアルゴンヌスパッタクロムの下で300ワットで10分間金属堆積を開始します。次に、400ワットで90秒間金をスパッタリングし、続いて金と銀を10分間、銀を200ワット、金を100ワットで共スパッタリングします。シルバースパッタソースをオフにする前に、約10秒でゴールドスパッタソースをオフ

スパッタリング装置からサンプルを取り出した後、スパッタリング装置からサンプルを取り出します。約180ミリリットルのポジ写真でそれらを超音波処理します。ストリッパーを22回目の超音波処理の10サイクルにレジストリッパーし、サイクル間に2分間の一時停止を挟みます。

終了したら、サンプルをdi水ですすぎ、窒素ガンで乾燥させます。顕微鏡で金属パターンを検査します。次に、2本のピンセットを使用して、非フォトレジストコーティングされたサンプルからエラストマーステンシルをはがし、堆積した金属を明らかにします。

小さなカバースリップを硝酸に浸す前に、10ワットのエアプラズマで30秒間処理します。De合金顕微鏡は、摂氏55度で70%硝酸のビーカーに15分間沈めることによりスライドします。脱合金が完了したら、サンプルをそれぞれ3回di水のビーカーに連続して浸してサンプルをすすぎます。

糸くずの出ないタオルにサンプルをのせ、窒素ガンでブロードライします。ホットプレートの温度を摂氏150度から300度に調整します。次に、サンプルを高温の表面にゆっくりと降ろして、急激な温度変化を最小限に抑えます。

5分後、サンプルをホットプレートから取り出して冷まします。ナノ多孔質金サンプルをポリスチレン皿に入れ、10ワットのエアプラズマで30秒間処理します。次に、サンプルを24ウェル組織培養プレートに移します。

それぞれに500マイクロリットルの完全な培地を追加します。プレートを摂氏37度、CO2の加湿インキュベーターにしっかりと保管し、細胞を播種します。マウス星状細胞をT 75フラスコに保持し、培地を使用します。

細胞が70%コンフルエントになったら、まず古い培地を取り除き、PBSで細胞を洗浄して継代します。passeng 条件の詳細については、テキスト プロトコルを参照してください。インキュベーターから培養プレートを取り出した後、ウェルから使用済み培地を吸引し、細胞をガラス上に播種します。

カバーは、1平方センチメートルあたり25, 000セルの密度でスリップし、最終容量は1ミリリットルです。培養プレートを振って、サンプル上に細胞が均一にコーティングされるようにし、細胞を分析する準備ができたら、培養プレートをインキュベーターに入れます。使用済みの培地をウェルから取り出し、PBSで2回洗います。

細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドに固定し、2回洗浄した後、PBS中の0.1%Triton X 100の500マイクロリットルで5分間浸透させます。PBS洗浄を2回繰り返し、細胞をクリーンウェルに移します。染色液80マイクロリットルをサンプルにブロップし、アルミホイルで覆って20分間保存します。

別のPBS洗浄に続いて、PBS中の3ナノモルのDPIで細胞を5分間対比染色します。細胞をもう一度PBSで洗浄し、diに浸してから、細胞をガラスに取り付けます。スライドを封入剤で覆い、クリアなマニキュアの画像で密封します。

ナノ多孔質の金表面は、二次電子検出器を使用して10キロボルトの電子エネルギーで50, 000倍倍の拡大を持つ走査型電子顕微鏡を備えています。これに続いて、適切なフィルターキューブを使用して、10倍倍の拡大で倒立蛍光顕微鏡を使用して、サンプル上のさまざまなスポットで複合細胞画像をキャプチャします。画像J.画像を個々のチャンネルに分割します。

それらを8つの入札に変換します。背景を減算し、中央値フィルタリングによってそれらを滑らかにします。次に、しきい値を手動で調整して、細孔、細胞体、および核を強調します。

watershedコマンドを使用して、マージされた細孔またはセルを分離します。粒子解析パラメータを設定し、コマンドを実行して、粒子の数、平均面積、および粒子ごとのカバレッジを抽出します。最後に、付属のマクロファイルを変更して、複数の画像のバッチ分析を実行します。

d合金化前後の蒸着金属パターンの色変化を示します。銀色の仕上がりは、合金化時の銀が豊富な合金含有量によるものです。フィルムは目に見えてオレンジブラウンの色合いを帯びます。

ここに示されているのは、フォトリソグラフィーによって生成されるより細かい特徴です。金属のパターニング。ナノ多孔質金膜の熱処理により、異なる貧弱な形態を得ることができる。

断面画像は、フィルムが膜厚を通じて均一に脱合金化されているかどうかを明らかにします。走査型電子顕微鏡画像は、ボイドによるサイズとカバレッジの割合を決定するために、バイナリ画像に分割できます。この出力を生成するコードは、JoVE の Web ページからダウンロードできます。

ナノ多孔質金表面で培養した付着性マウス星状細胞の代表的な蛍光画像を以下に示します。画像の個々のチャンネルを分割してセグメント化し、細胞材料の相互作用を解析するためのバイナリ画像を生成できます。セグメント化された細胞骨格画像は、細胞の面積と表面被覆率の定量化に使用できます。

一方、セグメント化された細胞核画像は、細胞のカウントに役立ちます。これらの出力を生成するためのコードは、JoVEのWebページからダウンロードできます。ここに示されているのは、PO膜の接着、多孔性の欠如、過度の熱処理など、ナノ多孔質金構造の製造における失敗の視覚的な要約です。

この手順に続いて、他の方法により、森林顕微鏡での電気化学的特性評価、細胞溶解、およびPCRを実行して、ナノ構造細胞接着や遺伝子発現の影響などの追加の質問にさらに答えることができることが示唆されています。このビデオを見れば、ナノポアの金パターンを作製し、顕微鏡のデジタル画像解析によって細胞との相互作用を定量化する方法についてよく理解できるはずです。業績。硝酸、硫黄酸、過酸化水素の取り扱いは非常に危険である可能性があるため、この手順を実行する際には、個人用保護具の成長を含む予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。