Name: 物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 2 s
Description: 学ぶナノ多孔性金薄膜の微細加工法と細胞培養への応用。ステンシル印刷やフォトリソグラフィーを用いたパターン形成と脱合金化プロセスを解説し、蛍光顕微鏡による細胞・材料相互作用の定量的解析手法を紹介する。

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O. KurtulusとD. Dimliogluは、カリフォルニア大学研究費研究プログラム賞12-LR-237197によってサポートされています。 P. Daggumatiはサイエンス＆エンジニアリング（RISE）賞カリフォルニア州デービス·リサーチ·インベストメンツ大学によってサポートされています。 CAチャップマンは、ナショナルニードフェローシップの教育大学院援助分野の部門によってサポートされています。この作業は、UCラボ料研究プログラム、UCデービスのRISE、工学スタートアップ資金のカリフォルニア大学デ​​ービス校の大学によってサポートされていました。

1。ナノポーラス金の作製<ol><li>ピラニア溶液中のクリーン基板<ol><li>混合物をホットプレート上で65℃に結晶化皿および熱た100mlの硫酸（96％）を25ミリリットルの過酸化水素（30％）を追加します。注意：液体は極めて腐食性であり、慎重に取り扱わなければならない。それが爆発する可能性があるので使用済み溶液を、密封容器に保存されているべきではありません。 </li><li>混合耐酸性ピンセットを用いて、10分間のためにそれらをきれいに3インチ顕微鏡スライドによって場所の1インチ。小さなカバースリップをバッチ洗浄のために磁器の免疫染色のボートを使用します。溶液中に浸漬する前に30秒のために10 Wの空気プラズマの小さなカバースリップを扱う。 </li><li> 3分間脱イオン（DI）流水結晶皿にきれいにサンプルを洗浄します。糸くずの出ないタオルの上に窒素銃ブロー乾燥試料。 </li></ol></li><li> （：ミリスケールのパターンを作成するためにこれを使用方法1）ステンシルマスクを準備<ol><li>パンチ生検パンチと250μmの厚さのシリコーンエラストマーシートおよび/または半硬質プラスチック表面上にメスで地域を切開。窒素銃でイソプロパノール、乾燥70％で処理されたエラストマーシートを清掃してください。 </li><li>リントフリークリーンルームタオルの上にパンチングシートを置き、ステンシルが直面している試料表面とステンシルオーバーピラニア洗浄をカバースリップを合わせます。 </li></ol></li><li>パターンリフトオフレジスト（方法2：サブミリスケールのパターンを作成するために使用します） <ol><li>チャックを回転にピラニア洗浄を顕微鏡スライドを置き、窒素銃で任意の粒子を吹き飛ばす。プラスチックピペットを用いてスライドガラス上に接着促進剤（ヘキサメチルジシラザン）1.5mlを分注する。 5秒、30秒のために1,500 rpmで500rpmで連続的にスライドを回転することによりプロモーターを広める。 7分間115℃のホットプレート上でスライドを焼いて5分間冷ます。 </li><li>スライドガラス上にフォトレジスト4mlのディスペンス（3インチByは1インチ）。接着促進剤の場合と同じプロトコルを使用してスライドを回転させてレジストを広げた。 1.5分間115℃のホットプレート上にフォトレジストを焼くと10分間冷ます。 </li><li> 15秒のために透明マスクを介して：UV光でフォトレジストでコーティングされたスライド（22 MW / cm 2と強度）を公開します。 1.5分間、115℃のホットプレート上にフォトレジストを焼いて45分間待ちます。少なくとも3.5分間現像液に露光されたフォトレジストを溶解する。 DI水で十分に洗い流してください。光学顕微鏡下で開発されたパターンを点検します。 </li></ol></li><li> NP-Auの薄膜を製造するための前駆体の金属を堆積させる<ol><li>独立して、金、銀、クロムを預けることができるスパッタ装置にサンプルをロードします。金属蒸着を開始する前に、25トルアルゴン処理雰囲気下、50 Wで90秒間のサンプルをスパッタクリーン。 </li><li> 10トルアルゴン下300 Wで10分間クロームスパッタ。 400 W国連で90秒間金をスパッタファンデ10トルアルゴン。 100 W.で200 WおよびAuパワーで銀と10分間、金と銀は、金、銀をオフにする前にソース約10秒スパッタ源をスパッタ切り共同スパッタ。 </li></ol></li><li>前駆金属微細パターンを得る<ol><li> 20秒の超音波処理を10サイクルとサイクルの間に2分間の休止のためのフォトレジストストリッパーの〜180ミリリットルでフォトレジストでコーティングされたサンプルを超音波処理。 DI水でサンプルをすすぎ、窒素銃で乾燥させます。顕微鏡下で金属パターンを検査します。 </li><li>堆積した金属を明らかにするために2つのピンセットを使用して非フォトレジスト被覆された試料からの剥離性エラストマーステンシル。 </li></ol></li><li>熱処理経由Dealloy前駆金属および変更ナノ構造<ol><li>硝酸（70％）170 mlのを200mlガラスビーカーを記入し、ホットプレート上で55℃に液温を維持する。注意：硝酸は非常に腐食性であり、適切な保護具を処理する必要があります。 </lI&gt; <li>硝酸に浸漬する前に30秒のために10 Wの空気プラズマの小さなカバースリップを扱う。耐酸性ピンセットを用いてビーカーに置き、3インチ顕微鏡スライド1インチおよび15分のためにそれらをdealloy。バッチ脱合金小さなカバースリップ用磁器免疫染色のボートを使用してください。 </li><li>順次新鮮なDI水で三回充填2ビーカーにそれらを浸漬することによりdealloyedサンプルをリンス。少なくとも1週間DI水のサンプルを保存し、毎日新鮮なDI水で水を交換してください。使用前に糸くずの出ないタオルの上に窒素銃ブロー乾燥試料。 </li><li>急速加熱処理装置におけるクリーンシリコンウェハー上にサンプルをロードする。 200°Cと450°Cとランプ速度との間に温度を調節10℃/秒。窒素雰囲気下で10分間所定の温度にサンプルを公開します。チャンバーは冷ます（&lt;100℃）、サンプルを削除します。また、徐々に熱treatm用ホットプレート上のサンプルを配置ENT。 </li></ol></li></ol> 2。細胞培養<ol><li>細胞培養用NP-Auのサンプルを準備します<ol><li>ポリスチレンディッシュ内の場所NP-Auのサンプルを、30秒間10 Wで空気プラズマで処理し、24ウェル組織培養プレートにサンプルを移す。 </li><li>各ウェルに500μlの完全培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン/ストレプトマイシンを有する）を追加する。 37℃加湿インキュベーターに保管℃、細胞（&lt;1時間）播種まで5％CO 2。 </li></ol></li><li>維持するため、通路や種子細胞<ol><li>培地、細胞が70％コンフルエントである経過とともにT75フラスコ中で目的の細胞（この場合は3T3-NIH線維芽細胞又はマウスアストロサイト）を維持する。 </li><li>細胞を継代については、緩衝生理食塩水（PBS）を10mlのリン酸で二回洗い、フラスコからメディアを取り出し、細胞デタッチ（〜5分）まで、1×トリプシン/ EDTAとインキュベート2 mlを加える。 3ミリリットル新鮮な培地を追加し、3分間1,200 rpmで遠心。上清を吸引除去し、2 mlの培地中でペレットを中断します。 </li><li> 1ミリリットルの最終容量で25,000細胞/ cm 2の密度でカバーガラス上に井戸や種子細胞から過ごしたメディアを取り出します。サンプルの細胞の均一なコーティングを確保するために前進·バックと左右培養プレートを振る。毎日検査しながら分析まで細胞をインキュベート。 </li></ol></li></ol> 3。細胞と材料分析<ol><li>細胞骨格と核を可視化するために細胞を染色<ol><li>井戸から過ごしたメディアを取り出し、PBSで細胞を2回洗浄する。 15分間PBS中4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 </li><li> 1％ウシ血清アルブミンを含むPBSで300 nMのアレクサフルーア488ファロイジンの染色溶液を調製。 </li><li> PBSで細胞を2回洗浄し、5分間PBSでトリトンX-100を500μlの0.1％それらを透過性。 </li><li> PBSで細胞を2回洗浄し、井戸をきれいにするために、それらを転送します。しみ50 - サンプルと20分間、暗所で店舗へ200μlの染色液。 </li><li> PBSで5分間PBS中DAPIの3 Nmのカウンター染色で細胞を洗浄します。 </li><li> PBSで細胞を洗浄し、クリアなマニキュアで取り付けメディアやシールでガラスカバースライド上にマウントする前に脱イオン水に浸す。 </li></ol></li><li> NP-Auの表面にNP-Auのサンプルと、細胞培養物の画像を取得する<ol><li>画像NP-Auの二次電子検出器を使用して、10kVの電子エネルギーで50,000 Xの倍率で走査型電子顕微鏡（SEM）による表面。 </li><li>適切なフィルタキューブで10倍の倍率で倒立蛍光顕微鏡を用いてサンプル上の異なる箇所で複合セル画像をキャプチャします。 </li></ol></li><li>プロセスイメージは、毛穴や細胞形態を決定する<ol><li> ImageJのに該当する場合、個々のチャネルに分割オープン画像。 8ビットに画像を変換し、バックグラウンドを減算し、中央値filteriことによって、それらを滑らかにNG。手動または孔（ボイド）と細胞体/核を強調するためにアルゴリズムを閾値ビルトインによってしきい値を調整します。 </li><li>マージされた毛穴や細胞を分離するために流域コマンドを使用します。粒子解析パラメータを設定し、粒子による粒子、平均面積、およびパーセントカバレッジ数を抽出するためにコマンドを実行します。細胞計数およびパーセントセルカバレッジを定量化するためファロイジン染色細胞画像のDAPI染色細胞の画像を使用してください。 </li><li>複数の画像を一括分析を実行するために含まれたマクロファイルを変更する。 </li></ol></li></ol>

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著者は全く相反する経済的利害関係を持っていません。

私たちは、マイクロシステムと生物学的研究におけるこれらのフィルムの使用を拡大するため微細NP-Auの膜には、2つの異なる技術を実証する。スパッタコーティング、金と銀は、スパッタリング、従来の微細加工プロセスと合金組成と厚さを簡単に個々のスパッタ銃のパワーを変化させることにより制御（金と銀の目標のために）とすることができますとの互換性があるように、NP-Auのパターンを作成するための汎用性の高い方法であり、それぞれ堆積時間。典型的なNP-Au膜は200nmから2μmの範囲の厚さ。生検パンチとメスを使ってステンシル法（方法1、 図2a）は 、フォトリソグラフィのための必要性を回避するミリメートルスケールパターンを作成することができます。より複雑なパターンがプログラム可能なレーザーカッターにより製造することができる。ガラス表面上に準拠したシリコーンエラストマーステンシル自己付着し、それによってマスク及び増大パターン解像度の下に金属堆積を防止する。しかし、小さいFステンシルの厚さは、マスクの開口部を通して均一な金属堆積を防止するような特長（&lt;1 mm）は、典型的には、この方法で製造することが困難である。高...

<p class="jove_content"ナノスケール機能を持​​つ&gt;材料は、燃料電池を含む様々なアプリケーションを高めるのに約束を示している<sup&gt; 1</sup&gt;、センサー<sup&gt; 2,3</sup&gt;、および生物医学装置<sup&gt; 4,5</sup&gt;。比較的新しい材料は、ナノスケールの自己組織化プロセスによって製造されるナノ多孔質金（NP-Au）である。 NP-Auの前駆体は、最も一般的に原子百分率が60％〜80％の銀で構成され、金合金である。銀は強酸によって溶解されるように簡単に説明すると、特徴的な開孔ナノ構造は、クラスタ内の金原子の再配列の結果である（<em&gt;例えば</em&gt;硝酸70％）又は電気化学ポテンシャルの下<sup&gt; 6-8</sup&gt;。大きな有効面積、高い導電率、十分に確立された表面機能化技術、および生体適合性を含むいくつかの望ましい属性から、NP-金給付<sup&gt; 9</sup&gt;。 NP-Auの上の研究の急速な拡大、NP-auの機械的性質に焦点を当て、それらのほとんどがあったにもかかわらず、<sup&gt; 10,11</sup&gt;、触媒活性<sup&gt; 12</sup&gt;、そして生体分子センシング性能<sup&gt; 13-15</sup&gt;。望ましい属性は、いくつかの生物医学的なツールのために非常に有用であるが<sup&gt; 16,17</sup&gt;、この分野における用途が限られている。この理由の1つは、ほとんどの研究は、主にマクロスケール標本を使用している（<em&gt;例えば</em&gt;シート、ホイル、およびインゴット）と小型化システムでは、NP-Auのを組み込むための技術が不十分なままである。実際には、NP-Auの膜を用いる従来の微細加工技術の使用例のほんの一握りがある<sup&gt; 16-20</sup&gt;。小型化技術と新規生物医学ツールの必要性の出現と、それはデバイスに新しい材料を統合できるようにすることが重要になってきている。これは通常、材料が堆積され、従来の微細加工技術を用いてパターニングすることができることを必要とする。また、細胞 - 材料の相互作用の迅速な定量化は、新しい材料の生体適合性を評価するために一般に必要である。本研究の目的は、微細NP-Auの膜への基本的な技術を示し、ナノ構造体及びディジタル画像処理を介して、細胞 - 材料の相互作用の両方を定量化することである。</p

<table><tbody><tr><td>金ターゲット</td><td>レスカー</td><td>EJTAUXX403A2</td><td>np-Auを製造するための合金への前駆体</td></tr><tr><td>クロムターゲット</td><td>レスカー</td><td>EJTCRXX353A2</td><td>接着層</td></tr><tr><td>銀ターゲット</td><td>レスカー</td><td>EJTAGXX403A2</td><td>np-Au磁器ボートを製造するための合金への前駆体</td></tr><tr><td></td><td>トーマス・サイエンティフィック</td><td>8542E40</td><td>小さなサンプルを処理するために使用されます</td></tr><tr><td>硝酸</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>43873</td> 脱<td>合金化に70%で使用</td></tr> 硫酸 <tr><td></td><td>J.T.ベイカー</td><td>7664-93-9</td><td>ピラニアのクリーニングに96%で使用</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>J.T.ベイカー</td><td>7722-84-1</td><td>ピラニアのクリーニングに30%で使用</td></tr><tr><td>バイオプシーパンチ</td><td>テッド・ペラ</td><td>150xx</td><td>いくつかのサイズで利用可能</td></tr><tr><td>シリコーンエラストマーシート</td><td>ロジャースコーポレーション</td><td>HT 6240</td><td>いくつかの厚さで利用可能</td></tr><tr><td>ヘキサメチルジシラザン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440191-100ML</td><td>ポジレジストの接着促進剤として使用</td></tr><tr><td>Microposit MF CD26</td><td>Shipley</td><td>38490</td><td>ポジフォトレジスト現像液</td></tr><tr><td>PRS 3000</td><td>J.T Baker</td><td>JT6403-5</td><td>ポジフォトレジストストリッパー</td></tr><tr><td>円形ガラスカバースリップ (12 mm)</td><td>Ted Pella</td><td>26023</td><td>金属パターンおよび細胞培養の基板として使用</td></tr><tr><td>ガラススライド(1 x 3インチ)</td><td>テッドペラ</td><td>26007</td><td>金属パターンの基板として使用</td></tr><tr><td>カプトンポリイミドテープ</td><td>VWR</td><td>82030-950</td><td>エラストマーの固定に使用</td></tr><tr><td>透明マスク</td><td>出力都市</td><td></td><td>フォトリソグラフィー<a href="http://www.outputcity.com/" target="_blank">http://www.outputcity.com/</a></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー</td><td>ハリックプラズマ</td><td>PDC-32G</td><td>ガラス表面の活性化に使用</td></tr><tr><td>スパッタリングマシン</td><td>カート・J・レスカー</td><td>LAB18</td><td>金属の堆積に使用</td></tr></tbody></table>

物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

Microfabrication of Nanoporous Gold Patterns for Cell-material Interaction Studies

数十ナノメートルのフィーチャサイズを有するナノ構造材料は、燃料電池、バイオセンサー、生体医用器具​​用コーティング、および薬物送達ツールを含むいくつかの技術の性能を強化している。ナノスケールの自己組織化プロセスによって生成されたナノ多孔質金（NP-Auが）、大きな実効表面積、高い導電率、および触媒活性を示す比較的新しい材料である。これらのプロパティは、NP-Auのを科学界に魅力材料を作った。 NP-Auの上のほとんどの研究は、材料の基礎科学とその触媒とセンサアプリケーションにマクロスケール標本やフォーカスを採用しています。マクロスケール標本は生物医学デバイスを含む小型化システムにおけるNP-auの可能性を制限する。これらの問題に対処するために、我々は、最初に剛性基板上に微細パターンNP-Auの薄膜を2つの異なる方法が記載されている。最初の方法は、ミリスケールNP-Auのパターンを作成するための薬用手動生産ステンシルマスクを採用していますeは、第二の方法は、パターンのサブミリスケールパターンにリフトオフフォトリソグラフィーを使用しています。 NP-Auの薄膜をスパッタ堆積プロセスによって得られ、それらはマイクロへの容易な統合することにより適した従来の微細加工技術と互換性がある。これらのシステムは高い有効表面積の恩恵、電気伝導性、そして金 - チオール系表面バイオコンジュゲーションその電気的にアドレス可能なバイオセンサーのプラットフォームが含まれています。我々は、いくつかのバイオセンサーのための重要な性能パラメータである哺乳動物細胞でNP-Auからの対話を定量化するために、細胞培養、免疫染色し、画像処理技術を説明する。ここでは、図示の技法は、様々な長さスケールでのプラットフォームやバイオセンサー、エネルギー貯蔵システム、および触媒を含む多数の用途においてNP-Auを統合を支援することを期待している。

図1は 、培養細胞をNP-Auのパターンを作成するナノ構造を定量化し、細胞形態を特徴付ける含めて、主要な処理手順の概要を説明します。 図2aに示したエラストマーステンシル（上面）の下に画像に示すようにNP-Auのパターンを作成するために使用される。 図2bは、バッチ処理の試験片の磁器船の写真である。 図2cは、堆積された金属パターンの色変化を表示する前と後に脱合金。銀色仕上げ（脱合金の前）は銀の豊富な合金成分によるものです。脱合金の際、フィルムは目に見えて橙褐色の色合いを取得。 図2dは、金属のフォトリソグラフィパターニングによって生成された細かい機能を示しています。異なる孔形態は、 図3に示すようにNP-Auの膜9の熱処理により得ることができる。断面像（ 図URE 3）膜は、膜厚を介して均一にdealloyedあるかどうかを明らかにする。 SEM画像は、ボイド（ <strong...

私たちは、ステンシル印刷やフォトリソグラフィーと同様、微細パターン上に培養細胞へのメソッドを経由して微細パターンナノポーラス金薄膜の技術について報告する。また、材料及び走査型電子顕微鏡、蛍光技術を用いて培養細胞の形態を特徴づける画像解析方法が記載されている。

Nanostructured materials with feature sizes in tens of nanometers have enhanced the performance of several technologies, including fuel cells, biosensors, ...

本手順の全体的な目的は、ナノ多孔質金マイクロパターンを作製し、それが細胞培養に適していることを実証することです。まず、ステンシルマスクまたはフォトリソグラフィマスクを作成します。次に、これらのマスクを通して金と銀を共スパッタリングし、ナノ多孔質金の前駆体合金をパターニングします。次に、金銀合金パターンを硝酸で脱合金化し、ナノ多孔質金コーティングを作製します。最終ステップとして、ナノ多孔質金マイクロパターンの上に細胞を培養して免疫染色を行い、最終的に蛍光顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いた画像解析により、細胞と材料の相互作用を定量化します。カーボンナノチューブなどの他のナノ構造コーティング作製法に対する本手法の主な利点は、ナノ多孔質金がマイクロファブリケーションとの互換性、高い有効表面積、チオールベースの化学による機能化の容易さ、電気伝導性、および生体適合性を備えていることです。この手法により、材料のナノ構造が電気的、機械的、生物学的、および化学的特性に及ぼす影響など、材料科学やバイオエンジニアリング分野における重要な疑問を解決することができます。また、本手法はナノ構造が細胞形態に及ぼす影響についての知見を提供します。さらに、バイオセンサー、薬物送達システム、エネルギー貯蔵プラットフォームの開発など、他のシステムにも応用可能です。まず、1インチ×3インチの顕微鏡スライドと小型カバーガラスをピラニア溶液で洗浄します。小型カバーガラスを磁器製免疫染色用ボートに入れ、ボートと顕微鏡スライドをピラニア溶液に浸します。洗浄手順の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。洗浄後、サンプルを結晶化用ディッシュに移し、di waterで3分間すすぎます。サンプルをリントフリータオルの上に置き、窒素ガンで吹き付け乾燥させてミリメートルスケールのパターンを作成します。バイオプシーパンチを用いて、厚さ 250 micron のシリコンエラストマーシートに穴を開けます。処理したエラストマーシートを 70% isopropanol に浸して洗浄し、その後窒素ガンで乾燥させます。次に、パンチシートを糸くずの出ないタオルの上に置き、洗浄済みのカバーガラスを、サンプル面がステンシルに向くようにステンシルの上に合わせて配置します。サブミリメートルスケールのパターンを作成するため、カバーガラスを載せたステンシルをキャリアウェハー上に転写します。洗浄済みの顕微鏡スライドを回転チャックに設置し、窒素ガンで微粒子を吹き飛ばして除去します。1.5 millilitersのヘキサメチルジランをガラススライド上に分注します。プラスチックピペットを用いて、スライドをまず500 RPMで5秒間、次に1500 RPMで30秒間、順次回転させてヘキサメチルジランを広げます。完了後、ホットプレートを用いてスライドを115 degrees Celsiusで7分間加熱し、その後5分間冷却させます。次に、ポジ型フォトレジスト 4 mL をガラススライド上に分注します。前述の条件でスライドを回転させ、フォトレジストを広げます。ホットプレートを用いてスライドを115 °Cで1.5分間加熱し、UV照射および加熱後に取り出します。スライドをポジ型現像液に浸し、露光されたフォトレジストを溶解させます。レジストを少なくとも3.5分間現像します。完了後、スライドをDIウォーターで十分にすすぎ、光学顕微鏡下で現像されたパターンを確認します。次に、金、銀、クロムを独立してスパッタ成膜できるスパッタ装置にサンプルをロードします。金属堆積を開始する前に、25 millitorrのアルゴン処理雰囲気下、50 wattsで90秒間サンプルを洗浄します。続いて、10 millitorrのアルゴン・クロムスパッタを用いて、300 wattsで10分間堆積させます。その後、400 wattsで90秒間金をスパッタし、続いて金と銀を10分間共スパッタします。この際、銀を200 watts、金を100 wattsに設定してください。銀のスパッタ源をオフにする約10秒前に、金のスパッタ源をオフにします。スパッタリング装置からサンプルを取り出します。その後、約 180 milliliters のポジ型フォトレジスト剥離剤に入れ、2分間の休止を挟みながら、22秒間の超音波処理を10サイクル行います。完了後、サンプルを超純水で洗浄し、窒素ガンで乾燥させます。顕微鏡下で金属パターンを確認してください。次に、2本のピンセットを用いて、非フォトレジスト塗布サンプルからエラストマーステンシルを剥がし、堆積した金属を露出させます。小型カバーガラスを硝酸に浸す前に、10 Wで30秒間エアプラズマ処理します。顕微鏡スライドを55 °Cの70%硝酸が入ったビーカーに15分間浸漬させ、脱合金化を行います。脱合金化が完了した後、サンプルを超純水が入ったビーカーに3回繰り返し浸漬させて洗浄します。サンプルを糸くずの出ないタオルの上に置き、窒素ガンで乾燥させます。ホットプレートの温度を150〜300 °Cに調整します。その後、急激な温度変化を最小限に抑えるため、サンプルをゆっくりと加熱面に下ろします。5分後、サンプルをホットプレートから取り出して冷却します。ナノ多孔質金サンプルをポリスチレン皿に入れ、10 Wで30秒間エアープラズマ処理を行います。その後、サンプルを24ウェル組織培養プレートに移します。それぞれに完全培地を500 µL加えます。細胞を播種するまで、プレートを37 °C、5% CO2の加湿インキュベーターで保存します。マウスアストロサイト細胞は、T 75フラスコを用いて培地内で維持します。細胞が70%コンフルエントになったら、まず古い培地を除去し、PBSで細胞を洗浄して継代します。継代条件の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。インキュベーターから培養プレートを取り出した後、ウェルから使用済みの培地を吸引し、細胞をガラス上に播種します。カバーガラスに1平方センチメートルあたり25,000個の細胞密度で、最終容量1mLとなるように播種します。細胞がサンプル全体に均一にコーティングされるようカルチャープレートを振盪し、解析の準備が整い次第、プレートをインキュベーターに入れます。ウェルから使用済みの培地を除去し、PBSで2回洗浄します。細胞をPBS中の4%パラホルムアルデヒドで固定し、2回洗浄した後、PBS中の0.1% Triton X 100を500 µL加え、5分間透過処理を行います。PBSでの洗浄を2回繰り返し、細胞をきれいなウェルに移します。80 µLの染色液をサンプルに滴下し、アルミホイルで遮光して20分間静置します。再度PBSで洗浄した後、3 nMのDPI含有PBSを用いて細胞を5分間対比染色します。細胞をもう一度PBSで洗浄し、ダイキャンフォーに浸した後、細胞をガラスに封入します。スライドを封入剤で覆い、透明なマニキュアで密封してください。二次電子検出器を用い、加速電圧 10 kilovolts、倍率 50,000 x の走査電子顕微鏡でナノ多孔質金表面を観察します。その後、適切なフィルターキューブを備えた倒立蛍光顕微鏡を用い、倍率 10 x でサンプル上の異なる箇所の複合細胞画像をキャプチャします。ImageJで画像を開き、画像を個別のチャンネルに分割します。これらを8ビットに変換します。背景を減算し、メディアンフィルタリングによって平滑化します。その後、しきい値を手動で調整し、孔、細胞体、および核を強調します。watershedコマンドを使用して、結合したポアまたは細胞を分離させます。粒子解析パラメータを設定し、コマンドを実行して、粒子数、平均面積、および粒子による被覆率を抽出します。最後に、同梱のマクロファイルを修正して、複数の画像のバッチ解析を行います。合金化前後の堆積金属パターンの色の変化がここに示されています。銀色の仕上げは、合金化によって銀に富む合金成分が生じたことによるものです。膜は視覚的にオレンジブラウンの色調を帯びます。ここでは、フォトリソグラフィによって作製された微細構造を示しています。金属のパターニングです。ナノポーラス金膜への熱処理により、さまざまな不良形態が得られる可能性があります。断面画像により、膜の厚さ方向を通して脱合金化が均一に行われているかを確認できます。走査電子顕微鏡画像は、空隙のサイズと被覆率を決定するためにバイナリ画像にセグメント化することが可能です。この出力を生成するためのコードは、JoVEのウェブページからダウンロードできます。ナノ多孔質金表面で培養された接着性マウスアストロサイト細胞の代表的な蛍光画像がここに示されています。画像の個々のチャンネルを分割およびセグメンテーションすることで、細胞と材料の相互作用を分析するためのバイナリ画像を生成できます。セグメンテーションされた細胞骨格画像は、細胞面積および表面被覆率の定量化に使用できます。分節化された細胞核画像は細胞計数に有用です。これらの出力を生成するためのコードは、JoVEのウェブページからダウンロードできます。ここでは、POフィルムの密着不良、多孔性の欠如、および過剰な熱処理を含む、ナノ多孔質金構造の作製における失敗の視覚的なまとめを示します。本手順に続き、ナノ構造による細胞接着の影響や遺伝子発現などのさらなる疑問を解消するために、電気化学的特性評価、森林顕微鏡観察、細胞溶解、およびPCRなどの他の手法を提案します。このビデオを視聴することで、ナノポア金パターンの作製方法と、顕微鏡画像のデジタル画像解析による細胞との相互作用の定量化について十分な理解が得られるはずです。結果について。硝酸、硫酸、および過酸化水素を用いた操作は極めて危険であるため、本手順の実施中は、適切な個人用保護具の着用を含む予防措置を常に講じてください。

microfabrication-nanoporous-gold-patterns-for-cell-material

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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ここでは、グラデーションによるナノパターン板の熱ナノイン...

熱ナノイン プリント技術とヒトの内皮細胞コロニー形成細胞の応答のスクリーニングによるグラデーションによるナノパターンの作製

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頂いたディウェッティング経由で制御可能なカスタマイズ可能な金ナノ粒子の大面積基板を用いたナノ加工

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学ぶナノ多孔性金薄膜の微細加工法と細胞培養への応用。ステンシル印刷やフォトリソグラフィーを用いたパターン形成と脱合金化プロセスを解説し、蛍光顕微鏡による細胞・材料相互作用の定量的解析手法を紹介する。

物質 - 細胞相互作用研究ナノポーラス金パターンの微細加工

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