自動3D追跡システムを使用して、成魚のゼブラフィッシュの個体群と群れを記録

本手順の目的は、ゼブラフィッシュやその他の水生動物の三次元的な移動パターンを調査し、その運動学的、空間的、および社会的な特性を解析することです。これにより、遺伝子変異や化学的・環境的要因による行動の変化を検出することが可能になります。これは、まずシステムのキャリブレーションを行うことで達成され、同時に屈折によって生じる大きな画像歪みの補正も行われます。

第2のステップは、少なくとも2つの異なる角度から、比較的高い時間分解能でビデオフレームを同時に記録することです。次に、ソフトウェアが魚の軌跡を再構築します。ノイズの影響を軽減し、遮蔽や密集が発生した際の魚の位置を推定するために、高度なアルゴリズムが適用されます。

最終ステップは、データを解析し、速度、加速度、回転角、観察容器内における水平および垂直方向の分布、個体間距離、およびその他の関心のあるパラメータについて統計解析を行うことです。最終的に、キャリブレーション済みの高速3Dトラッキングは、変異ゼブラフィッシュにおける行動欠損や、さまざまな行動系に対する薬剤の効果を研究するのに有用です。創薬において、本システムの利点の一つは、魚の行動を3Dで研究できることです。

魚類は自然に3次元的に移動するため、複数の個体を同時に記録する場合、群れの空間構成を調査する際に2D記録では非常に誤解を招く可能性があります。このシステムのもう一つの利点は、光の屈折を補正できることです。現在の構成において、屈折を補正しないままだと、重大な測定誤差が生じる可能性があります。ゼブラフィッシュを入れた観察容器を観察チャンバー内に配置します。

チャンバー内には、カメラ、容器の上方約45度の角度で吊り下げられたミラー、およびLEDライトバーも設置されています。記録を開始する前に、システムのキャリブレーションを行い、容器の壁面と水面の位置、および記録フレームのスケーリング係数を決定するとともに、光が水から空気へ透過する際に生じる屈折による誤差を補正します。キャリブレーションが完了したら、ダミーフィッシュを用いてテストランを実施してください。

ミラーまたはカメラの位置がずれている場合や、トラッキングに問題がある場合は、再キャリブレーションを行う必要があります。録画セッションを開始するには、標線まで水を満たした観察容器を観察室に配置します。容器の脚をアライメント穴に挿入してください。

容器の半透明または不透明な壁面が、カメラから見て奥側と右側に向くように配置します。次に、コンパートメント内の照明を点灯させ、魚を容器に入れてカーテンを閉じます。録画モジュールを開くと、容器の正面および上面の画像が画面に表示されます。

最初に取得した画像が理想的でない場合があり、魚と背景の間に十分なコントラストを得るために調整が必要なことがあります。画像を調整するには、「camera control」を選択し、表示された一般設定ウィンドウでここに示すボックスの選択を解除します。その後、画像が露出オーバーにならないようにシャッタースピードとゲインを調整してください。次に、カメラコントロールウィンドウの左側で「white balance color」を選択し、新しいウィンドウで「auto」ボックスの選択を解除して、正面および上面の両方のビューで最適な色コントラストが得られるように赤と青の値を調整します。

調整完了後、さらに複数回の調整が必要になる場合があります。録画モジュールのメインメニューから「データ保存先」を選択し、フォルダを作成または選択してください。各録画には専用のフォルダを用意し、それを実験フォルダのサブフォルダとして作成してください。

次に、「start recording」を押し、録画時間（分）を整数で入力して「okay」を押すと、実験の録画セッションが開始されます。録画が完了したら、キャリブレーションフォルダから「animal container data」および「correspondence data」サブフォルダを、事前に作成した「During recording」フォルダにコピー＆ペーストして、パスの再構築を開始します。その後、ソフトウェアの軌跡（trajectory）モジュールを開き、「data location」を押して、録画モジュールで作成したフォルダを選択してください。

次に、システムセットアップボタンを押してパラメータウィンドウを開き、まずtop end bottom viewのカラーしきい値を調整します。推奨される初期値は1000です。次に、top end bottom viewのサイズしきい値を選択します。

中型のゼブラフィッシュの場合、開始サイズは10が適切ですが、大型の魚では20、小型の魚では5を使用してください。これらのしきい値を高く設定するほど、ソフトウェアがノイズを拾う可能性は低くなります。しかし、値が高すぎると、魚を検出できなくなる可能性があります。

実験の後半で、これらのしきい値を再調整する必要が生じる場合があります。最大サイズしきい値については、通常3000という値で十分です。また、特定長については、プリセット値の220を維持してください。

「fish」の数は、観察タンク内の魚の数を指します。「Max numb of points」は総フレーム数を指します。この数値を記録または記憶し、「Okay」を押してください。次に、「acquire background」を選択します。

次のウィンドウで、「from」と「to」の2つのフィールドへの入力が求められます。背景が読み込まれた後、マウスを使用して3つの赤いボックスを調整してください。これらのボックスは、ソフトウェアが魚を探索する領域を示しています。左側のボックスを最小限にしてください。

側面図はキャリブレーションにのみ使用されるため、ここで「軌道生成開始（start generating trajectories）」ボタンを押すと、経路再構成が始まります。理想的には、タグは魚の画像上に配置されるべきですが、頻繁に誤った位置に配置される場合は、情報ウィンドウを開いてください。ここでは、魚の輪郭のみが見える理想的な例を示しています。

ノイズが過剰な場合は、メインメニューのストップを押し、色とサイズの閾値を新たに設定してください。また、赤いボックスをわずかに縮小できるか確認してください。例えば、上部において水の動きによって発生するノイズを除外するために、3D画面上の軌跡を確認してください。

マウスを右クリックすることで、研究者は3D構成の回転と平行移動を選択できます。データ処理を開始するには、データ処理モジュールを開き、ツールバーの「project」を選択し、プルダウンメニューから「new」を選択して実験名を入力します。次に、「edit project」を選択します。

次に、「プロジェクトに追加」を選択し、続いて「新規グループ」を選択して、実験グループの名前を入力します。次に、右側のウィンドウでその実験グループを選択します。ツールバーが変更されることに注意してください。

「edit group」を選択し、「add to group」を追加した後、「new measurements」を選択します。これにより、ブラウザウィンドウが開きます。次に、録画中に作成されたフォルダを開き、「trajectories」サブフォルダを選択して、ポイント平滑化済みファイルを選択してください。

ここでのグループAの例では6つのファイルが、グループBでは4つのファイルが読み込まれました。解析を開始するには、右側のウィンドウでポイント平滑化済みファイルを選択してください。次に、プルダウンメニューから「データ処理」および「シングルバリューエンドポイント」を選択します。

例として、「duration freezing」を選択してください。速度閾値および期間閾値によるフリージングを指定するウィンドウが開きますので、プログラムの操作に慣れてください。また、「travel distance depth distribution」などの他の例も試してください。ここでは、深度レベルの数とバースト周波数を決定させることができます。

このオプションを選択すると、デフォルトの閾値を用いたバッチ処理が行われ、約200個のエンドポイントが計算されます。デフォルトとは、デリミタが設定されていることを意味します。例えば、現在は3つの深度レベルで深度分布が計算され、4つのセクションで角度分布が計算されています。

パラメータを生成すると、作成するファイルの保存場所とファイル名を確認する新しいウィンドウが開きます。これらのファイルはCSV形式で保存され、他のソフトウェアにインポートすることが可能です。ここでは、図Aにコントロールの典型的な例となるフレームを示します。

図Aはゼブラフィッシュを示し、図BはMK 801で処理したゼブラフィッシュの典型的な例となるフレームを示しており、いずれも午前のセッション中に記録されたものである。対照群のゼブラフィッシュは底付近に集まって泳いでいたことに注目されたい。対照的に、MK 801投与群のゼブラフィッシュは水面付近に位置し、互いにかなりの距離を置いて泳いでいた。

ここでは、対照群のゼブラフィッシュと10 µMのMK 801で処理したゼブラフィッシュの代表的な2つの軌跡を、午前セッションと午後セッションについて示します。この図では、対照群と10 µMのMK 801で処理した魚の平均社会的距離を両セッションについて提示しており、また、両群における個体間平均距離のタイムラインを示しています。

図Aでは、午前中のセッションにおけるゼブラフィッシュの10段階の等深度レベルにおける分布が示されており、Bでは、午後のセッションにおける分布が示されています。ここでは、実験群の4つの放射状ゾーンにおける時間的分布が示されています。挿入図は、中心から外周に向かうこれらのゾーンの位置を示しており、ここでは、実験群の4つの象限における時間的分布が示されています。

挿入図は各クアドラントの位置を示しています。二重線は白い壁を、一本線は透明な壁を表しています。カメラは挿入図の左側、つまりクアドラント1および4に最も近い位置に配置されています。

黒いアスタリスクは午前セッションのグループ間の比較を、グレーのアスタリスクは午後セッションのグループ間の比較を示しています。最後に、午前および午後セッションにおけるゼブラフィッシュの移動距離のX、Y、Z成分をここに示します。平均値および標準誤差（SEM）を提示します。

本システムを使用する際は、データの精度は記録の質に依存するため、システムのキャリブレーションが適切に行われ、カメラ設定が最適であることを確認してください。それ以外の操作は簡単であり、各手順に慣れるだけで十分です。