エレクトロ作成のための迅速なプロトコルエシェリヒア·コリとコレラ菌

この手順の全体的な目標は、同じ日に有能な細菌を迅速かつ便利に生成することです。彼らは変革に必要です。これは、最初に細菌をLB寒天に播種し、4〜6時間インキュベートすることによって達成されます。

次に、寒天の表面から細菌の芝生を慎重に収穫し、ペレットを滅菌冷水または緩衝液に再懸濁します。次に、バクテリアペレットを摂氏4度で3回洗浄し、40マイクロリットルに再懸濁します。最後に、コンピテントセルをDNAの存在下でエレクトロポレーションします。

最終的には、かなりの機器、大量の細菌培養物、および滅菌バッファーを必要とする従来の方法を使用して得られたものに匹敵する細菌形質転換のレベルを示す結果を得ることができます。既存の方法に対するこの技術の主な利点は、新鮮で有能な細菌を、大きな遠心分離機、ローター、または滅菌緩衝液および培養のリーダーを必要とせずに、形質転換が計画される同じ日に任意の実験室株から仮想的に調製できることである。このプロトコルの創始者は、長年にわたって多くの研究者によって使用され、最適化されてきたため、特定することはできません。

ここで紹介した方法は、20年近くにわたって私たちの研究室で使用されており、この有用なプロトコルを仲間と共有することが私たちの目標です。この手法の視覚的なデモンストレーションは、1つのステップで重要です。特に、オーガー上の芝生からのバクテリアの収集は、プレート上の成長を評価するために経験の目が必要だからです。

そして、これは最もよく視覚化されます。その手順を実演しているのは、カナダのエドモントンにあるアルバータ大学のテ・コスキ博士の研究室の研究助手であるテレサ・ブルックスさんです。午後遅くに細菌培養の準備を開始するには、少量の大腸菌またはVコレイを使用して、滅菌ケイ酸ガラス試験管に1〜5ミリリットルのオートクレーブLBブロスを接種します。

接種した試験管をローラードラムにセットし、摂氏37度で一晩高速にインキュベートします。ガラス棒からホッケースティックの形をしたセルスプレッダーを準備し、ブンゼンバーナーの炎でロッドの中央をガラスが柔らかくなるまで加熱します。次に、ピンセットまたはペンチを使用して、ベンドを135度の角度にそっと向けます。

ロッドの端と最初の曲げの中間点でもう一度加熱し、内側に45度の角度で曲げます。抗生物質の有無にかかわらずlbエアレーションを調製し、摂氏4度で保存します。翌朝。

100マイクロリットルの一晩培養物を各LB寒天プレートにプレートします。セルスプレッダーを使用して、プレートを摂氏37度で4〜6時間、または細菌の増殖の薄い芝生が見えるまでインキュベートします。接種ループを使用して、プレートから直径約2ミリメートルの細菌塊を採取し、1ミリリットルの氷冷に懸濁します。

2ミリモルの塩化カルシウム。4°Cに冷やされた遠心分離機を使用して大腸菌のためのv corayか生殖不能の二重蒸留水を使用する場合、5、000 Gs.Discardで5分間懸濁液を回し、上清を捨て、洗浄を二回繰り返す。最終的な上清を取り除いた後、ペレットを40マイクロリットルの塩化カルシウムまたは二重蒸留水に懸濁し、氷上に保ちます。

形質転換を行うには、40マイクロリットルの細菌懸濁液に最大1マイクログラムの血漿DNAを加え、混合物を予め冷却した滅菌0.2センチメートルのギャップに移します。Vete、Veteをパルス制御モジュールのエレクトロポレーションチャンバーに挿入し、1.8キロボルトと25マイクロphで食べました。時定数は約 5.0 ミリ秒で、アーク放電は発生しません。

細胞を1ミリリットルのLBブロスに素早く再懸濁し、以前にオートクレーブしたブロイルガラス試験管に移します。抗生物質を選択せずに、37°Cの通気増殖条件下で30分間インキュベートすることにより、細胞を回復させます。細菌を抗生物質でLBエイジャープレートにプレートし、摂氏37度で一晩インキュベートします。

ここに示すように、大腸菌とV coアレイを使用して一連の形質転換を実施し、迅速な方法論の形質転換効率を、doerらが最初に電気コンピテントバクテリアの調製のために説明した従来の方法の適応と比較しました。形質転換体の収率は、大腸菌およびv corayの3回の複製実験において、DNAのマイクログラム当たりの6番目から7番目のCFUの10から10の範囲内でした。従来の方法を使用してエレクトロコンピテンスを行います。

細胞調製、形質転換物の収量は、迅速な方法を使用して大腸菌およびvコレイの3回の反復実験でDNAのマイクログラムあたり10〜10、5〜6CFUに10倍に減少したように見えました。このため、形質転換されたCFUを、他の点では同一のコンピテントセルのバッチからの模擬形質転換から回収されたCFUの数で割ることにより、形質転換細菌の割合を決定しました。形質転換細菌の割合は1ログ以内でした。

調製方法や変形した種に関係なく。これらの結果は、迅速法の効率が、コンピテントセルを調製する従来のより長い手順の効率に匹敵し、ieo、coray、およびesia coliの代表的な菌株が同様に迅速な手順に適していることを示唆しています。マスターすると、このテクニックは5〜6時間以内に実行でき、適切に実行できます。

この手順を試行する際には、増殖の対数期に細菌を採取し、滅菌済みの新たに調製した事前に冷却した緩衝水溶液で洗浄し、エレクトロポレーションを過ぎてLBに再懸濁するまで冷たく保つことを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、最初の芝生で培養し、成長の対数期に収集し、エレクトロポレーションの準備としてコールドバッファーで洗浄することにより、研究室でエレクトロコンピテント細菌株特異的細胞を迅速に生成する方法についてよく理解できるはずです。