DNAのライゲーション反応

ライゲーションは結合する行為と定義でき、生物学では、この用語は2つの生体分子を共有結合で結合する酵素反応を指します。このビデオでは、分子生物学研究におけるDNAライゲーションの応用について説明しています。

細胞内では、DNAリガーゼは、DNA骨格の3?-ヒドロキシル基と5?-リン酸基との間のホスホジエステル結合の形成を触媒することにより、DNAの切断を同定し、封鎖する酵素です。 ライゲーションは、DNA複製などの正常な細胞プロセスの一部として起こり、一本鎖および二本鎖DNAの切断を修復します。

研究室では、DNAリガーゼは、エンドヌクレアーゼで消化されたDNA断片またはインサートをプラスミドなどのエンドヌクレアーゼ消化ベクターと結合して、フラグメントを宿主細胞に導入して複製するプロセスである分子クローニングで日常的に使用されています。

エンドヌクレアーゼの消化には、制限エンドヌクレアーゼ、または制限酵素の使用が含まれ、DNAの特定のストレッチにニックを作成します。

これらのニックは、3を生成する1本のストランドの切れ目に似ていることができますか?そして5?スティッキーエンドと呼ばれるオーバーハング、またはオーバーハングのない二本鎖ブレーク、ブラントエンドと呼ばれます。粘着性末端をライゲーションすることは、相補的な張り出した塩基対が反応を安定させるため、有利です。平滑末端ライゲーションには相補的な塩基対がないため、ライゲーションの効率が悪くなり、酵素が末端を結合するのが難しくなります。 粘着性のある鈍い端部は、通常の状況では一緒に結紮することはできません。

しかし、DNAポリメラーゼ1の産物であるクレノウ断片をサブチリシンで消化すると、粘着性末端を鈍末端に変換することができます。クレノウは3つ持っていますか?5に?3を噛み砕くエキソヌクレアーゼ活性?オーバーハングおよびポリメラーゼ活性は、3を延長することにより5のオーバーハングを鈍くしますか?相補的なストランドの終わり。

プラスミドに遺伝子を挿入することが目標である場合、セルフライゲーションと呼ばれるベクターDNAの再封鎖は、ライゲーション反応の一般的な望ましくない結果です。消化後のベクターDNAのアルカリホスファターゼ処理は、両端の5つのリン酸塩を除去し、この望ましくない結果を防ぎます。

前述したように、ベクターDNAとインサートDNAは、ライゲーションを開始する前にエンドヌクレアーゼで消化されます。消化されたベクターとインサートのゲル精製に続いて、DNA濃度を分光光度計で測定し、精製されたベクターとインサートの濃度を決定します。

この濃度から、1μl中のインサートまたはベクターの分子数は、DNA塩基対の平均分子量および各フラグメント中の塩基対の数に基づいて決定することができる。計算されたベクターとインサートの分子濃度に基づいて、インサートとベクターの3対1の比率が計算され、反応に使用されるベクターとインサートの量が決定されます。このDNAインサートとベクターの比率が3対1であることは、インサートがベクターにライゲーションされる確率とベクターライゲーション自体の確率が高まるため、望ましいものです。

反応に使用するベクターと挿入DNAの量を決定したので、氷上でのライゲーション反応の設定に進みます。マイクロフュージチューブにどの反応成分を添加するかの順番は、以下の通りです:最終容量10 μlを作るのに十分な滅菌水、この場合は、4 μl、10X 10Xライゲーションバッファー、1 μl 10mMのATP、1 μlのベクター、3 μlのインサートDNAを使用します。 計算されたとおりに、そして最終的に1μlのDNAリガーゼ。反応物を十分に混合し、遠心分離し、適切な温度でインキュベートします。

粘着性のある末端結紮を行うのか、鈍い末端結紮を行うのかは、ライゲーション反応の温度と持続時間に影響します。例えば、6塩基対のオーバーハングを有する粘着性末端ライゲーションは、相補末端がフラグメントの結合を安定化するため、室温付近で約1時間実施できます。短いオーバーハングまたは鈍いエンドライゲーションは、14〜20回の間に実行する必要がありますか?C一晩。

ライゲーション反応の設定方法を学んだところで、この手順の応用例をいくつか見てみましょう。

ライゲーションは、PCR増幅されたフラグメントを直鎖状プラスミドに直接挿入するために使用できます。ここでは、研究者が凍結マウスの脳のサンプルを採取し、そこからゲノムDNAを分離し、PCRベースのメチル化DNA検出方法であるバイサルファイトPCRにかけている様子が見られます。その後、PCR産物はプラスミドに直接ライゲーションされ、その特定の脳領域でメチル化される遺伝子のライブラリーが作成されます。

ライゲーションは、PCRプライマーの結合部位を含むオリゴヌクレオチドリンカーを結合させ、DNA断片を精製するために使用することができます。腫瘍サンプルを扱う場合、科学者はこのアプローチを使用して腫瘍ゲノムDNAの配列を決定し、腫瘍の原因となる突然変異を特定することを期待できます。

このビデオでは、ホルムアルデヒド固定細胞から単離されたDNAに対してライゲーションを行い、その後、ビオチンの存在下で制限酵素とklenowで処理し、ライゲーションされたDNAを引き下げます。次に、このDNAをPCRを使用して増幅し、示されているようにさまざまなスケールでクロマチン相互作用を同定するために配列決定された製品。

ここまでで、DNAリガーゼ、研究室でのライゲーションの設定に関連するさまざまな原理、潜在的な問題と解決策、分子生物学研究におけるライゲーションのさまざまな応用について学びました。ご覧いただきありがとうございます。