ゴルジコックス染色で樹状形態とシナプス接続に関するポジティブ初期の経験、触覚刺激の効果を可視化する

この手順の全体的な目的は、ゴールドG Cox染色法を用いて、生後早期の触覚刺激に伴うニューロンの形態学的変化を可視化することです。まず、生後3日から生後21日まで、1日3回の触覚刺激を行います。次に、調査対象の年齢に達した動物を灌流し、脳をゴールドG Cox溶液に保存します。

次に、Aomeを用いて脳をスライスします。最後のステップは、GOGI共染色法を用いて脳を浸漬させることです。最終的に、GOGI共染色の手順によって個々のニューロンを可視化し、形態学的変化の解析を可能にします。

Goy Cox法の優れた点は、ニューロンの構造を定量化し、それを行動結果と相関させることができることです。触覚刺激がこれらの疾患における行動的および解剖学的な回復の両方に有効であることが示されているため、この手法の意義は発達障害にまで及びます。本手法はラットの神経解剖学的な知見を提供できるだけでなく、他のモデル生物やヒトの脳組織にも適用可能です。

経験依存性可塑性の理解を深めるため、動物は出生後、食物と水に自由にアクセスできる状態で12時間の明暗サイクルで飼育されます。雌ラットはそれぞれの子孫と共に個別に飼育されます。ハンドリングに関連する追加のストレスを避けるため、幼仔にはP3から触覚刺激を与えます。

午前中の触覚刺激セッションの前に幼仔の体重を測定した後、幼仔をホームケージに入れたまま別の試験室に移動させます。ホームケージを24°Cに設定したヒーティングパッドの上に置きます。触覚刺激の準備ができたら、母仔を分離し、母ラットを餌と水を入れた一時的なケージに移します。

ダムと一時的なケージを繁殖室に置いたままにします。次に、硬いボードを使用してホームケージを二等分します。その後、各リターのパピーの半分をランダムに選び、触覚刺激を与える群とし、残りの半分を対照群として割り当てます。

グループを区別するために、永久マーカーで後肢と尾に印を付け、触覚刺激群の子ラットをケージの一方に、対照群の子ラットをもう一方に配置します。タイマーを15分に設定し、柔らかい羽ぼうきのようなダスターを使用します。触覚刺激群のすべての子ラットを、同時に15分間連続してブラッシングします。

幼いラットの仔は通常、互いに寄り添って深い睡眠サイクルに入っているように見えるため、すべての仔を一度に刺激することが非常に容易です。仔が成長するにつれて活動的になり、歩き回って探索する個体も現れます。セッション中は、各仔に均等な刺激が与えられるよう、歩き回っている仔をグループに戻してください。

15分間の触覚刺激の後、母親をケージに戻し、ケージを繁殖室へ運搬します。この工程を1日3回繰り返します。最後の触覚刺激セッションから19日後、仔ラットを母親から離乳させます。離乳させた仔ラットは、同性の離乳個体5〜6匹と共にケージで飼育し、調査対象の年齢に達するまで標準的な飼育条件下でそのまま維持します。

動物が100日齢に達した時点でサンプルを採取します。安楽死および心内灌流の後、脳を摘出します。その際、小脳を損傷しないよう注意してください。

脳を20 millilitersのGoldy Cox溶液を満たした不透明なNalgeneボトルに入れ、14日間保持します。14日後、溶液を30% sucrose溶液に交換します。切片作成を行う前に、脳をsucrose溶液に2〜5日間浸漬させます。

脳を切断ステージにSanoアクリル接着剤で固定する前に、吸水紙などで水分を拭き取ってください。これは組織の破れや切断面の不均一を防ぐためであり、脳全体がステージにしっかりと固定されていることを確認してください。次に、Vibramのリザーバーに6% sucrose溶液を、切断刃が浸るまで満たします。Vibramの速度と振幅を5に設定してください。

脳を200 micronの厚さで切片し、2%ゼラチンコートした顕微鏡スライドグラス上に配置します。目的の切片をすべて回収し終えるまで、切片が乾燥しないように注意してください。湿らせたろ紙で軽く押さえ、切片をスライドグラスに密着させます。

スライドをスライドラックにセットし、加湿チャンバー内で少なくとも12時間、最大4日間まで保管します。染色手順を開始するために、12枚のガラス染色皿にラベルを貼り、準備します。まず、スライドを蒸留水に1分間浸します。

次に、スライドを水酸化アンモニウムに入れ、暗所で30分間保持します。蒸留水でさらに1分間洗浄した後、遮光した状態でKodak Fixに30分間浸します。スライドを再度蒸留水に入れ、その後、段階的なエタノール系列溶液で脱水します。

最後のアルコール洗浄後、スライドを1/3溶液に15分間浸します。最後に、スライドをhemo Dに15分間浸します。準備が整ったら、パラマウントを用いてスライドにカバーガラスを被せ、顕微鏡で観察する前に空中で乾燥させます。

発達期に触覚刺激を受けたラットの、Golgi Cox染色された傍中間ニューロンの代表的な写真です。拡大写真では、末端樹状突起上の樹状突起スパインが示されています。左側の明るい画像は対照群のラットのものであり、右側の暗い画像は触覚刺激を受けたラットのものです。

このグラフは、発達期に触覚刺激を受けた成体ラットと受けていない成体ラットのCG3領域におけるニューロンの平均的な頂端および基底樹状突起の複雑性を示しています。この手順に従うことで、追加の疑問が生じた場合に、脳全体を染色しているため、同じ脳組織に戻ってそれらの疑問を解消できるという利点があります。これらの手法を開発したことで、頭部外傷やその他の形態の神経学的損傷に対する治療法としての触覚刺激の有用性を、発達後に研究者が探索するための道が開かれました。

この手法は、脳外傷や発達障害の改善における可能性を探索するための神経科学研究に道を切り開きました。このビデオを視聴することで、パピーに触覚刺激という豊かな体験を提供する方法と、個々のニューロンおよびシナプスを可視化する方法について、十分に理解できるはずです。