Name: 顔面移植アフリカツメガエル胚 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶ顔面組織移植法を用いたXenopus laevis胚の頭顔面発生研究。この手法により、発生生物学におけるシグナル伝達と遺伝的背景の影響を詳細に解析できます。

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私たちは、カエルの飼育および胚の準備を支援するために彼の助けのためのラデクSindelka、およびCAS Bresillaに感謝します。この作品は、HLSローラ·Jacoxに付与R01DE021109を経由して、NIHによって資金を供給されたが、ハーバード大学のハーシェル·スミス大学院フェローシップとF30の個々のフェローシップ助成F30DE022989-01 NIDCRを通してによって資金を供給された。

1。試薬の調製<ol><li> 10倍のMBS：バース生理食塩水（MBS）溶液17修正10倍の1リットルを準備します。 表1、試薬、成分、および手順を参照してください。すべてのソリューションのために、蒸留水を使用してください。完全に溶解するまで、撹拌棒を使用して、ビーカーに混ぜる。すべての溶液は室温でなされるべきである。 </li><li> 1X MBS：1X MBS 1リットルを作るために蒸留水900ミリリットルに100ミリリットル10倍のMBS溶液を希釈。 1 M CaCl 2溶液の0.7ミリリットルを追加します。 </li><li> 0.1×MBS：希釈1×MBS 0.5×MBS溶液および0.1×MBS溶液の2 LのL 1を調製する。 0.1×MBS溶液1リットルに、10 mg / mlのゲンタマイシン溶液1mlを加える。ゲンタマイシンと0.1×MBS溶液は、長期間の胚の培養に使用される。 </li><li>フィコール/ MBSは：0.5×MBS溶液500mlにフィコール400の15グラムを追加します。積極的に混ぜる。攪拌棒を追加し、フィコールが完全に（数時間）に溶解するまで混合する。 </li><li> 70％エタノール：70％エタノール、100％エタノールを用いて希釈する蒸留水。 </li></ol> 2。ガラス営業ツールの準備<ol><li>針の準備：ニードルプラーにキャピラリーチューブをロードします。 <ol><li>ニードルプラー設定： 表2に示されている設定に応じて針を引っ張る。特定の試薬や機器の表で説明するように設定は、サターInstrument社モデルP-80/PCマイクロピペットプラーとキャピラリーチューブのためのものです。しかし、これらの設定はサター針プラーに固有であり、他のマシンのために調整する必要があります。マシンの製造業者によって指定された設定は、ランプ試験を用いて決定することができる。 </li><li>手続きの準備のために4〜6針を引っ張る。針は通常、長い2〜3ミリメートルである、ガラスチップの柔軟な、髪の毛のような部分が完全に除去されるように分割する必要があります。先端部は比較的硬質であるが、切削工具として使用するのに十分に狭い静止しなければならない。 図1Aに理想的な針の写真を参照してください。 </李&gt; <li>中央下に粘土のストリップとペトリ皿に針を保管してください。所定の位置に保持するようにして離れて底部及び側部からの脆弱な鋭い先端を保つために、粘土に各針のシャフトを押してください。 </li></ol></li><li>追加ツールの場合は、長い標準パターン鉗子、ブンゼンバーナー、および3-4ガラスパスツールピペット（サイズは5¾）のペアガラスカバースリップを得る。 </li><li>ピペットツール：ピペットツールを作成するには、ブンゼンバーナーを点灯し、先端が溶けて穴が完全にシール、閉じられた、丸い端部を形成するように、それを回転させながら炎の青い部分にガラスパスツールピペットの先端を配置。丸みを帯びた、密封されたチップは、後で動作中に胚を保持する粘土皿にくぼみを作るために使用される。 図1Bを参照してください。 </li><li>ガラスの橋：ガラスの橋を作るためには、慎重にカバースリップガラスの3ミリメートルの塊で3ミリメートルを解消するために長い標準パターン鉗子を使用しています。 Tでカバースリップの一部を保持しながら、すべての4つのエッジが下方向に柔らかく曲線までweezers、小さなガラスのドームを形成する、炎でガラスを配置します。エッジはもはや鋭くないはず。 図1Cを参照してください。 </li><li>それらを挿入することにより、ガラスカバースリップ橋を保存する、ペトリ皿の底の内側を覆う、粘土に、ダウンエッジ。橋の上に粘土表面上に残るように、ブリッジを挿入します。このような橋が壊れていることをあまりにもハードにプッシュしないでください、それは除去が困難な場合がありますので、完全に、粘土に橋を埋め込まない。火炎又は70％エタノールで殺菌した後、ブリッジは実験毎に再利用することができる。 </li></ol> 3。胚操作の​​準備<ol><li>粘土の小さな60ミリメートルのプラスチック製ペトリ皿を並べる。使用の間、皿および粘土表面は十分に70％エタノールで、次いで蒸留水で洗浄する。 注：にローカルで購入することができますを使用し、赤、白や黄色、バンAken Plastalinaモデリング粘土、Yまたは美術店。それが残留を解放するため、黒色の粘土はお勧めできません。 </li><li> 3％のFicoll 0.5X MBS溶液で、皿を埋める。より高い塩濃度は、組織解離を防止し、多糖フィコール位置に顔を保持するのを補助する溶液を増粘するのに役立つ。 </li><li>燃え上がったパスツールピペットツールを使用して、ステージ20胚本体の深さ約粘土の浅い、2〜3mmの窪みを作 ​​るために（ 図1を参照）。お皿の両側に、離れて20から30の凹部1-2 mmで作るので、40〜60の凹部の合計があります。ピンセットで粘土にイニシャルを彫刻することにより、1辺LOF / GOF、反対側の野生型にラベルを付けます。 </li></ol> 4。術前の胚の準備<ol><li>入手して、文化、アフリカツメガエルは、標準的な方法17を使用して胚ツメガエル 。カエルの飼育の詳細については、SIVE らを参照してください。17 <ol><li> 48時間の実験obta前にメスのカエルからの卵と体外受精で行う。 </li><li> 1細胞期または2細胞期の2細胞に0.5〜1キャップ膜のGFP mRNAのNGに加え、任意のmRNAまたはアンチセンスモルフォリノで修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチド（「モルフォリノ」）を注入する。 1細胞期には約70〜90分持続します。 1-3 NLの総容量を注入する。 （例えば、GFPまたはRFP RNAのような）蛍光タンパク質をコードするRNAの代わりに、一方がFITC標識モルホリノ又は蛍光標識デキストランを注入することができる。蛍光は、組織の治癒を移植し、ヘッドに残っているか否かを判定するために重要である。 </li><li>キャップされたmRNAは、mMessage mMachine T7またはSP6のキットを用いて線状化プラスミドから調製することができる。モルホリノは、遺伝子ツールLLCを通じて設計し、注文することができます。所望の効果のために必要モルホリノの量は、各遺伝子18のために決定されなければならない。 </li><li>彼らは、ステージ19〜20に到達するまで、48時間15℃で注入した胚を保存する。 （Fまたはそれ以降のすべてのステップを、段階の胚Nieuwkoopとフェーバー19によるアフリカツメガエルの通常のテーブルによる。） 注：移植が最適に機能するためには、手術当日に、両方の受信者とドナー胚は、互いに1ステージ内でなければなりません。しかし、モルフォリノ（「モルファント」）を注入した胚は、時々、よりゆっくりと野生型よりも開発したり、モルファント胚を制御するので、モルファントと野生型の胚の両方が同じ段階にあることが必要で、実験を調整すること。モルファントは、従来の手順と12〜24時間、より高い温度に維持される必要があり得る。胚が一致する段階で見つけることができる可能性を高めるために、胚は、いくつかの温度で維持することができる。実験前に二十四時間、1は15〜18℃で18〜20℃、野生型の胚で、いくつかの皿、および場所モルファントに胚を分割しなければならない</li></ol></li><li>移植実験の日に、レムthe15℃のインキュベーターから胚オベとNieuwkoopとフェーバー19に応じてそれらを上演。彼らは後半神経胚（ステージ19）よりも若いしている場合、彼らはステージ19に到達するまで、1〜2時間室温でそれらを残す。 </li><li>蛍光顕微鏡下で注入した胚を選別。実験のための統一、明るい蛍光を示す胚を選択します。 </li><li>動作領域に近いクラッター、可能な汚染物質を除去する。 70％エタノールで操作面、実体顕微鏡およびすべてのツールを拭う。 </li><li>胚はステージ19になったら、実体顕微鏡下で＃45分の5デュモンの鉗子を使用して、卵黄膜を除去します。 <ol><li>ドナーとホスト胚の各20〜30の卵黄膜を除去します。 </li><li>最初のいくつかの顔面移植実験のために、1は、各条件のためのいくつかの胚で練習してください。この方法は、困難であり、それは、迅速かつ首尾よく、より大規模に使用する前に慎重に練習を必要とする。一つは、Uを働かせることができる20移植/実験をすることをP。 </li></ol></li><li>プラスチックを使用して、オペレーティング皿にホスト胚を移動し開口部が胚（少なくとも数ミリ）よりもはるかに広いなるようthatカットオフチップでトランスファーピペットを卒業した。胚は表面張力に爆発するように、気泡や水面に胚に触れないように注意してください。 </li><li>粘土中の胚の後部に、粘土凹部に胚を挿入するために＃45分の5ピンセットを使用してください。優しくうつ病から突出、胚の上四半期、頭を残して、ピンセットを用いて胚のベースの周りに粘土を閉じます。 </li><li>すべてのホストの胚は、それらの凹部内に固定されると、プレートの反対側に移動し、その凹部にドナー胚を挿入し始める。そのウェル中の胚を確保するプロセスを繰り返します。 </li></ol> 5。顔面移植手術を行う<ol><li>ナイフをカット：除去するための切断ナイフなどのドナーEAD組織の適切割れたガラスキャピラリーニードル（ステップ2.3および図1参照 ）を使用します。 注：一つは、直接指の間の毛管を保持することができます（これは小さな手を持つ人々に適しています）、または1は、昆虫のピンホルダーに針を取り付けることができます。ピンホルダーに装填Electrosharpenedタングステン針17の代わりに毛細管針を用いてもよい。具体的な試薬および器具の表で示唆ピンホルダー、タングステン針を参照してください。 </li><li>実体顕微鏡下では、セメント腺の左にある胚の頭の中に針を挿入します。それは胚の外側から、頭部を通って、腸に通過するように針が深く挿入する必要があります。全体EADを移植するために、カットは前腸に胚の外側から拡張する必要があります。外胚葉のみの移植のため、カットが浅くあるべきであり、唯一の外胚葉を貫通している。 <ol><li>左から右側に針をフリックセメント腺の幅全体にわたって、頭。動きがきれいにカットを与えるようにフリックが重要です。カットのデモンストレーションのための技術と、図2Bの概要については、 図2Aを参照してください。セメント腺と目がカットのための重要なランドマークです。カットの順番は結果に影響しませんし、ユーザーの好みや利き手によって異なる場合があります。 </li></ol></li><li>セメント腺の左の境界で、前のカットの開始時に針を置き、それは、左眼の下に到達するまで上方向に針をフリック。これは、左眼の下にセメント腺の左の境界からの垂直カットを作成します。 </li><li>セメント腺の右側の境界線に針を置き、それが右目の底部に到達するまで、上方向に針をフリック。これは、右眼の下にセメント腺の右側の境界線からの垂直カットを作成します。 </li><li>完全に組織、警察官を切除組織を解放する水平カットの作成、右目の下へ、左眼の下から針をk個。カットはEAD外植片における外胚葉と内胚葉の両方を含む、前腸に胚の外側から拡張することができます。代わりに、浅いカットは外胚葉のみのEAD移植のために使用することができます。 EAD組織が除去されると、ちょうど目（上から下）は、以下にセメント腺からストレッチ、前腸への胚の外側から長方形の穴があるはずです。穴は、右眼（左右に）の内側の境界線に、左眼の内側の境界から拡張する必要があります。 図2Bbはを参照してください。 </li><li>そっと針の先端の切除組織を押して、ホスト胚を含む皿の部分にバッファを介して持ち上げます。表面の空気に組織をさらさないでください、またはそれが破損します。 </li><li>ドナーに関しては、宿主胚と同じ組織を切除する。ホストEAD外植片を廃棄するか、inserに保存相互の移植のために、ドナーの顔をトン。 </li><li> ＃45分の5ピンセットを用いて結果の上位穴にドナー外植片を挿入します。 </li><li>ドナー組織が ​​正しい位置に完全に挿入されると、慎重に所定の位置に移植を保持するために、胚の顔の上に（ 図1と図2BCを参照）は、ガラスの橋を置く。橋の両端が所定の位置に保持している、粘土に挿入する必要があります。ブリッジは優しく移植は、それが頭から突き出またはディープヘッド内にあることなく、ホストヘッドと面一に位置するように移植された組織に圧力を適用する必要があります。頭が少しカバースリップにより平坦ますが、あまりにも多くの圧力で胚を傷つけないように注意してくださいすることができます。移植は5分以内に行われるべきである。 注：経験のある研究者は2〜3時間かけて、実験あたり約20の移植を行うことができます。この期間中の胚は、ステージ20〜22から進行する。顔面移植を完了ステージ21または22のSは、アウトカムに影響を与えません。 （ステージ22〜26時）以降の移植が行われますが、クレスト·フリーEADの正中領域が顔に頭蓋神経堤移動するときに狭くなるようにより困難であることができます。移植間の一貫性が重要です。 </li></ol> 6。顔面移植手術後の回復<ol><li>治癒は一般的に2〜3時間かかります。ガラスの橋が所定の位置に、ドナー組織を保持しているとの粘土凹部に邪魔されずに、室温での胚のままにしておきます。 </li><li>移植が治癒した後、慎重に、ガラスの橋を削除ピンセットを用いて胚のベース付近から粘土を削除し、プラスチックを使用して静かに彼らのくぼみから胚を真空トランスファーピペットを卒業した。 </li><li>半分ゲンタマイシンをクリーン0.1×MBSで満たされた適切に標識されたペトリ皿の中に胚を置く。 </li><li>彼らはステージ40に供給するオタマジャクシ段階に到達するまで、15℃または18℃での胚は、W、数日間成長鶏の顔の表現型を採点することができる。 <ol><li>ゲンタマイシンを0.1×MBS液を毎日交換する必要があり、デッド胚は、他の胚の汚染と死を防ぐために、速やかに削除する必要があります。 </li><li>口の中には、ステージ40に開口している。段階40〜41で、1が移植された組織は、その蛍光を表示して、所定の位置に癒さままであることを確認する必要があります。移植が時折落ちるので、1は、すべての得点の胚が所定の位置に、ドナー組織を持っていることを確認する必要があります。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、開示することは何もありません。

重要なステップと制限：EADの顔面移植の手順は時間であり、集中して作業。それは完璧に練習、着実に手や器用さを必要とします。顔面移植プロトコルは、効率的に組織を除去し、移植する研究者の能力に依存しています。 1ホストの顔を移植を挿入するためには長すぎるがかかる場合は、ホストの顔は収縮し、癒すために開始されます。鉗子は、微妙に顔領域を拡張するために使用することができます。有意な創傷収縮が発生した場合は、移植ならびに治癒せず、宿主の顔の穴にフィットするようにサイズを小さくする必要があるかもしれない。移植のサイズと形状は、ほぼ正常な挿入を可能にするために、受信者の顔の空洞の大きさや形状と一致する必要があります。 ステージによってマッチングされた胚で、ステージ19〜22の間で実行時に顔移植は最も成功している。ステージ22〜26の間の古い顔移植は、可能であるが、より困難であるANクレスト·フリー正中領域は、ステージ22から26と大幅に狭くなるため、Dは、顔の両側に神経堤の移行を妨害することがあります。 受信者とドナーの両方...

頭蓋顔面の先天性欠損症1〜2のメカニズムを理解するために、頭蓋顔面の開発における重要な組織とそのシグナル伝達の寄与が特定されなければならない。カエルアフリカツメガエル、外胚葉と内胚葉、直接3-4並置されている「エクストリーム前歯ドメイン」（EAD）、から口や鼻の穴の形を含む顔の一部では、。 EADはまた、顎や他の顔領域5を形成し 、頭蓋神経堤など、周囲の組織に影響を与えるために、シグナリング·センターとして機能します。組織が対応するホスト領域を除去した後に、ホスト胚にドナーから移植されている場合、EADの機能に寄与する遺伝子を同定するために、「顔面移植」技術は、開発されました。移植後、顔の発達を生じることは評価される。このように、機能の喪失（LOF）またはEAD内の特定の遺伝子のための機能（GOF）の利得の効果は、局部的に分析したところ、Hの残りの部分EADと体は、野生型組織から構成されている。野生型組織特異的遺伝子のグローバルLOFまたはGOFを有する胚に移植される移植逆数を行うことができる。移植は、しばしば、アフリカツメガエルおよびニワトリの試験6で用いられてきた。例えば、 アフリカツメガエルの移植が単純発生の神経誘導、レンズや神経の能力、および神経堤の移行7月10日に対処しています。ウズラ、ひよこキメラ移植は、前神経板、前方神経尾根、神経堤、および頭蓋骨11月14日の開発を分析しました。これは、この技術は、推定口5に基底膜形成の調節におけるWnt阻害剤Frzb1、クレセントための新たな役割を実証してきました。アフリカツメガエルにおける頭蓋顔面の開発研究のための最初の移植技術です。 アフリカツメガエル頭蓋顔面の開発の研究のための理想的なモデルです。胚が大きいように、外部の開発ND顔は、開発のマイクロマニピュレーションとイメージングを可能に容易に見ることができる。顔の開発の基礎となるメカニズムはカエルで行われた調査結果は、人間開発4,15-16への洞察を提供することを示し、保存され表示されます。

<table><tbody><tr><td>パスツールピペット</td><td>VWR</td><td>14672-400</td><td>ライムグラス&nbsp;</td></tr><tr><td>サイズ5 3/4 in</td><td>コットンプラグ目</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盛り付きトランスファーピペット</td><td>VWR</td><td>16001-180</td>使い捨て<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>#5/45鉗子</td><td>ファインサイエンスツールデュポンメディカル</td><td>11251-35</td><td>角度45&deg;</td></tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11000-20</td><td>ストレート;鋸歯状チップ;ステンレス鋼</td></tr><tr><td>キャピラリーチューブ(針用)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>ホウ素1.0 mm OD x 0.5 mm ID /ファイバー</td></tr><tr><td>カバースリップ&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393 252</td><td>24 x 60 mm&nbsp;マイクロカバーガラス;</td></tr><tr><td>Ficoll 400</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9378</td><td></td></tr><tr><td>ニードルプラー&nbsp;</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>Needle Puller:生産終了 Filament:FB300B</td><td>最も類似した、現在入手可能な&nbsp;ニードルプーラーはP-97です。フィラメントには、幅3.0mmのSutter 3.00 mm角ボックスフィラメントを使用します。</td></tr><tr><td>モデル P-80</td><td>フレーミング / ブラウン マイクロピペットプーラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡 Lighting by Fostec</td><td>フォステック</td><td></td> 光ファイバー<td>アームが2本付いたライトボックスを使用します。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ニッケルメッキピンホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26018-17</td><td>顎開口部径:0-1 mm</td></tr><tr><td>モリアニッケルメッキピンホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26016-12</td><td>顎開口部直径:0-1 mm</td></tr><tr><td>タングステン針</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10130-05</td><td>0.125 mmロッド径</td></tr><tr><td>Van Aken Plastalina</td><td>Blick</td><td>#33268-2981</td><td></td></tr>モデリング<tr><td>クレイ-白、赤、または黄色</td><td></td><td></td><td></td></tr>の<tr><td>mMessage mMashine SP6またはT7キット</td><td>Ambion</td><td>AM1340</td><td></td></tr></tbody></table>

顔面移植<em&gt;アフリカツメガエル</em&gt;胚

Facial Transplants in Xenopus laevis Embryos

頭蓋顔面の先天性欠損症は、すべて700出生のうち1つで発生したが、病因はほとんどのため、頭蓋顔面の開発の限られた理解に知られていない。シグナル伝達経路や組織が ​​発達顔のパターン形成中に行動する場所を特定するには、「顔面移植」技術はカエルアフリカツメガエルの胚で開発された。推定ティッシュ（「エクストリーム前方ドメイン」（EAD））の領域は、尾芽段階でドナー胚から除去され、同等の領域が除去された同じステージの宿主胚に移植する。これは、ホストまたはドナー組織は遺伝子機能の損失又は利得を有し、および/または系統標識を含むキメラ面を生成するために使用することができる。顔領域を容易に大規模であり、次のように治癒した後、現像の結果を監視し、ドナー又は周囲の宿主組織内シグナル伝達経路の役割を示している。 アフリカツメガエルは 、顔の開発のための貴重なモデルであるマイクロマニピュレーション用ccessible。多くの胚は、開発が急速に起こるため、短い期間にわたって、アッセイすることができる。頭蓋顔面のプロセスは、アフリカツメガエルと哺乳類の間で保存現れるので、カエルでの調査結果は、人間開発に関連している。

図3Aに示すように、移植された組織は、完全に移植後に宿主ヘッド内に挿入されるべきであり、 図2BCに示すように、ガラスブリッジは、適宜、胚の顔の上に配置されている。移植を成功させるために移植されたドナー組織が正しく、ホストオープニングサイズにする必要があります。 図3B及び3Cに見られるようにEAD組織は、どのような方法で、頭部から突出しないようにしてください。 図3（d）に示すように加えて、顔の移植は、ドナーの体での位置に対して回転してはならない。数時間後、移植組織および周囲の顔が癒しべきであり、次の日までに、胚は、 図4Aおよび図4（a） &#39;に示した例のように表示されます。一つは、移植は、 図4（b）の所定の位置に残っていること、蛍光の下で、観察することができます。ステージ41には、移植された対照組織はCONTRます口にibuteし、「図4...

アフリカツメガエル胚の間の顔の組織が ​​開発された「エクストリーム前部ドメイン」移植する技術。組織は、頭蓋顔面および開発のための顔領域間の相互作用をシグナリングするための地域の要件の研究を可能にする、別に1つの遺伝子発現のバックグラウンドを移動させることができる。

Craniofacial birth defects occur in 1 out of every 700 live births, but etiology is rarely known due to limited understanding of craniofacial development. ...

本手順の総合的な目的は、アフリカツメガエル（xenopus）の胚間で最前端ドメイン（extreme anterior domain：EAD）顔面組織を移植することです。まず、異なる遺伝的背景を持つドナー胚とレシピエント胚からEAD組織を除去します。次に、ドナー胚から採取したEAD外植片をレシピエント胚の顔面に挿入します。最終ステップとして、移植した胚を受精後60〜70時間まで維持し、観察を行います。最終的に、明視野顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いて、移植動物の頭顔面発達における変化を観察できます。この手法は、極前方のドメインから発生する口腔発達に不可欠な新しいシグナルなど、頭顔面奇形に関する理解を深めるための、頭顔面発達分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。操作前にキャピラリーチューブをニードルプラーにセットし、4〜6本のニードルを製作します。その際、ガラスチップの2〜3 mmの柔軟な毛状の部分が完全に切り離されるように、各ニードルを破断させてください。チップは、切断ツールとして使用できる十分な細さでありつつ、適度な剛性が必要です。次に、ブンゼンバーナーに点火し、ガラスパストールピペットの先端を炎の青い部分に置きます。ピペットを回転させて先端を溶かし、穴を完全に塞いで丸い閉端を形成させます。ガラスブリッジを作成するには、標準的なロングパターン鉗子を使用して、カバーガラスを3 mm × 3 mmの破片に慎重に砕いて取り出します。次に、ピンセットでカバーガラスを持ち、4つの端がすべて柔らかくなり、下向きに湾曲して小さなガラスドームが形成されるまで、ガラスを炎にかざします。続いて、60 mmのプラスチック製ペトリ皿に、赤、白、または黄色の造形用粘土を敷きます。そして、皿に3%phiを満たします。0.5 XMBS溶液を準備します。次に、火炎滅菌したパステールまたはピペットチップを用いて、実験の48時間前に、ステージ20の胚の体と同程度の深さ（約2〜3 mm）の浅いくぼみを、クレイ上に40〜60箇所作成します。メスのカエルから卵を採取し、体外受精させます。その後、キャップ処理した膜、GFP mRNA、およびその他のメッセージを胚に注入し、ステージ19から20に達するまで15 °Cで48時間保存します。移植実験の当日、蛍光顕微鏡を用いて、均一で明るい蛍光を示す注入胚を選択します。操作面のステレオ顕微鏡と器具を70% ethanolで拭き取った後、ステレオ顕微鏡下でDumont 5番 45 forcepsを用い、選択した各胚の卵膜を除去します。次に、先端を切り落としたプラスチック製の目盛り付き転送ピペットを使用して、ホスト胚を操作用ディッシュに移動させます。胚が空気と水の界面に触れないように注意してください。胚を後側を下にして粘土のくぼみに挿入し、ピンセットを用いて胚の基部の周りの粘土を慎重に閉じ、頭部がくぼみから突き出た状態にします。ドナー側をまず取り除くため、セメント腺の左側にある胚の頭部に、引き抜いた針の一本を、胚の外側から頭部を通り前腸まで到達する十分な深さまで挿入します。針を頭部の左側から右側へ、セメント腺の全幅にわたって弾くように動かし、きれいな切開線を作ります。次に、セメント腺の左端の切開開始点に針を置き、左眼の下端に達するまで針を上方へ弾くように動かし、セメント腺の左端から左眼の下端までの垂直な切開線を作成します。続いて、セメント腺の右端に針を置き、右眼の下端に達するまで針を上方へ弾くように動かし、セメント腺の右端から右眼の下端までの垂直な切開線を作成します。次に、組織を完全に切除するため、左眼の下側から右眼の下側に向かって針を弾くように動かし、組織を切り離すための水平な切開を加えます。ここで、切除した組織を針先にそっと押し付け、バッファーの中を通って、ホスト胚が入っているディッシュの箇所まで持ち上げます。先ほど示した方法でホスト胚から組織を切除し、ホストとEAD外植片を廃棄して、ドナー外植片を空いたホストの穴に挿入します。ドナー組織を正しく配置し、慎重に完全に挿入したら、あらかじめ準備しておいたガラスブリッジの1つを胚の顔の上に置き、移植片を固定します。その際、ブリッジの両端を粘土に差し込んで安定させます。手術後は、胚を室温で2〜3時間、動かさずに静置してください。その後、移植部位が治癒したら、胚からガラスブリッジを、また胚の基底周りから粘土を慎重に取り除きます。次に、プラスチック製目盛り付き転送ピペットを用いて、胚をディプレッションから静かに吸引します。胚を、Gentamycinを添加した清浄な0.1 XMBSを半分まで満たした、適切にラベル付けされたペトリ皿に移し、ステージ40に達するまで15〜18 °Cで数日間育成します。MBS溶液を毎日交換し、移植組織を蛍光観察して、エクスプランが定着したままであることを確認してください。移植した組織は、先ほど実演したように、移植後にホストの頭部へ完全に挿入される必要があり、移植を成功させるためにはホストの開口部に合わせて適切にサイズ調整されていなければなりません。不適切に配置されたエクスプランのこれら2つの画像で観察されるように、EAD組織が頭部からいかなる形でも突出していてはいけません。さらに、ここで示されているように、顔面移植組織がドナー体内の位置に対して回転してしまってはなりません。数時間後、移植された組織と周囲の顔面部は治癒し、翌日には、これらの画像に示されている例のような胚の状態になります。このように、蛍光顕微鏡を用いることで、治癒過程において移植片が所定の位置に留まっていることを確認できます。ステージ42において、移植されたコントロール組織は口の一部となり、緑色蛍光を維持します。このビデオを視聴することで、ある胚から別の胚へEAD組織を移植する方法を十分に理解できたはずです。この手法を活用することで、EADのどの胚葉または領域が顔面形成において最も重要であるかを特定することが容易になります。

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JoVE Journal

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顔面移植

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