Name: グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶ グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入法により、神経細胞の樹状突起におけるシナプス後信号の統合メカニズムを解明します。この技術は神経科学における興奮と抑制の統合理解に貢献します。

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我々は慎重に原稿を読み取るためのハンス·ライナー干拓、マーティン·フールマンとウォーカージャクソンに感謝します。 、神経変性疾患におけるセンター·オブ·エクセレンス（COEN、著者は、国家ノルト-ウェストファリア（SR）、計算論的神経科学におけるBMBF-ProjekträgerDLR米国ドイツコラボレーション（SR CRCNS）の研究MIWF省から提供された資金提供を受けた; SR）、およびボン大学学内資金調達プログラム（BONFOR; SR）。

1。システム要件<ol><li>顕微鏡システム：デンドライトの良い可視化は非常に重要です。可能であれば、二光子レーザー走査型顕微鏡システムを使用してください。サファイア超高速パルスレーザー（カメレオンウルトラII、コヒーレント）と高NA目的：我々の実験では、Tiを装備TRIM範囲II、LaVisionバイオ、ビーレフェルト、ドイツやウルティマIVシステム、プレーリー·テクノロジーズ、ミドルトン、ウィスコンシン州で使用（60X、0.9 NA、オリンパス）我々は、パッチピペットを介して蛍光色素に満ちていた樹状突起を可視化する。光損傷が2光子スキャンを使用してそれほど深刻であると考えられているが、レーザパワーを低減（組織における下8 mW）とし、滞留時間（以下1μ秒）又はできるだけ。 </li><li>第二の可能性は、可能な限り露光時間を短縮するために獲得と同期して広視野蛍光光源（LEDや蛍光灯）をトリガすることである。我々は、統合された光源（TILLPhoとモノクロを使用しているDodtコントラスト赤外線照明（TILLPhotonics、Grafelfingから、ドイツ）が装備されていたツァイスAxioskop 2 FS正立顕微鏡でトニック、Grafelfingから、ドイツ）。我々の実験において、露光時間は、通常、10ミリ秒から最大であった。 30ミリ秒。 </li><li> 例えば 2チャンネルマイクロイオントフォレーシスシステム高速キャパシタンス補償MVCS-C-02（NPI電子、タム、ドイツ）、高速マイクロイオン導入·アンプを使用してください。先の細いイオントフォレーシス微小電極は、25の抵抗がある - MΩ100（決定的にチップサイズやピペットの形状に応じて）、およびイオン導入アンプの容量補正を最適にチューニングされている場合、高速の立ち上がり時間にのみ達成することができます。この高速補償はイオン導入ピペットにサブミリ秒の範囲内で簡潔かつ迅速な開始と電流パルスを印加することにより、1ミクロン以下の13スポットサイズでの高空間分解能でトランスミッタを排出することが必要である。イオントフォレーシスアンプはアルです我々は我々の研究室でテストされていないいくつかの他の企業から入手できるそう。これらのデバイスは、静電容量補償回路を備えていない我々の知る限りである。 </li></ol> 2。ソリューションを準備<ol><li>人工脳脊髄液（ACSF）、それが実験的な設計のために必要とされるように内部溶液を調製。必要とされる内部のソリューションは、唯一の追加は、光学機器に応じて、赤または緑の蛍光色素（ 例えば 50〜200μMアレクサフルーア488または594ヒドラジド、Invitrogen社）である。 mm単位で、解剖のために使用することができますACSF スクロースはこちら例：60のNaCl、100スクロース、2.5のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、1のCaCl 2、5のMgCl 2、20グルコース、および通常ACSF用mMの中でパッチクランプ実験のためのソリューション：125のNaCl、3のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、2.6のCaCl 2、1.3のMgCl 2、15グルコース。 </li><li>すべての細胞外の溶液絶えず（95％O 2、5％CO 2）Carbogenize。 </li><li> mMのは、例えば、内部の溶液を調製：140 K-グルコン酸、7のKCl、5 HEPES酸、0.5のMgCl 2、5クレアチンリン酸、0.16 EGTA、50と- 200μMアレクサ488。 </li><li>グルタミン酸マイクロイオントフォレーシスは150mMのグルタミン酸で溶液を調製し、NaOHでpHを7.0に調整した。可視化のための50 -200μMアレクサフルーア488または594ヒドラジド（Invitrogen）を追加します。 </li><li> GABAのイオン導入は1 M GABA溶液を調製し、HCl 15を5にpHを調整する。このpH GABAが充電される時にのみ、それはイオントフォレーシスを用いて適用することができる。溶液中の低pHは細胞外空間に排出することに注意してくださいでは、GABA伝達自体16,17に影響を与える可能性があります。 年上の解決策は、その有効性を失うことができるので、光からGABAソリューションを保護し、頻繁に新鮮なGABAストック溶液を調製。 </li><li>それはGABA作動性イベント、ハイテクを参照することが困難である場合GH Cl -のドライビングフォース内部ソリューションは、塩化カリウムを除外するなどして、GABAトフォレーシスが機能しているかどうかを確認するGABA作動性のイベントを可視化するために役立つかもしれない、しかし、生理的な駆動力が推奨されることがありシナプス統合を検討する。小さ ​​なGABA作動性イベントの一般的な検出のために、 図8Cに示すプロトコルは助けることができます。 </li></ol> 3。イオン導入ピペットを引いて、テスト<ol><li>一般的には、右のピペットを引っ張ると多分制御、神経伝達物質のイオン導入を達成するための最も重要なステップです。細胞培養においてイオントフォレーシスを使用する場合は、鋭い微小電極10と同様の非常に微細な電極をプルすることができる。それらは角度で組織に下降しているときに、急性スライスにおけるパッチクランプ実験では、しかしながら、これらの非常に薄いピペットは不可能深い樹状突起に到達すること、スライス面上に曲げる。 </li><li>したがって、そう、非常に小さなチップでピペットを引くこといいえNeurotransmitterは漏れることができますが、先端はまだ組織（ 図2）に侵入するのに十分な剛性でなければならない。またはP-97プーラー、サター器械の会社、例えば、150ギガバイトF 8Pクラスピペット（科学製品、ホフハイム、ドイツ）と水平プラー（例えばDMZ-ユニバーサルプーラー、ザイツ·インスツルメンツ社、マルティンス、ドイツ使用、急な角度（ 図2および表2）を用いて小開口ではなく、短いタッパを達成するために、いくつかの引上げ工程とノヴァト、カリフォルニア州）。 </li><li> 10イオン導入ピペットをプルする石英ガラスピペットを使用することも可能である。これらは、良好な機械的特性を有するように、より信頼できるものと想定しているが、特殊なレーザ引き手が必要である。しかし、それは通常、パッチピペットを引っ張るために使用される通常のガラスピペットで良好な結果を達成することも可能である。 </li><li>最初にのためにそれらを使用する前に、組織なしでチャンバー内ピペット性能と抵抗をテスト時間は、グルタミン酸の漏洩以来、組織に悪影響を及ぼす可能性がある。 </li><li>正しくイオントフォレーシスアンプを設定します。その後、神経伝達物質と染料を含む溶液をピペットを記入し、お風呂（ACSF）にそれを置きます。 </li><li>容量（ 図3）を補う。通常、非常に鋭いピペットは鈍いものより高い容量を持つことになります。 </li><li>ピペットの抵抗をチェックします：ここで使用マイクロイオントフォレシスアンプはピペットの抵抗を測定するためのビルドの機能があります。これは、標準的なオシロスコープまたは集録ソフトウェアを使ってコンピュータに接続されたA / Dボードで監視することができます簡単な長方形のテストパルスを、呼び起こす。形状とチップサイズに応じて、先端が25間の抵抗を持っている必要があります - MΩ90。 </li><li>ピペットチップの外に蛍光染料が漏れた場合は60Xまたは40X水浸対物レンズと蛍光イメージングへのスイッチで可能であれば先端に焦点を当て、ズームイン、（GLUの場合は小さな正を適用玉手）または負は（GABA、 図4の場合）（&lt;0.02μA）現在保持している。それが漏れをキャンセルするために役立つていない場合は、ピペットを変更してください。 </li><li>強力なステップ電流を適用するか、手動トリガを使用し、溶液をピペットの外に排出することができるかどうかを確認するために蛍光画像で先端を監視します。上述したように、パルス電流の極性が吐出されることになっている分子の電荷に依存している。グルタミン酸を取り出すには、それは負の電流とGABAのために正の電流（ 図4）である。 </li><li>染料と送信機のブロック吐出を、高い排出現在の数倍を適用することによってクリアすることができますことをピペット内の空気が泡。 </li><li>そこには目に見える漏れはありませんし、テスト排出が成功した場合、一緒になって、静電容量を補償し、実験を開始します。 </li><li>注意：容量補正は、フィードバック回路により達成されるので、それがovercompであれば、この回路はオーバーシュートや発振することができるensated。優しく容量補正のダイヤル設定を使用します。 </li><li>フィラメントのプロパティを変更しているかもしれないので、プーラー安定性に応じて、それは、時には随時プラー設定を調整する必要がある。一旦良好なピペットが設計されれば、それは数日間使用することができる。したがって、実験を終えた後、先端に損傷を与えることなく、密閉容器にイオン導入ピペットを格納します。 </li><li>次の実験では特性（ 例えば抵抗）が大幅に変更する場合は先端をクリアしてから、チェックするために、いくつかの強力なイジェクトパルスを印加する、神経伝達物質の溶液をピペットを埋める。その後、静電容量を補償して、再度ピペットを使用しています。別の神経伝達物質のソリューションを単一のピペットを使用しないでください。 </li></ol> 4。脳スライスを準備<ol><li>マイクロイオントフォレーシスが初めて使用される場合間違いなく確実に作業プーラープログラムを確立した後、スライスを調製。 </li> &lt;あなたの機関や地方自治体の動物ケアのガイドラインに従った李&gt;行う麻酔と断頭手続き。 </li><li>脳を除去した後、氷冷ACSF スクロース （プロトコル2.1を参照）に転送します。 </li><li>適切な厚さ（例えば300μm以下）のスライスに関心領域をカットします。 </li><li> 30分間35℃でACSF スクロース内のスライスをインキュベートする。その後、室温で通常のACSFを含む水没保持室に転送します。 </li><li>調製及び実験を通して95％O 2、5％CO 2でスライスを囲むACSFをcarbogenize。 </li></ol> 5。ホールセル記録を確立する<ol><li>ホールセルモードを確立した後、長期的なポジショニングを回避するために、パッチを適用する前にセルをすでにスライス表面付近のイオントフォレーシスピペット（s）を配置します。 </li><li>低抵抗パッチピペット（3 - mΩの5）を引き、dでそれを埋めるあなたがたは、内部の溶液を含有し、ピペットに正圧（30 - 60ミリバール）を適用します。 </li><li>視覚的な指導の下、お風呂とアプローチセル（赤外線dodtコントラストまたは2つの光子のグラデーションのコントラスト画像）を入力します。 </li><li>電圧クランプモードでのテストパルス（ 例えば -10 mVで、20ミリ秒）とピペット抵抗を監視します。オフセット電位を修正する組織に触れたとき。 </li><li>セルに近づくと &quot;ディンプル&quot;ははっきりと見ることができるようになるまで静かにそこにピペットの先端を押してください。 60ミリバール負圧にし、-65 mVまで膜電位を切り替える - 直ちにピペットの圧力を解放し、40を適用します。 </li><li> 100 pAの下に現在の流域の値を保持する場合には、負圧を解放します。 </li><li>ギガシールを確立した後（抵抗&gt; 1GΩ）、ピペットまたはキャパシタンス補償回路の簡単な過補償に短い、強力な吸引と破裂膜。 </li><li>どのモードに応じて（電圧または電流クランプ）が必要です実験的なデザインのため、適切に補う。 </li><li>その最終的な位置にイオン導入ピペットを持って開始します。成功したパッチクランプ記録を実行する方法の詳細な説明が必要な場合は、18,19利用可能ないくつかの優れたガイドラインがあります。 </li></ol> 6。イオン導入ピペットを置き、シナプス後イオン導入の可能性を生成する<ol><li>一般的には、イオン導入イベントはGABAマイクロイオントフォレシス用ソーマや軸索イニシャルセグメント、樹状シャフトで、グルタミン酸マイクロトフォレーシス用のとげの樹状突起で、例えば、所望の実験に応じて定義されている場所で誘発することができます。 </li><li>それに触れずに1μm程度の距離にセルをアップアプローチ。興味のある位置に到達した後、それは神経伝達物質が漏れ出していないし、ピペット容量が正しく補正されていることをしていることが重要です。 </li><li>イオン導入pipettいっぱいグルタミン酸を細胞に近づいた場合eは膜電位の検出可能な脱分極を引き起こし、可能であれば現在の保持、またはピペットを変え調整します。 </li><li> 、短い負の電流パルスを印加ゼロから開始し（ 例えば 0.1から0.4ミリ、0.01から1μAパルス）系統的に電流を増加。これは、イオン導入、現在は、特定の実験のセットアップに必要な反応を呼び起こすどの範囲で調べるのに役立ちます。 </li><li>無応答検出がない場合は、ピペット数百μmを持ち上げ、先端をきれいにする（&gt; 0.1μA）強いイジェクト電流を適用する。 、静電容量を補正して、細胞に近づき、再度実行してください。 </li><li>応答がまだ存在しない場合、現在保持して減らす。この手順は、制御不能な神経伝達物質の放出を引き起こす可能性がありますので、ダイヤル設定と非常に注意してください。したがって、常に膜電位の各変化を検出するために記録を監視します。 </li><li>それはGABA作動性イベントを検出することは困難である場合には、人が使用することができるnの内部溶液組成は、高い塩素で降伏-駆動力を。ピペット溶液中の濃度（プロトコルセクション2.6を参照してください） -これを達成するために、塩素を減らす。これは、より高い駆動力によって静止膜電位で大きくGABA作動性イベントが発生します。 </li><li>また、-48 mVの（ 図8C）に-100 mVの膜電位からのチャンスをもたらし長時間電流ステップを注入。このプロトコルClで-駆動力が脱分極GABA応答を引き起こす過分極電位に上昇する。 </li><li>それは、イベントのGABA作動性を決定するのに役立ち誘発事象の逆転電位を決定する工程電流注入プロトコルを使用することも可能である。 GABAの漏れ、グルタミン酸の漏洩よりも検出が困難である。この場合には、入力抵抗の一定の監視がGABA充填されたピペットに近づくとき、助けることができる。入力抵抗が減少した場合、電流およびBを保持するeが増加又は異なるピペットを使用すべきである。 </li><li>グルタミン酸イオントフォレシス用対照実験として、我々は200μMOGB-1とグルタミン酸をリークが原因である可能性があり、ローカルカルシウム流入を可視化するピペット溶液のないEGTAを用いて、Ca 2 +のイメージング実験を示唆している。 </li><li>一般的に、安定した応答を達成するためには、経時的ドリフトを避けるために、機械的に安定なピペットを持っていることは非常に重要である。ドリフトは、温度変化が原因で発生することができ、したがって、それは、熱ドリフトを回避するための機器で測定する前に、少なくとも半時間を切り替えることをお勧めします。ピペットホルダーとチップで良いカートリッジシールを必ず使用して実際に固定されています。ホルダー自体はさらにテフロンテープで固定することができ、さらに、また、ドリフトの潜在的な源であるヘッドステージやマニピュレータ、からのケーブルには緊張感がないことを確認してください。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここでは、樹状突起上のシナプス統合を調査するために、神経伝達物質の高速マイクロイオントフォレシスを適用する方法を説明します。この技術は、正常in vitroおよびin vivo 9,20-22 で異なる脳領域におけるグルタミン酸とGABA作動性シナプス伝達を調査するために使用されている。マイクロイオントフォレーシスは60年以上も使用されてきたが、初期の頃には主に、ローカルまたは中間遅いタイムスケール23又はセル24内の物質のマイクロインジェクションのための神経伝達物質や薬物を適用するために使用した。 マイクロイオン導入は、高抵抗電極10,11の高速容量補正が装備されているアンプの導入以来樹統合を研究するために特に興味深いツールになりました。この改善で、それはRESEシナプス応答の結果について簡単に長方形のイオン導入電流を適用することが可能になったより現実的にシナプスのイベント10,25の時間経過をmbled。 <p class="...

中枢神経系のニューロンは、その薄いと分岐した樹状プロセス1のシナプス入力の様を受け取る。そこに、興奮性樹入力の大部分は、グルタミン酸作動性シナプスによって媒介される。これらのシナプスは、興奮性シナプス後電位（EPSPを）のシナプス後線形統合で、その結果、空間的に分散した方法で起動することができます。シナプスが同時にと樹状突起上の空間的に近接して活性化される場合、これらの興奮性入力は上記非線形統合されており、樹状突起スパイク2-5を生成することができます。 さらに、興奮性入力の統合は、樹状ツリー上の入力の場所によって異なります。遠房地域に到着した信号は、はるかに減衰ケーブルフィルタ6のために近位の入力よりも。海馬では、尖タフト樹状突起への遠い入力は近dendri上のものとは異なる脳の領域によって生成されTES 7。刺激的な質問は、異なる樹状コンパートメントによって樹状統合は、さまざまな方法で神経発火でこれらの階層の入力の影響を調整した場合どのように処理されるかシナプス入力、ことである。 機能特性、樹状突起の形態的な特徴だけでなく、入力の場所とクラスタリングは決定的にグルタミン酸作動性シナプス8,9の有効性を決定することも興奮性入力が、GABA作動性の端末からの追加の抑制性入力の樹統合に影響を与えている。シナプス統合のこれらの様々な側面は、理想的には、樹状ドメインに別の神経伝達物質の空間的に定義されたアプリケーションを可能にする神経伝達物質のマイクロイオン導入を用いて調査することができます。我々は成功したニューロンに信号積分を調査するために、グルタミン酸とGABAのマイクロイオントフォレシスを確立する方法をここに示しています。 このアプリケーションでは、先の細い濃縮された神経伝達物質溶液を充填した高抵抗ピペットが使用される。これらのピペットは、神経伝達物質受容体が位置するセルの外膜に近接して配置されている。樹枝の良い可視化が必要である。これは、最良のパッチピペットを介して導入される蛍光色素を用いて達成される。その後、非常に短い（&lt;1ミリ秒）パルス電流（10の範囲内の - 100 nAの）を入れ、神経伝達物質の分子を取り出すために使用されます。これらの短いパルスと実効容量の補償と、シナプス後電位または電流は興奮性入力の位置が正確に分かっていることを意味する高い時間·空間的精度を誘発することができます。グルタミン酸マイクロイオン導入（ 図1 9）ここに示されているように6未満である定義された半径内にシナプスを活性化することができますが、それは、単一シナプス決議10-12を達成することも可能です。 ハイネ、M. ら </emは&gt;その空間分解能を示したの速いマイクロイオン導入であっても定期的にグルタミン酸13の二光子アンケージングで達成スポットサイズよりも小さい場合は0.5μm、以下のサイズを見つけるために調整することができます。高速のマイクロイオントフォレシスでは、2つまたはそれ以上のイオン泳動ピペットを使用して、樹状突起で異なる、さらに遠い箇所にそれらを配置することが容易に可能である。このように、異なる経路からのものを含む興奮性事象の統合を検討することができる。それは同時にグルタミン酸とGABA充填されたイオン導入ピペットを使用することも可能である。このようにして興奮入力（オンパス、オフ経路阻害）に対して異なる位置におけるGABA作動性抑制の効果を研究することができる。また、特定の神経細胞のドメインを標的とする介在による阻害の影響は、遠位樹状突起のように、ソーマまたは軸索14は 、GABAイオン導入を用いて検討することができます。培養神経細胞では、高速のマイクロイオントフォレシスはinveの機会を提供しています単一のシナプス分布とはるかに詳細10,11のニューロンにおけるシナプス伝達の基本側面をstigate。 この記事では、入力位置、入力強度、タイミング、単独または相互作用での依存性に興奮性と抑制性入力のシナプス統合を調査可能に急性脳スライス、で使用するためのグルタミン酸やGABAイオントフォレシスを確立する方法を詳細に示しています。私たちは、この技術の利点と限界を指摘し、どのように成功したトラブルシューティング方法になります。

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Material</td></tr><tr><td>2光子レーザー走査型顕微鏡(TRIM Scope II)、およびUltima IV、Prairie Technologies、ミドルトン、ウィスコンシン州)</td><td>LaVision Biotec、ビーレフェルト、ドイツ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2光子レーザー走査型顕微鏡 Ultima IV</td><td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA&</td><td></td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire超高速パルスレーザー</td><td>Chameleon Ultra II, Coherent</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>60倍対物レンズ、NA 0.9</td><td>オリンパス</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Zeiss Axioskop 2 FS正立顕微鏡</td><td>TILLPhotonics、Gr&auml;felfing, ドイツ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>モノクロ</td><td>メーターTILLPhotonics、Gr&auml;felfing, ドイツ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロイオントフォレーシスシステム MVCS-02</td><td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>サッタープーラーP-97</td><td>サッターインストゥルメントカンパニー、カリフォルニア州</td><td></td>ノヴァト<td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスフィラメント(150 GB F 8P)</td><td>Science Products、ホーフハイム、ドイツ</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>試薬</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488ヒドラジド</td><td>分子プローブ生命技術</td><td>A-10436</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Molecular Probes ライフテクノロジー</td><td>A-10438</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S7653</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>KCl</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>P9333</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>S8282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>S6297</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S7903</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>C5080</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブシ</td><td>グマ アルドリッチ</td><td>M2670></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G7528</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-グルコン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>G4500</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>H4034</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ホスホクレアチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7936</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>E3889</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>グルタミン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>G8415</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GABA</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>A5835</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>メルク</td><td>1.09137.1000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HCl</td><td>メルク</td><td>1.09108.1000</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

グルタミン酸とgabaの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

神経科学の根本的利益の一つは、最終的には軸索における活動電位の神経出力につながる樹木、非常に複雑な構造に沿って興奮性と抑制性入力の統合を理解することです。ニューロンの出力上の特定のシナプス入力の多様な空間的および時間的パラメータの影響は、樹状入力の距離依存減衰、空間的に分離され、入力の場所に依存した相互作用、興奮統合、線形上GABAergig阻害の影響を、たとえば 、現在調査中ですと非線形統合モード、および多く。 グルタミン酸およびGABAの迅速なマイクロイオン導入で、それは正確にグルタミン酸作動性興奮及び抑制の空間的および時間的統合を調査することができる。重大な技術的要件は、トリガ蛍光灯、発光ダイオード（LED）、または2つの光子SCAある組織の有意な光損傷を導入することなく樹枝を可視化する顕微鏡nning。また、高抵抗ピペットの迅速な容量補正を可能にするマイクロイオントフォレーシス増幅器を有することが非常に重要である。もう一つの重要なポイントは、送信機が思わず実験中にピペットで放出されていないということです。 いったん確立された、この手法は、高い神経伝達物質と位置特異性で信頼性と再現性のあるシグナルを与える。グルタミン酸やGABAアンケージングに比べて、高速イオン導入は視野に限定することなく、同時に、非常に遠い場所で両方のトランスミッタを使用できます。軸索の焦点電気刺激と比較して利点もある。マイクロイオントフォレシス、入力部位の位置が明確に知られており、それが関心のある神経伝達物質のみが解除されていることを確認される。しかし、それだけで、マイクロイオントフォレシスであることを考慮する必要がありポストシナプスが活性化され、神経伝達物質の放出のシナプス前側面が解決されません。この記事では、脳スライス実験でマイクロイオントフォレシスを設定する方法を示します。

イオントフォレーシスの空間的な広がりを決定する簡単な方法は、排出されたグルタミン酸を一定に保ちながら、デンドライトから段階的にイオン導入ピペットを後退させることである。我々は、マイクロイオン導入刺激の空間的な範囲は約12ミクロン（ 図1半径を示す）の直径を持っていたことが分かった。どのように深部組織にイオン導入を使用することができるピペットの剛性に依存します。しかし、ここで使用されるスライス（ 図2）における実験のために必要なイオン泳動ピペットは、侵入の深さを限定するものではない。むしろ光学系と脳スライスの深さで減少分解能が制限要因である。良質の録音のためにそれは送信機がピペットの外に漏れていないことが重要です。ベースラインが急になった場合、デンドライトがピペットチップに近づいた場合や急激な脱分極がある場合、グルタミン酸の場合には、漏れを識別することができる不安定（ 図5）。安定した記録を確立した後、それが樹状ツリー（ 図6）を通して任意の場所で、この技術を用いて定義された振幅、樹状スパイクまたは活動電...

この記事では、高い空間的および時間的な精度を持つシナプス信号の統合を調査するための技術として、神経伝達物質の高速マイクロイオン導入をご紹介します。

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

本手順の全体的な目的は、ニューロンの樹状突起樹という非常に複雑な構造に沿った入力の統合を理解し、それが最終的に軸索における活動電位というニューロン出力にどのようにつながるかを明らかにすることです。これは、まず適切なイオン透過性ピペットを作製することで達成されます。次のステップでは、作製したイオン透過性ピペットをテストし、その容量を正しく補正します。次に、ホールセル構成を確立します。最後のステップは、樹状突起に近づけ、記録細胞に後シナプス電位を誘発させることです。最終的に、高速マイクロイオン導入法を用いることで、異なる神経伝達物質系に属する場合もある複数の入力の統合を調査することが可能になります。この手法は、抑制性および興奮性の入力がどのように、またどのような条件下で統合されるかなど、神経科学分野における重要な疑問を解明するのに役立ちます。これにより、ニューロンの出力が導かれます。まず、制御された神経伝達物質のイオン導入を行うため、先端が非常に細いピペットを作製することから始めてください。水平型または垂直型のピペットプラーを使用し、数回の引き出し工程を経ることで、非常に細いチップを作成できます。ただし、チップは組織に貫通させるのに十分な剛性を備えている必要があります。次に、組織のないチャンバー内でピペットの性能をテストするため、イオンアポレティックアンプをセットアップします。ピペットに神経伝達物質と色素を含む溶液を満たします。次に、それをA CSFに入れます。続いて、アンプを用いて容量補正を行います。通常、非常に鋭いピペットは、容量補正を正しく行った後でも、鈍いピペットより高い静電容量を持つ傾向があります。マイクロイオン導入増幅器の内蔵機能を用いて、ピペットの抵抗値を確認してください。ピペットの抵抗値は 25 から 90 mega ohms の間である必要があります。その後、60倍または40倍の水浸 objective（対物レンズ）でピペットチップに焦点を合わせます。次に、蛍光イメージングに切り替えます。蛍光Dがピペットチップから漏れ出した場合は、グルタミン酸であればわずかな正の保持電流を、GABAであれば負の保持電流を印加してください。それでも漏出が解消されない場合は、ピペットを交換してください。次に、ピペットに強いステップ電流を印加するか、マニュアルトリガーを使用します。ピペット先端の蛍光像をモニタリングし、溶液が排出されるかを確認してください。目に見える漏出がなく、テスト排出が成功したことを確認した後、容量補正を行い、実験を開始してください。一般に、イオン導入イベントは、目的の実験に応じて特定の部位で誘発させることができます。例えば、グルタミン酸のマイクロイオノフォレシスを行う場合は棘状突起に、GABAのマイクロイオノフォレシスを行う場合は樹状突起幹、細

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

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