解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

この手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュの胚を解剖してマウントし、脊髄の最適な顕微鏡的視覚化を実現することです。これは、最初にマイクロがオークボールを解剖して除去することによって達成されます。2番目のステップは、オークの破片を取り除き、胚をスライドにピペットで移すことです。

次に、余分な液をキムワイプで丁寧に取り除き、封入剤を添加します。最後のステップは、胚ポーカーを使用してスライド上の胚を向き付け、続いてカバースリップを適用することです。最終的に、蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡を使用して、有糸分裂後の細胞体の分布と発達中の軸索の軌跡を示します。

この方法は、パターニング、分化、軸索誘導に関与するメカニズムは何かなど、神経生物学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この方法は、神経系の発達の多くの側面についての洞察を提供することができますが、筋肉の発達などの他の組織にも適用できます。一般に、この方法に不慣れな人は、実験を開始する前に顕微鏡下での解剖が必要なため、苦労します。

ピペットの先端を過去のピペットに接着し、次にピペットの先端に釣り糸を接着して、胚ポーカーを作ります。胚の解剖を開始するには、最大30個のゼブラフィッシュの胚を配置します。受精後24時間で、PBSで満たされた35ミリメートルのシャーレに年齢

解剖顕微鏡の下で、昆虫ピンでオークを引き離しながら、一対の鉗子で胚の頭を固定します。次に、胚ポーカーを使用して、卵黄の破片があまりないペトリ皿の一部に胚を移動します。次に、胚をガラス製の牧草地ピペットに吸引し、液体をできるだけ吸い上げません。

次に、最大21個の胚をスライド上に静かにピペットで移します。胚に触れないように実験室のワイプを使用して余分な液体を慎重に吸い取り、次に胚に1滴の封入培地を追加します。次に、胚ポーカーを使って、胚を横向きに2〜3列に

次に、カバースリップの各コーナーにワセリンを軽くたたきます。ワセリンの入った面が下を向くようにカバースリップを裏返し、胚の上にカバースリップを置きます。ワセリンは、過度の圧迫による胚の損傷を防ぐ働きをします。

必要に応じて、20〜100マイクロリットルの範囲のピペッターを使用して、封入剤がカバースリップに触れるまで、各コーナーのカバースリップを軽くたたきます。カバースリップの隣に封入メディアを追加し、追加したメディアがカバースリップの下に吸い込まれるようにします。次に、実験室用ワイプを使用して、カバースリップの周りを完全に清掃します。

カバースリップに圧力をかけないでください、適切に洗浄すると胚が損傷する可能性があるため、その領域は乾燥しており、ワセリンや封入剤が付着していません。マニキュアを使用して、カバースリップの端をシールして仕上げます。ゼブラフィッシュの胚をマウントした後、オーク嚢伸長部の上のいくつかのHEMIセグメントが視覚化されました。

この図は、ゼブラフィッシュ胚の腹側脊髄におけるNK X 6.1の発現を示しています。NK X 6.1 mRNAは、受精後24時間で脊髄のほぼ腹側半分に分布しています。前駆細胞ドメイン内では、前駆細胞は、脊髄の内側部分に見られる床板の存在により、有糸分裂後細胞と区別できます。

DIC光学系で見たところ。個々の細胞は明確に区別でき、発現している細胞と発現していない細胞との間に明確な境界が明確です。前駆細胞周期の出口は、遺伝子発現の変化を伴います。

この画像は、有糸分裂後ニューロンにおけるロボ3の発現を示しています。受容体のロボファミリーは、軸索誘導受容体であり、その発現により有糸分裂後ニューロンの正確なカウントが可能になります。床板と前駆ゾーンは、このより横方向の焦点面では明らかではないことに注意してください。

共焦点顕微鏡法を使用して、znp one免疫蛍光を画像化し、この横方向にマウントされた胚に示すようにモーター軸索を標識しました。運動ニューロンは、受精後24時間で脊髄を腹側に出て、周囲の発達中の筋肉組織を神経支配します。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば30分で完了します。

この手順を試みる際には、慎重なマイクロダイセクションを通じて組織の完全性を維持することを覚えておくことが重要です。このビデオを見れば、ゼブラフィッシュの胚の卵黄を採取し、マウントと顕微鏡での可視化を行うためのマイクロダイセクション技術の使い方を十分に理解できるはずです。