解剖やゼブラフィッシュ胚の横方向の取付：脊髄発達の解析

本手順の全体的な目的は、脊髄を顕微鏡で最適に可視化するために、ゼブラフィッシュ胚を解剖し、マウントすることです。まず、マイクロ解剖によって卵膜を除去します。次に、卵膜の残渣を取り除き、ピペットで胚をスライドガラス上に移します。

次に、過剰な液体をキムワイプで慎重に取り除き、封入剤を添加します。最後のステップとして、エンブリオペーカーを用いてスライド上の胚の向きを調整し、カバーガラスを被せます。最終的に、蛍光顕微鏡または明視野顕微鏡を用いて、有糸分裂後の細胞体の分布および発達中の軸索の軌跡を観察します。

この手法は、パターニング、分化、および軸索誘導を担うメカニズムは何かといった、神経生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。この手法は神経系発達の多くの側面についての洞察を提供しますが、発達中の筋肉などの他の組織にも適用可能です。一般的に、この手法に不慣れな方は、実験を開始する前に顕微鏡下での解剖が必要となるため、習得に苦労することがあります。

ピペットチップを使い古したピペットに接着し、さらにそのピペットチップに釣り糸を接着して、胚用ポーカーを作成します。胚の解剖を開始するには、受精後24時間のゼブラフィッシュ胚を最大30個まで、PBSを満たした35 millimeterのペトリ皿に入れます。

解剖顕微鏡下で、ピンセットを用いて胚の頭部を固定し、昆虫ピンで卵黄をかき出します。次に、胚ポーカーを使用して、卵黄の破片が少ないペトリ皿の箇所まで胚を移動させます。その後、ガラス製パステールピペットを用いて、液体をできるだけ少なく吸い込みながら胚を吸引します。

次に、最大21個の胚をスライドガラス上に静かにピペッティングします。胚に触れないように注意しながら、ラボワイプを用いて余分な液体を慎重に吸い取り、胚に封入剤を1滴加えます。次に、胚用ポーカーを使用して、胚を側面向きにして2〜3列に整列させます。

次に、カバーガラスの四隅に少量のワセリンを塗布します。ワセリンを塗った面を下にしてカバーガラスを回転させ、胚の上に置きます。ワセリンは、過度な圧縮による胚への損傷を防ぐ役割を果たします。

必要に応じて、20から100 µL範囲のピペッターを使用し、封入剤がカバーガラスに触れるまで、カバーガラスの各隅を軽く叩きます。カバーガラスの脇に封入剤を追加し、追加した封入剤がカバーガラスの下に染み込むようにします。次に、ラボワイプを使用して、カバーガラスの周囲を完全に清掃します。

カバーガラスに圧力をかけると胚を損傷する可能性があるため、注意してください。適切に洗浄され、領域が乾燥しており、ワセリンや封入剤が付着していないことを確認してください。最後に、マニキュアを使用してカバーガラスの縁を密封します。ゼブラフィッシュ胚を封入した後、心嚢拡張部位の上方に数個のHEMIセグメントが視認されました。

この図は、ゼブラフィッシュ胚の腹側脊髄におけるNK X 6.1の発現を示しています。受精後24時間において、NK X 6.1 mRNAは脊髄のおおよそ腹側半分に分布しています。前駆細胞領域内では、脊髄の内側部分に存在する床板があるため、前駆細胞をポストミトーティック細胞と区別することができます。

DIC光学系で観察。個々の細胞が明確に識別でき、発現細胞と非発現細胞の間の明確な境界が認められる。前駆細胞の細胞周期脱出は、遺伝子発現の変化を伴う。

この画像は、分裂後ニューロンにおけるRobo3の発現を示しています。Roboファミリー受容体は軸索誘導受容体であり、その発現により分裂後ニューロンの正確な計数が可能になります。より外側の焦点面であるため、床板および前駆細胞領域は認められないことに注意してください。

共焦点顕微鏡を用いてznp one免疫蛍光染色をイメージングしました。この側方向から固定した胚に示されているように、これにより運動ニューロンの軸索が標識されます。運動ニューロンは受精後24時間で脊髄から腹側に出現し、周囲で発達中の筋肉に支配を伸ばします。この手法に習熟し、適切に実施すれば、30分で完了させることができます。

本手順を行う際は、慎重なマイクロダイセクションによって組織の完全性を維持することが重要です。このビデオを視聴することで、ゼブラフィッシュ胚の卵黄をマイクロダイセクション技術で除去し、マウントして顕微鏡で可視化する方法について十分に理解できるはずです。