マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

この手順の全体的な目標は、さまざまな成長因子の存在下での腸内神経前駆細胞の移動可能性を定量化することです。これは、蛍光神経皮細胞が占めるマウス胚の小腸を最初に解剖することによって達成されます。2番目のステップは、振動するミクロトームを使用して、腸の厚さ200ミクロンのスライスを作成することです。

次に、これらのスライスを成長因子を含むコラーゲンゲルの上でインキュベートします。最後のステップは、スライスをはがして、その下にある移動細胞を明らかにすることです。最終的には、蛍光顕微鏡法を使用して、コラーゲンゲル内を移動する細胞のパターンを示します。

この方法は、末梢神経系の形成の根底にあるさまざまなシグナル伝達経路間の相互作用をよりよく理解するなど、発生生物学における重要な質問に答えるのに役立ちます。膣栓が見つかった12日後に、雌マウスを安楽死させて子宮を摘出し、氷で満たされたガラスのシャーレに子宮を置きます。冷たいPBSは、個々のデウム腫脹の間で子宮を横方向に切断し、解剖顕微鏡下で各胚の着床部位を分離し、細かい鉗子を使用して子宮の筋肉層を除去します。

内臓の卵黄袋と羊膜を開けて、胚を明らかにします。血管を切断するときは注意してください、それらが発達中の腸と絡み合っているので、胚を卵黄袋に結合します。次に、閉じた鉗子を暗赤色の肝臓のすぐ上の腹腔に挿入し、開くようにします。

これにより、腹腔内に横方向の開口部ができます。開いた鉗子を胚の後端に向かって引き下げて、腹部を完全に開きます。開いたら、肝臓の後ろの結合組織をつかみ、腸を引き出します。

腸を壊さないように注意してください。任意の場所で結腸を切って、腸を残りの胚から解放します。テール部分は後で使用するために取っておきます。

盲腸から結合組織を引き出し、次に腸が小腸の吻側端にそれらを傷つけないように注意深く働きます。肝臓と胃、およびメソ、ネフロ、生殖器の隆起がある場合は切り取ります。最後に、盲腸と結腸、および残りの結合組織を切り取って小腸を分離します。

以前と同様に、腸を傷つけないように注意してください。小腸をPBSに室温でできるだけ短時間放置してから埋め込みます。胚を首で切断した後、尾体節の数を記録して、胚発生の段階を正確に決定します。

胚の解剖を進める前に、100ミリリットルのPBSに1.5グラムのアグロスを溶かし、摂氏50度に保ちます。2ミリリットルのマイクロ遠心分離管を縦に切断して、チューブ壁の約4分の1を切り取って、埋め込み型を準備します。溶かしたアグロスを型に流し込み、手触りが少し温まるまで冷まします。

準備ができたら、折りたたまれた吻側の端で鉗子で腸を保持し、型の長さに沿ってアグロスを通して非常にゆっくりと引っ張ります。これにより、アグロセットが組織を動かさずに抵抗し始めるとすぐに組織を放出し、腸の吻側コドルの向きを追跡する間、腸をまっすぐに保つのに役立ちます。次に、型を冷蔵庫に2〜3分置いて完全にセットします。

セットしたら、型からアグロスを取り出し、両端の余分なアグロスを切り取り、腸に対して垂直に切り込みを入れます。アグロスブロックの吻側端をミクロトームの金属ステージに接着し、すべての側面で余分なアロスを切り取ります。次に、振動するミクロトームチャンバーに金属製のステージを取り付けます。

必要に応じて、腸ができるだけ垂直になるようにステージの角度を調整します。試料を氷冷PBSで覆い、マイクロトーンブレードをバッファー表面から数ミリメートル下まで下げます。準備ができたら、最も小さな腸の横方向に200ミクロンの切り込みを入れます。

各アグロスライスに完全な腸切片が含まれていることを確認します。カットしたばかりのスライスを、あらかじめ用意したコラーゲンジェルにそっと沈めます。ナスから神経堤細胞が移動できるように、各ウェルの中央に1つのスライスを置き、スライスを3日間インキュベートします。

この後、コラーゲンジェルのスライスを鉗子で下のジェルを傷つけないように優しく取り除きます。細胞の移動パターンが乱されないようにするには、その後のインキュベーションおよび洗浄ステップでコラーゲンゲルに直接触れないようにすることが重要です。まず、細胞をウェルあたり500マイクロリットルの4%PFAで室温で1時間固定します。

次に、固定液をウェルあたり500マイクロリットルのDPI溶液に交換し、10分間インキュベートします。室温でDPI溶液を慎重に取り出し、500マイクロリットルのPBSで各ウェルを5分間3回洗浄します。最後に、各ウェル内のコラーゲンゲルに埋め込まれた蛍光細胞を撮影します。

この例では、成長因子を使用して、腸管神経皮細胞を発現するGFPの遊走を刺激しました。点線は、説明のおおよそのサイズと場所を表しています。ゲルから取り出す前に、腸管外遊術から移動するGFP発現細胞の数と広がりは、治療済みと未治療の状態で有意に多いことがわかりました。

このビデオを見た後、成長因子を含むコラーゲンゲル上で腸切片をインキュベートすることにより、腸内神経前駆細胞の遊走可能性を決定する方法を十分に理解しているはずです。