Name: マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-18T15:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 学ぼうマウス胚小腸の神経堤細胞を用いた定量細胞遊走アッセイ法。コラーゲンゲル上での培養と蛍光顕微鏡観察により、成長因子応答性の遊走パターンを可視化し、消化管神経系の発生メカニズムを解明する。

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我々は、画像処理と解析アドバイスデニスFlipoに感謝し、デビッド·W·シルバーサイズが実験室でGata4p [5キロバイト]-GFPマウスラインが生成されました。ピロンの実験室での研究はCIHR、NSERC、FRQSとFRQNTによって資金を供給される。

倫理声明マウスを含む実験は医学研究に使用される動物の世話や操作のための動物実験ガイドラインのカナダの評議会後に実施された。動物の操作を含むプロトコルはモントリオールのケベック大学の施設内倫理委員会によって承認された（化委員会Institutionnelデ·保護DES Animaux、参照番号0512-R3-650から0513）。 1。コラーゲンゲルの調製組織培養フードの下で、無菌方式で動作します。 <ol><li>標準的な抗生物質を含む完全な5X DMEM（イーグル改変必須培地）を準備します。のDMEM粉末3.37グラムと水20ml中のNaHCO 3の0.925グラムを溶解する。 0.22μmのフィルターを通すことにより滅菌する。無菌100Xペニシリン/ストレプトマイシン、および滅菌熱不活性化ウシ胎児血清25ミリリットルの2.5ミリリットルを追加します。 4℃で保存する</li><li>氷の上に、800μLをミックス完全5XのDMEM600μlのと1N NaOHを17μlのコラーゲンI溶液（0.02 N酢酸、濾過滅菌中3.77 mg / ml）を。 3ミリリットルの最終容量に滅菌水で希釈します。ミックス内の関連する成長因子が含まれる。私たちは通常、腸NCCの移行を刺激するために10 ngの/ mlでGDNFを使用しています。 </li><li> 24ウェルプレート内の単一行の各ウェルに沈着約480μL。泡を避けてください。残りの行は、細胞遊走に対する他の成長因子の効果を試験するために使用することができる。 </li><li>コラーゲンは、37℃で滅菌インキュベーター中で少なくとも1時間重合しましょ</li></ol> 2。動物16の解剖<ol><li>交配を設定し、翌朝膣栓を確認してください。デイE0.5が膣栓が検出されたその日の正午であること、女性を隔離し、E12.5まで12日待ちます。 </li><li>イソフルランで妊娠マウスを麻酔して、CO 2吸入によって安楽死させる。 </li><li> 70％エタノールでマウスをスプレーします。腹部Sを持ち上げる親族や解剖ハサミで腹腔を開きます。 </li><li>氷冷PBS（リン酸緩衝生理食塩水）を充填したガラスペトリ皿に子宮を除去する。各胚の移植部位を分離するために、個々のdeciduum腫脹との間で横方向に子宮をカット。 </li><li>氷冷PBSで満たされた別のガラスシャーレに別々に移植部位に取り組んでいます。解剖顕微鏡下で、子宮の筋肉層を除去するために細かい鉗子を使用しています。 </li><li>胚を明らかにするために、内臓卵黄嚢と羊膜を開きます。彼らが開発し、腸と密接に絡み合っているように、胎盤/内臓卵黄嚢に胚を結ぶ血管を切断する際には注意してください。 </li><li>首に胚の頭を切断。 </li><li>ただ濃い赤色の肝臓の上に、胚の腹腔内に、閉じた鉗子を挿入し、腹腔内の横方向の開口部を作るために（圧力をかけて停止する）自体の鉗子を開いてみましょう。に向けて開かれた鉗子を引き下げ完全に腹部を開くには、胚の後端。 </li><li>肝臓の背後にある結合組織をつかみ、（コロンは肛門に添付されている）、腸を壊さないように注意しながら、腹部から内臓を引き出します。 </li><li>胚の他の部分から勇気を解放するためにコロンをカット。カットは結腸に沿った任意の位置で行うことができる。後でテール部分を予約。 </li><li>盲腸から結合組織、腸の後、残りの部分を引き出す。そうしながら、腸を巻かないように注意してください。 </li><li>いくつかが存在する場合、肝臓と胃（小腸の吻側端にある）だけでなく、中腎と生殖隆起を切り取る。 </li><li>小腸を分離します。繰り返しますが、腸をニップしないように注意してください。今後は、腸組織のrosrrocaudal向きは頭側の端に存在鋭い曲率を使用して追跡することができます。実施する前に、できるだけ短い時間、室温でPBSで小腸を残す寝具（ステップ3.3を参照）。 </li><li>最終的に、正確に胚発生の段階を決定するために、各胚のための尾体節の数を記録します。 </li></ol> 3。胚性腸の切片<ol><li>胚の解剖を続行する前に100mlのPBS（リン酸緩衝生理食塩水）中に1.5グラムアガロースを融解し、50℃で維持</li><li>埋め込 ​​み型内に注ぐ溶融アガロース（ 例えば、aは約1/4の管壁を切除するために縦に切断された2mlのマイクロ遠心チューブを閉じた状態）。アガロースは、約42〜45℃に冷ましてみましょう、それは触るとわずかに暖かいはずです。 </li><li>ただ、アガロースが固化する前に、胚性腸に埋め込む（これは鉗子の先端を用いて評価することができ、36〜38℃付近が発生します）。折り畳んだ吻側年末までにピンセットで腸を持ち、金型の長さに沿ったアガロースを通​​して非常にゆっくりと引き出します。これはストレートアガロースセットしながら、腸を維持するのに役立ちます。 Tをリリースとすぐに移動しているレジストをし始めると問題。腸の吻側 - 尾側の向きを追跡する。 </li><li>アガロースが完全に設定されていることを確認するために、冷蔵庫、2〜3分で金型を置く。 </li><li> （開かれたエッペンドルフチュー​​ブの外にスライドさせて）金型からアガロースを取り出します。刃で、腸に垂直カットを作り、両端に余分なアガロースを取り出します。 </li><li> /アガロース振動刃ミクロトームの金属ステージを下にブロックし、腸の吻側端を接着します。腸/アガロースブ​​ロックの側面に余分なアガロースをトリミング。 </li><li>振動ミクロトーム室に金属ステージをマウントします。必要に応じて腸をできるだけ垂直になるように（したがって、ブレードに垂直）ステージの角度を調整する。氷冷PBSで標本をカバーしています。バッファ面の下に数ミリまでミクロトームの刃を持参してください。 </li><li>その電子を確保し、尾最も小腸の200ミクロンビブラトーム横カットを作るACHアガローススライスは完全な腸セクションが含まれています。 </li></ol> 4。腸管外植片の文化<ol><li>静かに、各ウェルの中央に向かって1スライスを置く、ピンセットでコラーゲンゲルに新たに切断した腸/アガローススライス、フラットを堆積させる。 </li><li>外植片からNCCの移動を可能にするために、湿った5％CO 2雰囲気中、37℃で3日間インキュベートする。 </li><li>ピンセットで非常に優しくコラーゲンゲルから腸/アガローススライスを取る。以下のゲルを損傷しないように注意してください。 </li><li>細胞移動パターンが妨げられないことを確実にするために、その後のインキュベーションおよび洗浄ステップの間に直接コラーゲンゲルに触れないようにしてください。室温でよく、1時間あたりの（PBS中）を4％PFA（パラホルムアルデヒド）500μlで固定してください。 </li><li>ウェルあたり500μlのDAPI（4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール）溶液（PBS中の5μg/ ml）を用いて固定液を交換し、室温で10分間インキュベートする。 </li><li>各ウェル3Xを洗う5分間のPBS500μlで。 </li><li>各ウェル内のコラーゲンゲル内に埋め込まれた蛍光細胞（GFPおよびDAPIチャネル）写真。 </li></ol> 5。画像解析私たちは、移植片培養した後に生成された画像を処理し、定量化するためにImageJの17の大規模な使用をした。 <ol><li>蛍光細胞写真と同じ倍率でマイクロスライドを画像化することから始めます。 （ストレートライン·ツールを使用して）ピクセル単位で1ミクロンの長さを測定します。 </li><li> （/設定スケールを分析、ピクセル/ミクロンの入力数）スケールを設定します。 </li><li>各GFP蛍光写真は、8ビットグレースケール（Image/Type/8-bit）に画像形式を変更します。 </li><li>信号（画像/調整/明るさ/コントラスト）の強さを調整します。 </li><li>必要に応じて（;ローリングボールの半径を調整プロセス/背景を引く）、バックグラウンドノイズを差し引く。 </li><li>細胞および細胞塊を（画像/ /しきい値を調整）、ハイライト表示し、しきい値を設定するN塊（プロセス/バイナリ/流域）を分割するために流域を適用します。 </li><li>関心領域（ROI）を指定し、細胞数の統計情報を生成する粒子を分析（粒子を分析/分析、設定されたサイズの最小値は、残りのピクセルを除外する）。 </li><li>フェレ径（/セット測定の分析）を含むように、測定オプションを設定します。 </li><li>グループのROIと、フェレ径を決定するために、全体として細胞の広がり（ANALYZE /ツール/ ROIマネージャー/詳細/ OR、そしてROIマネージャー/追加し、ROIマネージャー/測定）の指標を測定します。 </li></ol>

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<li>Byth, K. F., Thomas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AZD5438%2C+a+potent+oral+inhibitor+of+cyclin-dependent+kinases+1%2C+2%2C+and+9%2C+leads+to+pharmacodynamic+changes+and+potent+antitumor+effects+in+human+tumor+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">AZD5438, a potent oral inhibitor of cyclin-dependent kinases 1, 2, and 9, leads to pharmacodynamic changes and potent antitumor effects in human tumor xenografts.</a> Mol. Cancer Ther. 8 (7), 1856-1866 (2009).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

我々のex vivoでの外植片培養技術を正確GDNFの存在下で腸溶性NCCの移行の可能性を定量化するために使用することができる方法を示す。このような正確な定量が大幅に以前に11,12,15を説明するように、厚さ200μmのビブラトーム腸のセクションを使用しての代わりに、おおよその大きさの大部分によって容易になる。確かに、これは、私たちは再現性の高い環境でのセルの合理的な数で作業することができます。注目すべきは、外植片切片が切断される小腸の尾最領域内の蛍光腸溶NCCの均一な分布は、単一の消化管（ 図1A）からの複数のセクションの分析を可能にする。また、腸NCCと軸索の両方が培養期間の終了時に、このようなアッセイ11、外植片の撤退で組織を終了することができ、私たちは渡り鳥NCCのみに集中することができますことを考える。 最も重要なステップは、しかし、Wのように、プロトコルテキストに概説された腸管外植片のelfareは、特定の注意が必要、健康的な移行NCCを得るために最も重要です。腸アガロース...

神経堤細胞（NCC）は、胚発生の間に多くのデリバティブを形成している脊椎動物に特有の過渡的な細胞型である。この細胞集団は、非神経外胚葉1に隣接して、神経板の境界で生じる。神経胚形成の間に、神経板の曲げ成形神経管の背側縁に沿って、NCCが配置されます。 NCCは、その後分離し、離れて神経管からの移行、上皮間葉転移を受ける。 NCCは、彼らが全体の腸管神経系（ENS）、腸の壁に埋め込まれた神経の神経節の相互接続されたネットワークを形成し、消化管を含む様々な胚の構造を、植民地化。最近2,3日のように、多くの遺伝子がこの複雑な構造の開発に携わってきました。 ENSのほとんどは（ つまり、将来の後脳/脊髄の境界付近）迷走神経管からのNCC発信の小さなプールに由来している4。これらの神経前駆細胞は、マウスでは胎生（E）9.0を中心に前腸に到達してから、全体胚性腸にコロニーを形成するのに約e15.0までの消化管間葉内で尾側に移行します。結腸の神経前駆細胞の小サブセットはまた、最大盲腸4と反対方向に後方腸に侵入仙骨NCCによって提供される。迷走神経と仙骨の両方NCCは、ENSの完全な形成を確実にするために、複数の移行、増殖、生存および分化を促進する手がかりが必要になります。 GDNF（グリア細胞由来神経栄養因子）、エンドセリン-3、ニューロトロフィン3、BMPは（骨形成タンパク質）、ネトリン：この点では、動物モデル - - 特に遺伝子改変マウスは、いくつかの不可欠な細胞外リガンドの同定に尽力されてきただけでなく、ソニックとインディアンヘッジホッグ（ShhおよびIhhは）5月10日 。これらのうち、（トランスフェクション中に再配列）チロシンキナーゼ膜貫通受容体を介したシグナル伝達RET GDNFは番目として認識される胚性腸へと内魅力とNCCの指導のための電子の最も重要な経路。 GDNFは消化管間葉から分泌され、RET 11,12を表現腸NCCに直接化学誘引である時空間的に制御rosrrocaudal勾配を形成している。 他の機能の中でも、ENSは、腸壁内の平滑筋との相互作用を介して、消化管内での移動を規制する。ヒルシュスプルング病における腸結果の末端領域の神経の神経節が存在しない場合：影響を受けたセグメントの強壮収縮が詰まり、消化された材料の上流に蓄積し、腸や腹部の大規模な膨満につながる。ヒルシュスプルング病は、およそ1 5000での出生数を発生します。腸溶NCCの吻側 - 尾側移行パターンは、ヒルシュスプルング病の病因に主要な寄与因子であると考えられている。コロン、NCCの移行のソースから最も遠いとBの最後の部分植民地化されるowelは、ENS形成における欠陥の影響を最も受けている。腸溶NCC遊走におけるその重要な役割に応じて、GDNF / RETシグナル伝達の破壊は、ヒルシュスプルング病13の主既知の遺伝的原因である。 [5キロバイト]-GFP 14 Gata4p命名- -回遊NCCは、緑色蛍光タンパク質（GFP）で標識された良好なNCCとENSの発達を研究するために、我々は、トランスジェニックマウス系統を生成した。我々は次に、現在では、GDNFのような種々の成長因子の存在下で腸溶性NCC移行電位の正確な定量化を可能にする他のグループ11,12,15によって発表された研究から適合ex vivoでの細胞遊走アッセイを、完成。

<table><tbody><tr><td>DMEM粉末</td><td>Wisent</td><td>219-010-XK</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Bioshop</td><td>SOB999</td><td>バイオテクノロジーグレード</td></tr><tr><td>Steriflip 真空ろ過システム (0.22 ミクロン)</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Wisent</td><td>450-201-EL&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Wisent</td><td>095-150</td><td>高品質グレード</td></tr><tr><td>コラーゲン I</td><td>BD バイオサイエンス</td><td>354236</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Bioshop</td><td>SHY700</td><td>10 Nストックから希釈し、無菌ろ過した</td></tr><tr><td>GDNF</td><td>シダーラン</td><td>CLCYT305</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ファルコン24ウェルプレート</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>353047</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>解剖ハサミ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>089515</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスペトリ皿</td><td>VWR</td><td>89000-306</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>細胞培養グレード</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>M125</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>デュモン#5鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-20</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>バイオショップ</td><td>AGA001</td><td>バイオテクノロジーグレードの</td></tr><tr><td>外科用ブレード</td><td>フェ</td><td>ザー21</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>万能インスタントクレイジーグルーペン</td><td>クレイジーグル</td><td>ーKG824</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HM 650V 振動ブレードミクロトーム</td><td>Thermo Scientific</td><td>920110</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>D9564</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">特定の試薬と機器の表.</td></tr></tbody></table>

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

A Quantitative Cell Migration Assay for Murine Enteric Neural Progenitors

神経堤細胞（NCC）は、背側神経管に由来し、開発脊椎動物の胚全体で広範囲に移動し、一過性および多能細胞集団である。末梢グリアおよびニューロンを提供することに加えて、NCCはメラノサイトだけでなく、頭蓋顔面骨格の大部分を生成します。 NCC遊走および分化は、神経管に沿った軸方向の原点と地域の異なる細胞外の合図への曝露との組み合わせによって制御される。細胞外のリガンドのような貢献は、腸神経系（ENS）、ローカルに（特に）を制御する神経核の複雑な相互接続されたネットワーク腸の筋肉の動きや腸の運動を形成する際に特に顕著である。尾ファッションに吻側に - - 将来の腸の全長にENSのほとんどが植民地化するために長い旅に着手するNCCの小さな初期プールに由来している。知られているいくつかのシグナル伝達経路のうち、腸NCCのコロニー形成に影響を与え、GDNF / RETシグナル伝達は、最も重要なものとして認識されている。確かに、消化管間葉によるRETリガンドGDNFの時空間的に制御された分泌は、胚性腸へと内誘引およびRET発現腸NCCの指導のために主に責任があります。ここでは、GDNFを含む様々な成長因子の存在下で腸溶性NCC移行電位の正確な定量化を可能にする蛍光標識されたNCCを有するトランスジェニックマウス系統を利用して、ex vivoでの細胞遊走アッセイを記載している。

以下の結果は、ここで記載された技術（ 図1）で得られるものの代表である。増殖因子の使用（ すなわち、GDNF）は、腸の外植片からコラーゲンゲル（ 図2）にGFPを発現する腸溶性NCCの遊走を刺激する。一部の細胞は、成長因子の非存在下で外植片から出てくるが、これらは主にGFP-標識されず、パッシブエントリーを表す。この組織はまだ頻繁に蛍光細胞によって取り込まれ、そうでなければ下にコラーゲンに横たわってセルを非表示になるように、それは、結果を記録するために、コラーゲンゲルから腸スライスを除去する必要がある。これらの結果の定量は、GDNFが存在する場合、より多くの細胞がコラーゲンゲル内に見出されることを示し、その活性な移行が（ 図3）で行われる。確かに、受動的な細胞は腸管スライスの径内、WHER、すぐに外植片の下で発見された<html>積極的にコラーゲンゲルに侵入EAS細胞が離れてそれらの起源の点から移動して、さらに広がった。 <p class="jove_content" fo:keep-together.with...

我々は、様々な成長因子の存在下での腸溶神経堤細胞の遊走電位の正確な定量を可能にex vivoで細胞遊走アッセイを提示する。

Neural crest cells (NCC) are a transient and multipotent cell population that originates from the dorsal neural tube and migrates extensively throughout ...

本手順の全体的な目的は、さまざまな成長因子の存在下における腸管神経前駆細胞の遊走能を定量化することです。まず、蛍光標識された神経堤細胞が存在するマウス胚の小腸を解剖します。次に、振動ミクロトームを用いて、小腸の厚さ 200 micron の切片を作製します。次に、これらのスライスを成長因子を含むコラーゲンゲルの上に載せてインキュベートします。最終ステップとして、スライスを剥離し、その下の遊走細胞を露出させます。最終的に、蛍光顕微鏡を用いて、コラーゲンゲル内における遊走細胞のパターンを観察します。この手法は、末梢神経系の形成の基礎となるさまざまなシグナル伝達経路間の相互作用についての理解を深めるなど、発生生物学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。膣栓が確認されてから12日後、雌マウスを安楽死させ、子宮を取り出して氷を満たしたガラス製のペトリ皿に入れます。冷PBS中で、解剖顕微鏡下で子宮を個々の子宮膨隆の間で横方向に切断して各胚着床部位を分離し、精密ピンセットを用いて子宮の筋層を取り除きます。内臓卵黄嚢と羊膜を開き、胚を露出させます。胚を卵黄嚢に繋いでいる血管は、発達中の腸と絡み合っているため、切断する際に注意してください。次に、暗赤色の肝臓のすぐ上の腹腔内に閉じた鉗子を挿入し、そこで鉗子を開きます。これにより、腹腔に横方向の開口部が形成されます。開いた鉗子を胚の後端に向かって下に引き、腹部を完全に開きます。開口後、肝臓の後方にある結合組織を掴み、内臓を取り出します。腸を傷つけないように注意しながら、結腸の任意の箇所を切断し、胚の残りの部分から腸管を切り離します。尾部は後で使用するため、残しておきます。小腸の吻側端において、組織を傷つけないよう注意しながら、盲腸および腸管から結合組織を慎重に剥離します。肝臓と胃に加え、中腎および生殖堤が存在する場合はそれらも切り離します。最後に、盲腸と結腸、および残りの結合組織を切り離して、小腸を単離します。前と同様に、腸に切り傷をつけないよう注意してください。包埋する前に、小腸を室温のPBSに浸しておく時間はできるだけ短くしてください。胚を首の部分で切断した後、尾部の体節数を記録し、胚発生のステージを正確に判定します。胚の解剖に進む前に、1.5 gramsのagrosを100 millilitersのPBSで溶解させ、50 degrees Celsiusで保持します。2 millilitersのマイクロ遠心チューブを縦方向に切り、チューブ壁の約4分の1を切り出して包埋用モールドを作成します。溶解したagrosをモールドに注ぎ、触れたときにわずかに温かいと感じる程度まで冷却させます。準備が整ったら、ピンセットで腸の折りたたまれた吻側端を保持し、モールドの長さに沿ってアグロスの中を非常にゆっくりと引き抜きます。これにより、アグロスが凝固するまで腸を真っ直ぐに保つことができます。組織が移動に抵抗し始めたらすぐに離し、腸の吻側方向の向きを確認し続けてください。次に、モールドを冷蔵庫に2～3分間置き、完全に凝固させます。凝固後、アグロスを型から取り出し、腸に対して垂直に切断して両端の余分なアグロスを切り揃えます。アグロスブロックの吻側端をミクロトームの金属ステージに接着し、全辺の余分なアグロスを切り揃えます。次に、金属ステージを振動ミクロトームチャンバーに取り付けます。必要に応じてステージの角度を調整し、腸が可能な限り垂直になるようにしてください。氷冷PBSで検体を覆い、マイクロトームの刃をバッファー表面から数mm下に降ろします。準備が整ったら、小腸の遠位端を200 micronの厚さで横断的に切断してください。各アグロスライスに腸管の全断面が含まれていることを確認します。切り出したばかりのスライスを、あらかじめ準備したコラーゲンゲル上にそっと配置します。神経堤細胞がアグロスライスから遊走できるように、各ウェルの中央付近にスライスを1枚ずつ配置し、3日間インキュベートします。この時間経過後、下のゲルを傷つけないように注意しながら、ピンセットでスライスをコラーゲンゲルから慎重に剥がします。細胞の遊走パターンを乱さないようにするため、その後のインキュベーションおよび洗浄ステップでは、コラーゲンゲルに直接触れないことが重要です。まず、1ウェルあたり500 µLの4% PFAを用いて、室温で1時間細胞を固定します。次に、固定液を1ウェルあたり500 µLのDPI溶液に交換し、10分間インキュベートします。室温でDPI溶液を慎重に取り除き、各ウェルを500 µLのPBSで5分間、3回洗浄します。最後に、各ウェルのコラーゲンゲルに埋め込まれた蛍光細胞を撮影します。この例では、増殖因子を用いてGFP発現腸管神経堤細胞の遊走を刺激しました。点線は、外植片の概ねのサイズと位置を示しています。ゲルから取り出す前に、腸管外植片から遊走するGFP発現細胞の数と拡散範囲を調べたところ、未処理条件と比較して処理条件において有意に大きいことが分かりました。このビデオを視聴することで、成長因子を含むコラーゲンゲル上に腸管切片を培養し、腸管神経前駆細胞の遊走能を判定する方法について深く理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。...

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

このプロトコルは、吻側渡り鳥ストリームにおける出生後の脳および神経芽細胞の遊走の高解像度のタイムラプスイメージングに最適化された器官スライスのアッセイを説明します。...

出生後の脳における神経細胞の移動の高分解能タイムラプスイメージングのための器官型スライスアッセイ

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。...

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

このビデオは、ニューロスフィアからの神経前駆細胞の移動応答を研究するin...

NPC Neurosphere Assay:ニューロスフィアからの神経前駆細胞の遊走応答を評価するためのIn Vitroアッセイ

ここでは、SCが伸びる軸索に沿って開発することができますているシュワン細胞（SC）の遊走アッセイを記述します。...

成長中の軸索に沿ってマウスのシュワン細胞の発達を分析する

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経新生に重要なステップです。プロトコルは、ここに記載DNA /低分子ヘアピンRNA（shRNAは）ヌクレオおよびげっ歯類生後吻側遊走性流から単離された神経芽細胞を用いた3次元遊走アッセイを用いることにより、神経芽細胞遊走の候補調節因子の役割を調査するために使用することができる。...

神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ<em&gt;インビトロ</em

神経幹/前駆細胞（NPCの）の移植は、再生神経学に大きな約束を保持している。のNPCの全身送達は、脳および中枢神経系の実験的慢性炎症性損傷の影響を受け齧歯類およびヒト以外の霊長類の脊髄に幹細胞を提供するために効果的な、侵襲的な低、かつ治療に非常に効果的なプロトコルになっています。...

慢性EAEを有するマウスにおける神経幹/前駆細胞の全身注射

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

増殖、移行、および神経突起伸長はしばしば脳神経疾患で摂動など発達のプロセスします。このように、迅速かつ再現性をもって人間の iPSC 由来の Npc でこれらの神経発達のプロセスを評価するためのプロトコルを提案する.これらのプロトコルには、NPC...

ひと神経前駆細胞 (Npc) における神経発達学的表現型の迅速な検出

我々は、3つの単純なインビトロアッセイ-長距離移動アッセイ、共培養移行アッセイ、および化学誘引アッセイ-それは、ヒト幹細胞由来の心室内皮細胞とその機能を一括して評価するGABAergic インターニューロンとの相互作用.

ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABAergicニューロンの移動、化学誘引、共培養アッセイ

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぼうマウス胚小腸の神経堤細胞を用いた定量細胞遊走アッセイ法。コラーゲンゲル上での培養と蛍光顕微鏡観察により、成長因子応答性の遊走パターンを可視化し、消化管神経系の発生メカニズムを解明する。

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

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