エクソンキャプチャと超並列配列決定することにより腫瘍標本における体細胞遺伝子変異を検出する

この手順の全体的な目標は、バーコード化されたマルチプレックスDNAライブラリとそれに続く超並列シーケンシングを使用して、腫瘍組織からの細胞のがん関連遺伝子の体細胞変異を特定することです。これは、最初にバーコード付きシーケンシングアダプターを保存された腫瘍から単離されたDNA断片にライゲーションすることによって達成されます。手順の2番目のステップは、279のがん遺伝子および腫瘍抑制遺伝子のすべてのタンパク質コーティングエクソンに相補的なカスタムビオチン化オリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションです。

3番目のステップは、キャプチャされたライブラリからバーコードプールの超並列シーケンスを実行することです。最後のステップは、279の標的遺伝子のがん関連変化の配列データを検索することです。この手順により、配列の突然変異、小さな挿入、小さな欠失、コピー数の変化、および選択した構造の変化を明らかにすることができます。

したがって、既存の方法に対するこの手法の主な利点は、一般的な突然変異とまれな突然変異の両方についてエクソン全体を調査できるだけでなく、コピー数の損失や増加などの追加のゲノム変化を特定し、不均一なサンプルでより高い感度を達成できることです。この方法は、さまざまな種類のがんの主要なドライバー変異は何か、臨床検体のこれらの変異は標的療法の結果や反応と相関しているかなど、がんゲノミクス分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の意味するところは、突然変異がプロスペクティブに特定され、患者を適切な治療や臨床試験に導くために使用される可能性があるため、がんの診断と治療にまで及びます。

ビーズからDNAを洗い流して逃亡する際に必要な注意技術のために、ミツバチのクリーンステップを学ぶのが難しいため、この方法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です エンドリペアマスターミックスを準備します。適切な容量を混合して、サンプルあたり50マイクロリットルになるようにします。各シアーDNAの50マイクロリットルをID 6ウェルプレートの別々のウェルに分注します。

次に、調製したエンドリペアマスターミックスを50マイクロリットルずつ各反応に加え、プレートをサーモサイクラーで摂氏20度で30分間インキュベートして反応をクリーンアップします。まず、各サンプルに200マイクロリットルのAMPピュアXPビーズを加え、マルチチャンネルピペッターを使用して全容量を10回上下に静かにピペットします。これに続いて、プレートを室温で15分間インキュベートします。

次に、プレートを磁気スタンドに移し、室温で15分間透明にします。クリアしたら、ビーズを乱さないように注意しながら、ほとんどの上清をそっと取り除いて捨てます。ウェルに液体が残っている場合があります。

次に、調製したばかりの80%エタノール200マイクロリットルを各サンプルに静かに加え、プレートを室温で30秒間インキュベートします。エタノールを慎重にピペットで取り除き、もう一度洗浄を繰り返します。次に、プレートを室温で乾燥させ、すべてのアルコールが逃げるまで待ちます。

次に、乾燥したビーズを44.5マイクロリットルの滅菌水に再懸濁します。最後の排出で、各サンプルをピペットに10回静かに流します。ウェルの側面に付着したビーズを洗い流します。

次に、水に懸濁したビーズを室温で2分間インキュベートし、ウェルが透明になるまで5分間磁気スタンドに移します。最後に、サンプルを含む各ウェル内の透明な上清42マイクロリットルを新しいウェルに静かに移します。サンプルは、摂氏マイナス20度で最大1週間保存できるようになりました。

まず、滅菌済みのマイクロ遠心チューブでDテーリングマスターミックスを調製します。調製したDAテーリングマスターミックスを8マイクロリットルで、末端修復DNAの各ウェルに加えます。次に、プレートをサーモサイクラーで摂氏37度で30分間インキュベートし、反応をクリーンアップします。

前のセクションで概説したのと同じプロセスを2倍の容量で使用し、Resusがビーズを33.75マイクロリットルの滅菌水に懸濁して仕上げます。この時点で、サンプルは摂氏マイナス20度で最大1週間保存できます。続行するには、反応ごとに15マイクロリットルのライゲーションマスターミックスを調製します。

15マイクロリットルのライゲーションマスターミックスを、DテールDNAを含む各ウェルに加えます。次に、適切な25マイクロモルの1.25マイクロリットルを追加します。次はフレックスバーコードアダプター。

それぞれに、まあ、各サンプルは別々のバーコード付きアダプターを受け取るべきです。アダプターをロードしたら、プレートを摂氏20度で15分間インキュベートします。ここで、50マイクロリットルのビーズを使用して、アダプター後のライゲーションクリーンアップを行い、サンプルを滅菌水で50マイクロリットルに再懸濁します。

次に、23マイクロリットルの水で仕上げるクリーンアッププロセスをもう一度行います。この時点で、サンプルは摂氏マイナス20度で最大1週間保存できます。次のステップは、氷融に関するテキストプロトコル、ユニバーサルおよびインデックスオリゴヌクレオチドブロッカー、CCAP easyライブラリー、およびcon TNA two Xハイブリダイゼーションバッファーおよびハイブリダイゼーションコンポーネントを含む機敏なGenキャプチャコンポーネントで詳しく説明されている各サンプルのライブラリ増幅です。

A.次に、ライブラリ調製に使用した特定のバーコードアダプター配列に対応するインデックスオリゴヌクレオチドブロッカーの1ミリモルプールを調製します。各ブロッカーの1マイクロリットルを組み合わせ、10秒間一緒に渦巻きにします 新しい1.5ミリリットルのチューブで、1ミリリットルあたり1ミリグラムのコンテAの5マイクロリットル、ユニバーサルブロッカーの2マイクロリットル、およびブロッカープールの2マイクロリットルからなるキャプチャミックスを準備します。24のバーコード付きライブラリを1つの反応にプールします。

合計1〜3マイクログラムのプールされたバーコード付き配列ライブラリをキャプチャミックスに追加します。20ゲージ以下の針速度を使用してキャップに15〜20個の穴を開け、DNA真空濃縮器で混合物を摂氏60度で完全に乾くまで真空にします。次に、ハイブリダイゼーションバッファーとハイブリダイゼーションコンポーネントAの混合物を再水和し、キャップの穴をテープで覆い、サンプルを10秒間ボルテックスします。

次に、混合物を最高速度で10秒間遠心分離します。次に、混合物を摂氏95度で短時間インキュベートしてDNAを変性させます。これに続いて、0.2ミリリットルのPCRストリップチューブに室温で最高速度で10秒間遠心分離し、2.25マイクロリットルのccap Easy Library Captureプローブを同量の滅菌ヌクレアーゼフリー水に混ぜます。

次に、遠心分離機で反応反応でチューブに混合し、ピペットチップに全量を10回静かに流します。次に、0.2ミリリットルのチューブを摂氏47度のサーマルサイクラーで48〜96時間インキュベートします。サーマルサイクラーの蓋の温度を摂氏57度に維持して蒸発を防ぎ、数日後の反応温度を安定させます。

捕捉したDNAの洗浄と回収の手順を使用します。次に、修正されたRoche Nimble Genプロトコルを使用して、量子ビット高感度アッセイを使用して増幅された捕捉DNAを定量することにより、捕捉されたDNAフィニッシュを増幅します。12の腫瘍正常ペアを含む24のバーコード付き配列ライブラリーの1つのプールを、279のがん遺伝子のプローブを使用して捕捉し、2×75として配列決定しました。

HighSeq 2000フロー細胞腫瘍と正常ライブラリーのシングルレーン上の塩基ペアリードは、2対1の比率でプールされました。IGV画像は、肺がんのEGFRのエクソンにおける配列カバレッジの特異性を示しており、灰色のバーはユニークな配列リードを表しています。右のヘテロ接合型T2G変異は、リードの24%に存在し、それが体細胞L8 58Rアミノ酸置換であることを示しています。

正常な肺組織の読み取りのいずれもこのTTA G変異を示さず、結腸直腸癌腫瘍の一部のインデル、正常なペアはPCでの体細胞フレームシフト挿入または7塩基対の体細胞フレームシフト欠失を示しました。TP 53では、腫瘍正常ペア間でもコピー数の変化が認められた。各データポイントは、279の標的遺伝子からの単一のエクソンを表しています。

コピー数の増加と損失は、腫瘍配列のカバレッジの増減から推測されます 一度習得すると、この手法は、適切に実行された場合、共有ライブラリの準備に6時間半、キャプチャハイブリダイゼーションに48〜96時間で実行できます。このアッセイを行うことは非常に重要ですが、データ解析を混乱させる可能性があるため、ライブラリ調製中の汚染物質に注意することが非常に重要ですが、この手順に続いて、サンガーシーケンシングやフラグメント解析などの他の方法を実行して、疑わしい変更をどのように検証するかなどの質問に答えることができますか?このビデオを見れば、バーコード付きDNAライブラリの調製方法と、これらのプールライブラリでExxonキャプチャを実行する方法について十分に理解できるはずです。