Name: トウモロコシとテオシンテ線における ウスチラゴ の病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-03T18:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: 学ぶ、ニードル注射法によるトウモロコシとテオシンテへのUstilago maydis接種技術。植物病理学における病原菌送達と抗病性スクリーニングの効率的な手法を習得できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

エミール・イスラモビッチ博士の研究室と温室支援に感謝します。また、シェリー・フリント・ガルシア博士がトウモロコシ×テオシンテのイントログレスラインを提供してくれたことに感謝します。

1. 植物材料の成長
<ol><li>接種とスクリーニングのための植物ラインを選択します。この作業には、2つのトウモロコシライン、5つのテオシンテライン、および40のトウモロコシxテオシンテ線が、この作業に使用された。</li>
	<li>実験用植物種子(U.maydis 注射)および制御(水注入)針注入接種実験。各プラントラインに対してこれを行います。</li>
	<li>小さなフラットに各植物ラインの4つの種子(複製)を植える指で約1/2インチの種子を土に押し込み、軽く土で覆う(図1Aと 1B)。土を種の上に詰めないでください。種を深く植えたり、種の上に土を詰め込んだりすると、苗の出現に問題が生じる可能性があります。</li>
	<li>種子を土に水を入れます。土壌が浸され、種子が水を浸した後も土壌の下に残っていることを確認してください。</li>
	<li>水をやった後、昼と夜の環境で植物を配置し、昼と夜の環境は28/20°Cの温度と14/10時間の光周期、キャノピーの上部に約500 μmol/m2秒   の光合成活性放射線。昼夜の相対湿度を、それぞれ約70%と90%に保つ。</li>
	<li>すべての植物を同じ成長室に保管して、実験全体で一致する成長環境を維持します。</li>
	<li>10日後、成長チャンバーから植物を取り出し、針注射接種法を用いて U.maydis 細胞懸濁液培養で植物を接種する。注:トウモロコシ植物は、植え8-10の7日後に接種することができます。しかし、テオシンテ植物は7日後には小さすぎる。したがって、実験内で一貫性を保つため、植え付けの10日後にトウモロコシとテオシンテ植物の両方を接種する(ステップ2.12参照)。</li>
</ol>2. 針注射接種
<ol><li>すべての作業は、ラミナーフローフードで行います。冷凍庫の貯蔵から U.メイディス グリセロールストックを除去します。ジャガイモのブドウ糖アガー(PDA)プレートに、無菌ループおよびストリークグリセロールストックを 使用して、野生 型菌株1/2(交配型a1b1)と2/9(交配型a2b2、アイソジェニックに近い1/2)を使用します。株を別々に維持します。</li>
	<li>PDAプレートを30°Cインキュベーターに 2日間、U.maydis で縞に入れてください。異なる生物栄養病原体を使用する場合は、適切な株、培地および成長条件を使用する。2日間の病原体の成長を監視して 、U.maydis 株が良好に成長していることを確認します。</li>
	<li>2日後にインキュベーターからPDAプレートを取り出します。プレートは、良好な病原体の成長を有し、単一のコロニーを含む必要があります (図 2A).単一のコロニーを得ることが重要です。単一コロニーが存在しない場合は、より低い濃度でプレートを再縞する。</li>
	<li>ラミナーフローフードですべての作業を行います。PDAプレートから各株のための単一のコロニーを選択するために無菌爪楊枝を使用してください。1つのコロニーを含む爪楊枝を3mlポテトデキストローススープ(PDB)に入れる。2-3の文化を持つことをお勧めします。</li>
	<li>3ml PDB培養物を30°Cインキュベーター/シェーカーに200rpmで2日間置きます。2日間の培養の成長を監視し、文化の成長を確実にします。カルチャは非常に曇っているように見えるはずです。</li>
	<li>インキュベーター/シェーカーから液体培養液を取り出し、OD600で濃度を測定し、細胞が1.0(〜1 x 107細胞/ml)のODに成長したことを確認した。</li>
	<li>U.maydis細胞懸濁液培養液を、最終的な30ml培養量の水を使用して、1 x 106細胞/mlの最終濃度に持ち込みます。この濃度は、一貫して病原体細胞懸濁液培養で植物の良好な感染をもたらす。17
</li>
</ol>注: 様々な細胞懸濁液濃度は、接種に必要な適切な細胞の標的を決定するために異なる病原体株を使用する場合にテストする必要があります18,19.細胞懸濁液培養に対する与えられた最終濃度は、ちらつきの出発点として使用することができる。病原体細胞懸濁液培養の適切な濃度は、良好な感染を有する植物表現型を可視化することによって検証されるべきである(図3A-E)。
<ol start="8"><li>接種前に2つの U.の 同量を混合する。1つの病原菌株を使用する場合は、ステップ2.9に進む。各接種実験に対して新鮮な U.maydis 細胞懸濁液培養液を調製し、2日後に細胞懸濁培養を廃棄する。</li>
	<li>実験的な注射接種のために、細胞懸濁液培養液を注射器に引き込み 、U.maydis 細胞懸濁液で3mlシリンジを充填する。</li>
	<li>制御針注射接種の場合、3mlシリンジを水17で満たす。実験用注射接種に同じ手順を使用してください。</li>
	<li>各3 ml シリンジの端に0.457 mm x 1.3 cmの皮下注射針を取り付けます。選択された針のサイズは植物のティッシュへの最低の損傷と植物葉の間の細胞懸濁液の培養を提供する。</li>
	<li>注射の注射に備えて植え付けの10日後に成長室から実験および制御植物を取り除く(図2B)(ステップ1.7を参照)。</li>
	<li>U.maydis細胞懸濁液培養液を含む皮下注射針を、土壌ラインのすぐ上の90°の角度で実験プラントの茎に慎重に挿入します。針が茎の真ん中に入るまで挿入します。針をステム(図2C)に押し込んではいかない。</li>
	<li>実験プラントに約100μlの U.maydis 細胞懸濁液培養18,19を注入する。これは苗の高さによって若干異なります。細胞懸濁液は茎を押し通し、植物の渦に移動します。細胞懸濁液は、植物の渦中に見える。3 ml シリンジが空になるまで、各植物に細胞懸濁液培養液 100 μl を注入し続けます。</li>
	<li>注射後、慎重に植物茎から針を取り除きます。今空の3 mlシリンジから針を取り出し、水で満たします。針を注射器に戻し、針先に引っ掛かるかもしれない植物組織を取り除くために針を通して水を押します。</li>
	<li>各実験プラントについて、手順 2.9 ~2.15 を繰り返します。水を注入することにより、制御プラントの同じプロトコルに従ってください。</li>
	<li>接種した実験および制御プラントを成長室に戻します。植物組織ではなく土壌を湿潤させることによって植物に毎日水を与える。</li>
	<li>病原体の開発と植物抵抗反応を検出するために毎日植物をチェックしてください。</li>
</ol>3. 抵抗反応スクリーニング
<ol><li>1~5抵抗反応評価スケールを用いて、接種後(dpi)後の各植物の抵抗反応をスコア付けして記録します。格付けスケール上の数値が増加するにつれて疾患の重症度が増加する(表2)。1C(葉緑化)、1A(葉アントシアニン産生)、または2(小葉の胆汁)抵抗性反応は抵抗性を示す。A 3 (茎の胆汁)、4(基底胆汁)、または5(植物死)抵抗反応は感受性を示す(図3A-Eおよび表2)18,19。</li>
	<li>実験と制御植物の両方をスコアし、抵抗反応評価を記録します。</li>
	<li>実験プラントと制御プラントの抵抗反応を比較します。1C、1A、または2の抵抗反応評価を有する実験プラントを選択します。これらの植物は 、U.maydis18,19に耐性であると考えられています。</li>
	<li>実験全体を繰り返して、植物の表向きを確認します。</li>
</ol>

<ol><li>Smith, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+fungal+resistance+developed+using+genetic+engineering+and+antifungal+proteins+from+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Crop fungal resistance developed using genetic engineering and antifungal proteins from viruses.</a> , ISB News. report 
 
 <a target="_blank" href="http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf">http://www.isb.vt.edu/news/2011/nov/cropfungalresistance.pdf</a> (2011).</li>
<li>Sher, A. F., MacNab, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSher%2C+AF+%22Vegetable+diseases+and+their+control%22">Vegetable diseases and their control</a>. , 2, John Wiley & Sons Inc. New York, NY. 223-226 (1986).</li>
<li>Crepet, W. L., Feldman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+earliest+remains+of+grasses+in+the+fossil+record%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Bot%22%5BJournal%5D)">The earliest remains of grasses in the fossil record.</a> Am. J. Bot. 78, 1010-1014 (1991).</li>
<li>Iltis, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+evolution+and+agricultural+origins%5BTitle%5D)+AND+%22Grass+systematic+and+evolution%22%5BJournal%5D)">Maize evolution and agricultural origins.</a> Grass systematic and evolution. Scoderstrom, T. R., Hilu, K. W., Campbell, C. S., Barkworth, M. E. , Smithsonian Institution Press. Washington D.C.. 195-213 (1997).</li>
<li>Mangelsdorf, P. C., Reeves, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+corn.+III.+Modern+races%2C+the+product+of+tesonite%5BTitle%5D)+AND+%22Bot.+Mus.+Leafl.%22%5BJournal%5D)">The origin of corn. III. Modern races, the product of tesonite.</a> Bot. Mus. Leafl.. 18, 389-411 (1957).</li>
<li>Agrios, G. N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAgrios%2C+GN+%22Plant+Pathology%22">Plant Pathology</a>. , Academic Press. New York. (1997).</li>
<li>Dean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+top+10+fungal+pathogens+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology.</a> Mol. Plant. Pathol. 13, 414-430 (2012).</li>
<li>Estrada, A. E., Jonkers, W., Kistler, H. C., May, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+beteen+Fusarium+verticillioides%2C+Ustilago+maydis%2C+and+Zea+mays%3A+An+endophyte%2C+a+pathogen%2C+and+their+shared+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Fung.+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">Interactions beteen Fusarium verticillioides, Ustilago maydis, and Zea mays: An endophyte, a pathogen, and their shared plant host.</a> Fung. Genet. Biol. 49, 578-587 (2012).</li>
<li>Freeman, S., Rodriguez, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+assessing+pathogenicity+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp+niveum+and+F.+o.+melonis+on+cucrbits%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Dis%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp niveum and F. o. melonis on cucrbits.</a> Plant Dis. 77, 1198-1201 (1993).</li>
<li>Gottwald, T. R., Graham, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+device+for+precise+and+nondisruptive+stomatal+inoculation+of+leaf+tissue+with+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A device for precise and nondisruptive stomatal inoculation of leaf tissue with bacterial pathogens.</a> Phytopathol. 82, 930-935 (1992).</li>
<li>Posada, F., Aime, M. C., Peterson, S. W., Rehner, S. A., Vega, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inoculation+of+coffee+plants+with+the+fungal+entomopathogen+Beauveria+bassiana+%28Asomycota%3A+Hypocreales%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mycolog.+Res%22%5BJournal%5D)">Inoculation of coffee plants with the fungal entomopathogen Beauveria bassiana (Asomycota: Hypocreales).</a> Mycolog. Res. 111, 748-757 (2007).</li>
<li>Bolker, M., Bohnert, H. U., Braun, K. H., Gorl, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tagging+pathogenicity+genes+in+Ustilago+maydis+by+restriction+enzyme-mediated+intergratior+%28REMI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">Tagging pathogenicity genes in Ustilago maydis by restriction enzyme-mediated intergratior (REMI).</a> Mol. Gen. Genet. 6, 274-283 (1991).</li>
<li>Brachmann, A., Weinzierl, G., Kamper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+in+the+bW%2FbE+regulatory+cascade+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 42, 1047-1063 (2001).</li>
<li>Christensen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Corn+smut+caused+by+Ustilago+maydis.+Monograph+number+2%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Corn smut caused by Ustilago maydis. Monograph number 2.</a> , The American Phytopathological Society. (1963).</li>
<li>Skibbe, D. S., Doehlemann, G., Fernandes, J., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maize+tumors+caused+by+Ustilago+maydis+require+organ-specific+genes+in+host+and+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.%22%5BJournal%5D)">Maize tumors caused by Ustilago maydis require organ-specific genes in host and pathogen.</a> Sci.. 328, 89-92 (2010).</li>
<li>Kamper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Allen, A., Kaur, J., Gold, S., Shah, D., Smith, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+maize+plants+expressing+the+Totivirus+antifungal+protein%2C+KP4%2C+are+highly+resistant+to+corn+smut%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Transgenic maize plants expressing the Totivirus antifungal protein, KP4, are highly resistant to corn smut.</a> Plant Biotechnol. J. 8, 857-864 (2011).</li>
<li>Gold, S. E., Brogdon, S. M., Mayorga, M. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+regulatory+subunit+of+a+cAMP-Dependent+protein+kinase+is+required+for+gall+formation+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis regulatory subunit of a cAMP-Dependent protein kinase is required for gall formation in maize.</a> , (1997).</li>
<li>Gold, S. E., Kronstad, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+two+chitin+syn-+thase+genes+in+the+phytopathogenic+fungus+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Disruption of two chitin syn- thase genes in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis.</a> Mol. Microbiol. 11, 897-902 (1994).</li>
<li>Brefort, T., Doehlemann, G., Mendoza-Mendoza, A., Reissmann, S., Djamei, A., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ustilago+maydis+as+a+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Ustilago maydis as a Pathogen.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 47, 423-445 (2005).</li>
<li>Doehlemann, G., Wahl, R., Vranes, M., de Vries, R., Kämper, J., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystems.</a> J. Plant Physiol. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Reineke, G., Heinze, B., Schirawski, J., Buettner, H., Kahmann, R., Base, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indole-3-acetic+acid+%28IAA%29+biosynthesis+in+the+smut+fungus+Ustilago+maydis+and+its+relevance+for+increased+IAA+levels+in+infected+tissue+and+host+tumor+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis in the smut fungus Ustilago maydis and its relevance for increased IAA levels in infected tissue and host tumor formation.</a> Mol. Plant Pathol. 9, 339-355 (2008).</li>
<li>Martínez-Espinoza, A., García-Pedrajas, M. D., Gold, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilaginales+as+Plant+Pests+and+Model+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genet.+Biol%22%5BJournal%5D)">The Ustilaginales as Plant Pests and Model Systems.</a> Fungal Genet. Biol. 35, 1-20 (2002).</li>
<li>Banuett, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Ustilago+maydis%2C+a+fungal+pathogen+that+induces+tumors+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetics of Ustilago maydis, a fungal pathogen that induces tumors in maize.</a> Annu. Rev. Genet. 29, 179-208 (1995).</li>
<li>Keen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+plant+pathology%3A+a+retrospective+view+on+understanding+host-parasite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A century of plant pathology: a retrospective view on understanding host-parasite interactions.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 38, 31-48 (2000).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

本研究では、700トウモロコシとテオシンテ植物の茎に U.maydis の株を送達するために使用される針注射接種方法が成功した。さらに、改訂された疾患耐性評価尺度を使用して、植物をスクリーニングし、病原体の発達を検出した。両方の方法を使用した結果 、U.maydis に耐性のある植物ラインが700トウモロコシとテオシンテ植物の間で同定され、現在は組み合わせることができ、改善された耐病性のための繁殖プログラムでテストすることができます。
ほとんどの接種方法と同様に、同じラインから植物の間で同じ抵抗表現型を再現する能力が不可欠です。さらに、同じ抵抗性の型は、少なくとも2つの別々の実験20,21で観察されなければならない。植物表現型を得る能力は、耐性であるか、影響を受けやすいかにかかわらず、主に病原体が植物組織にアクセスする能力によって決定されるので、各接種を離れる植物の間に病原体を送達する接種方法を選択することが非常に重要である。 研究者がU.maydis などの生物栄養真菌病原体を用いた針注射接種方法に直面し...

植物の真菌病は、農業に対する最も重要な脅威の1つを表しています。世界人口の増加に伴い、食のニーズが高まる中、耐病性の向上を伴う作物の開発が必要とされています。植物病原体は自然に作物収量に悪影響を与える疾患を引き起こすフィールドの作物植物に感染する 6.耐性植物を同定し、利用することは抵抗を改善し、収量損失を減少させることができることが示されている。植物病原体を植物に接種し、耐性ライン7を選択することにより、トウモロコシ、小麦、米、ソルガムを含む多くの植物種において耐性品種が同定されている。したがって、効率的な接種方法の開発と使用は、多くの植物を接種し、抵抗性のためにスクリーニングすることを可能にするであろう。浸入接種、病原体細胞懸濁培養を植物の渦にピペット化、注射注射8~11の注射など様々な接種方法が用いられている。各方法を用いて、病原体は、病原体の発達と植物感染を確実に行うために、アプレソリアの形成を通じて植物に入る植物葉の間に確実に導入されなければならない。
浸潤接種法は、植物苗を病原体細胞懸濁培養物に浸入することを含み、ピペット法では病原体細胞懸濁液を植物苗の渦に入れる必要がある。ただし、両方の方法に問題があります。第一に、どちらの方法も、葉表面から植物組織への病原体の自然な動きに依存する。ほとんどの病原体は、自然に植物の葉表面に口孔や傷を介して植物に入ります.しかし、植物の葉表面を通して植物葉表面を貫通する病原体能力や葉表面の創傷には大きなばらつきがある。したがって、病原体の浸透は、いずれの接種方法でも制御できず、データの一貫性がなくなる可能性があります。第二に、多数の植物をスクリーニングする場合、苗を病原体細胞懸濁培養物に浸すと時間がかかり、スクリーニングできる植物の数を制限する可能性がある。逆に、本明細書に記載の針注射接種プロトコルは、アプレッサリア14の形成を促進する植物葉間の病原体細胞懸濁培養を送達する。病原体は、次に、新たに開発されたアプレッサリアを利用して、病原体の侵入問題を排除する植物に入ります。さらに、針注射接種プロトコルは、メイズおよびテオシンテ植物に対して 、U.maydis を接種し、良好な感染を示す様々なフェノタイプを提供する。この表現型は、異なる実験内および実験間で一貫した植物表現型をもたらす病原体細胞懸濁液培養に最適な濃度を決定するためのマーカーとして使用することができる。
病原体細胞懸濁液培養による植物接種後、植物は通常、8-11,15の耐性または感受性表現型を検出するためにスクリーニングされる。疾患評価尺度は植物の型をスクリーニングし、分類するために広く使用されているが、評価尺度は分析される病原体によって異なる。したがって、 米国メイディス およびトウモロコシ相互作用に対する疾患評価尺度プロトコル確立は、同様の真菌病原体16に利用することができる。
本シリーズのプロトコルは、 メイ ズ細胞懸濁液培養およびトウモロコシ、テオシンテ、およびトウモロコシxテオシンテイントログレスラインの疾患耐性反応スクリーニングによる針注射接種を詳述している。本プロトコルは、トウモロコシ植物への U.maydis の注射の針に限定されるものではなく、比較的あらゆる真菌病原体および植物種に利用することができる。したがって、同じプロトコルに両方の方法の詳細を含めると、研究者は接種とスクリーニングのためのプロトコルを直接利用したり、元のプロトコルを操作して目的の病原体および植物種により適合することができます。

<table><tbody><tr><td>植物のための種子</td><td></td><td></td><td>元の十字架から集められた</td></tr><tr><td>成長チャンバー</td><td>Conviron</td><td>PGR14 REACH-IN</td><td></td></tr><tr><td>植栽フラット</td><td>Hummert International</td><td>14-3385-2</td><td></td></tr><tr><td>土壌 (松の樹皮 3 部、パーライト付きピート モス 1 部)</td><td>Hummert International</td><td>10-1059-2</td><td></td></tr><tr><td>層流フード</td><td>ラボ Conoco</td><td>70875372</td><td></td></tr><tr><td>病原体(U.maydis)または関心のある</td><td></td><td></td>真菌病原体のグリセロールストック <td>ストックは元の培養から成長しました</td></tr><tr><td>滅菌ループ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S17356A</td><td></td></tr><tr><td>ポテトデキストロース寒天(PDA)プレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>R454311</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーターを30°Cに設定。C</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-690-650F</td><td></td></tr><tr><td>滅菌爪楊枝</td> ウォル<td>マート</td><td>ウォルマートから購入し、オートクレーブで滅菌</td>ポテトデキストロースブロス (PDB)フィッシャーサイエンティフィックICN1008617インキュベーターシェーカーを30°Cに設定。<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C</td><td>ニューブランズウィック</td><td>14-278-179</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>4001000</td><td></td></tr><tr><td>U. maydis&nbsp;細胞懸濁液培養(1 x 106細胞/ ml)</td><td></td><td></td>3 mlシリンジBecton Dickinson <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 309606.457 <td></td></tr><tr><td>mm x 1.3 cm皮下注射針</td><td>Kendall Brands</td><td>8881250321</td><td></td></tr>に記載されているように、グリセロールストックから成長</tbody></table>

トウモロコシとテオシンテ線における ウスチラゴ の病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法

A Rapid and Efficient Method for Assessing Pathogenicity of Ustilago maydis on Maize and Teosinte Lines

トウモロコシは世界中の主要な穀物作物です。しかし、生物栄養病原体に対する感受性は、生産性を高めるための主要な制約である。 U.maydis は、トウモロコシの生物栄養真菌病原体およびトウモロコシスムートの因果剤である。この病気は、米国で年間約10億ドルの著しい収量損失を引き起こします1 作物の回転を含むいくつかの方法, 殺菌剤の適用と種子治療は、現在、トウモロコシのスマットを制御するために使用されています2.しかし、ホスト抵抗は、トウモロコシスマットを管理するための唯一の実用的な方法です。種々の生物栄養病原体に耐性のあるトウモロコシ、小麦、米などの作物植物の同定は、毎年3〜5の収量損失を著しく減少させている。したがって、植物葉間で病原体を効率的かつ再現的に送達する病原体接種方法を用いることは 、U.maydisに耐性のあるトウモロコシ株の迅速な同定を容易にするであろう。として 、U.maydisに耐性のあるトウモロコシラインを識別するための第一歩として、ニードル注射接種法および抵抗反応スクリーニング方法を利用して、トウモロコシ、テオシンテ、トウモロコシxテオシンテイントログレスラインを U.maydis 株で接種し、耐性植物を選択した。
トウモロコシ、テオシンテ及びトウモロコシxテオシンテ内線は、約700の植物からなる、植え付け 、U.maydisの株で接種し、抵抗性をスクリーニングした。接種およびスクリーニング方法は 、U.maydisに耐性のある3つのテオシンテ線を同定することに成功した。ここでは、トウモロコシ、テオシンテ、及びトウモロコシxテオシンテイントログレスラインの詳細な注射接種及び抵抗反応スクリーニングプロトコルが提示される。この研究は、針注射接種が植物の葉の間に U.maydis を効率的に供給できる農業における貴重なツールであり、現在組み合わせることができ、改善された疾患耐性のための繁殖プログラムでテストすることができる U.maydis に耐性のある植物ラインを提供していることを示しています。

針注射の接種に成功した場合、U.maydis(実験)で接種された植物の表現型を可視化することによって決定することができる。実験植物の大部分は、U.maydis感染の影響を受けやすかった。この影響を受けやすい植物は、黒色の管門を有する茎および基底胆汁形成によって示される非常に重篤な疾患の発症を示した(図3Dおよび3E、表2)。いくつかの植物は、病気の重症度のために接種後に死亡した。米国メイディスに耐性のある3つのトウモロコシxテオシンテ内線が同定された。U.maydisに耐性のある植物については、軽度クロロシス、アントシアニン産生またはマイナー葉の胆汁形成によって成功した接種が実証された。(図3A-Cおよび表2)
実験植物について観察された表現型が接種の結果であることを確認するために、実験植物と対照植物の表現型(水接種)を比較した。実験植物は、上...

メズおよびテオシンテ植物を生物栄養病原体 ウスチラゴメイディス で接種する注射法の使用について説明する。 針注射接種方法は、病原体がアプリソリアの形成を通じて植物に入る植物葉の間の真菌病原体の制御された送達を促進する。この方法は非常に効率的で 、U.maydisで再現可能な接種を可能にします。

Maize is a major cereal crop worldwide. However, susceptibility to biotrophic pathogens is the primary constraint to increasing productivity. U. maydis is ...

本手順の全体的な目的は、針注入法を用いてUSTA Lagoマウス細胞懸濁培養液を接種し、トウモロコシ（maze tete）とテオシント（maze teosinte）の交配系統における病害抵抗性反応のスクリーニングを行うことです。これは、まず接種およびスクリーニング用の植物系統を選定し、次に実験群および対照群の針注入接種実験用の種子を播種することで達成されます。10日後、Uで作製した細胞懸濁液を各植物の茎に注入します。最後に、実験群と対照群の植物の抵抗性反応を比較します。最終的に、you.Maisを接種した植物の表現型を視覚化することで、針注入接種が成功したことを示す結果を得ることができます。この手法の主な利点は、病原体を葉の間に直接導入できることです。これにより、病原体の浸入に関する問題が解消されます。まず、ここに示すように、接種およびスクリーニングに用いる植物系統を選択します。本研究では、実験および対照用の針注入接種実験として、2系統のトウモロコシ、5系統のテオシント、および U Mais に対する耐性が未特性のトウモロコシ・テオシント交雑系統40系統を使用しました。各植物系統の種子を4粒ずつ、小さなフラットに植えます。指で種子を土に約0.5インチ押し込み、軽く土を被せてください。その後、植物を育成チャンバーに入れ、種子が十分に浸るまで灌水し、灌水後も種子が土の下にあることを確認します。昼間28℃、夜間20℃の環境で、明期14時間、暗期10時間のサイクルで植物を育成します。また、キャノピー頂部における光合成有効放射量は、約500 micromolar per square meter per secondに設定します。相対湿度は、昼間を約70%、夜間を約90%に維持し、実験全体を通じて一貫した生育環境を確保するため、すべての植物を同一の育成チャンバー内で管理してください。種子の播種から8日後、滅菌ループを用いて、凍結グリセロールストックからPDA（ポテトデキストロース寒天）プレートにhuisを画線し、30 °Cで2日間培養します。この際、ラミナーフローフード内で定期的に観察し、良好に生育しているかを確認してください。滅菌済みの爪楊枝を使用して、各株から単一のコロニーを選択し、3 mLのPDブロスが入ったチューブに入れます。培養物を30 °C、200 RPMで2日間インキュベートし、定期的に増殖を確認します。次に、培養物のOD 600を測定し、ODが1.0まで増殖していることを確認します。水を用いて、培養液を最終容量 30 milliliters、最終濃度 1 million cells per milliliter に調整します。この濃度の病原細胞懸濁液を用いることで、植物への安定した感染が得られます。その後、接種前に、作製した 2 種類の菌株を等量ずつ混合します。3 mLのシリンジに細胞懸濁液を満たす前に、植物へのダメージを最小限に抑えて注入できるよう、対照群用のシリンジに水を満たします。各シリンジの端に、0.457 mm × 1.3 cmの皮下注射針を取り付けます。植物を育成室から取り出し、土壌線直上の位置から90度の角度で注入します。Uマウスの針を、実験用植物の茎の中央に達するまで慎重に挿入します。細胞懸濁液を約100 µL注入してください。溶液は茎を通り抜け、植物の輪状部分へと移動するのが確認できます。シリンジが空になるまで、他の実験用植物への注入を続けます。その後、シリンジに水を満たして針に付着した植物組織を洗浄し、すべての植物への注入が完了するまで、再度溶液を充填してください。同様の手順で、水の入ったシリンジを用いて対照群の植物に注入を行います。注入が完了したら、植物を成長チャンバーに戻し、毎日管理します。土壌のみに灌水を行い、病原体の増殖および植物の抵抗性反応を確認してください。1から5の抵抗性反応評価尺度を用いて、接種後7日、10日、14日、および21日（DPI）における各植物の抵抗性反応を評価し、記録してください。評価尺度の数値は、病状の深刻度が増すにつれて大きくなります。例えば、A1Cにおいて1または2の抵抗性反応は、抵抗性があることを示します。抵抗性反応が3、4、または5である場合は、感受性であることを示します。供試植物と対照植物の抵抗性反応を比較し、A1Cが抵抗性反応評価の1または2である供試植物を選出してください。これらの植物はmatisに対して抵抗性があると考えられます。この実験では、腐植土を接種した植物の大部分が感染し、感受性を示しました。植物には、黒色の冬胞を伴う茎および基部の根瘤形成に認められる激しい病徴が現れました。病状が深刻であったため、接種後に枯死した個体も数株ありました。対照的に、コントロール植物は非常に健全で、植物のどの部位にも病原体の perkembangan は認められませんでした。これにより、実験植物における病原体の発生は、U Mais の針注入接種によるものであることが示されました。U Mais に対して耐性を持つ 3 つの Mais Teosinte 交配攻撃系統が同定され、軽度の硬化、シアニン産生、または軽度の葉胆形成によって接種の成功が確認されました。この手法は、高い効率と再現性をもって実施可能です。これにより、多数の植物の接種および表現型解析が容易になります。

a-rapid-efficient-method-for-assessing-pathogenicity-ustilago-maydis

Research

JoVE Journal

Environment

環境

種子感染菌による穀物の荒廃は、より良い植物 -...

真菌の植民地、減数、およびカーネルのバイオアッセイを用いたマイコトキシンの生産の定量化

我々は遺伝的にウスチラゴがmaydisスマット菌を操作する堅牢な遺伝子置換戦略を説明します。このプロトコルは、感染症の表現型を調べるために、欠失変異体を生成する方法について説明します。蛍光タンパク質タグをコードする配列を付加することによって、 例えば 、任意の所望の方法で遺伝子を修正するために拡張することができます。...

植物病原体の遺伝子操作<em&gt;ウスチラゴmaydis</em&gt;真菌生物と植物微生物相互作用を研究します

ここでは、提案する植物病原菌と植物病原性をテストするためのプロトコルいもち病。このレポートは菌分離株の pathotype...

植物感染試験: スプレーと傷を介した植物病原体イネいもち病菌接種

トロイの木馬として経路を用いたトウモロコシ蛋白質場配信で

ここでコウジカビ flavusの生育および抗真菌性蛋白を発現するトウモロコシのアフラトキシン生産を分析するためのプロトコルを提案する. 我々 は、感染とリアルタイムで成熟したカーネルでは菌の拡散を監視 gfp 発現するA.

コウジカビ flavusの生育と遺伝子組換えトウモロコシはフジマメ属液体l. から α-アミラーゼ阻害剤を表現するアフラトキシン生産阻害

植物形態素遺伝子は、再生成遺伝型の遺伝子変換を改善するために使用することができる。ここに記載されているのは、3つの重要な公共トウモロコシ近交線のためのアグロバクテリウム媒介遺伝形質転換(QuickCorn)プロトコルである。...

アグロバクテリウム-形態新生遺伝子を用いた再カルシトランストウモロコシ近交線の媒介性不成熟胚変態

これは、最小限の試薬と一般的な実験装置(基本的なスマートフォンを含む)を使用した大麦葉鞘アッセイの簡単なプロトコルです。目的は、高度な顕微鏡装置にアクセスすることなく、実験室でいもち病の初期感染プロセスを視覚化することです。...

オオムギのイネいもち病(Magnaporthe oryzae)の初期感染部位を基礎顕微鏡とスマートフォンで可視化

この原稿では、トウモロコシと真菌植物病原体との相互作用の再現性のある細胞学的、生理学的、および分子学的研究のために、剥離したトウモロコシの葉鞘を使用する最適化された接種プロトコルについて詳しく説明します。葉鞘は、未固定組織における生きた植物と真菌の間の細胞相互作用のリアルタイム観察を容易にします。...

真菌葉トウモロコシ病原体による感染の生細胞イメージングのための分離トウモロコシ鞘

水質の監視と評価には、底生大型無脊椎動物を使用した迅速なバイオアセスメントプロトコルがよく使われます。効率的なプロトコルには、ユスリカ科の表面浮遊蛹exuviae(SFPE)の収集が含まれます。ここでは、フィールド収集、実験室での処理、スライドの取り付け、およびユスリカ科SFPEの同定の技術について説明します。...

水域のためのユスリカ（双翅目）簡易生物調査プロトコルとして表面フローティング蛹脱皮殻の使用

反芻動物からのメタン排出を測定するために使用される技術の精度と精度は、温室効果ガス削減の取り組みの成功にとって非常に重要です。この原稿では、反芻動物の呼気からのメタンと二酸化炭素の質量フラックスを監視する自動システムの原理と操作について説明します。...

腸内のメタンと反芻動物からの二酸化炭素排出量を監視するために、自動システム（GreenFeed）の使用

学ぶ、ニードル注射法によるトウモロコシとテオシンテへのUstilago maydis接種技術。植物病理学における病原菌送達と抗病性スクリーニングの効率的な手法を習得できます。

トウモロコシとテオシンテ線におけるウスチラゴの病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法

さらに動画を探す

トウモロコシとテオシンテ線における ウスチラゴ の病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法

さらに動画を探す

トウモロコシとテオシンテ線におけるウスチラゴの病原性を評価するための迅速かつ効率的な方法