Name: 薬物ターゲット相互作用と抗菌抵抗検出のナノメカニクス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-25T09:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: 学ぶカンチレバー技術を用いた抗菌薬抵抗性の定量化と薬物ターゲット相互作用の機械的特性測定法。この革新的アプローチは新規抗菌薬開発に貢献し、薬理学研究の効率と精度を向上させる。

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ジョセフW. Ndieyiraは工学·物理科学研究評議会（EPRSC）、ナノテクノロジーにおける学際研究センター（IRC）、王立協会（RS）とBianoコンサルタント（BNC）によってサポートされていました。我々は有用な議論のために、アレドノソバレラ、徳周、マヌエルVögtli、マシューバチェラー、マシューA.クーパー、トルステンStrunz、トレバーレイメントとガブリエルAeppliに感謝します。

1。カンチレバーの作製<ol><li>テフロンピンセット浸すカンチレバーチップの選択された番号を使用して20分間作りたてピラニア溶液（比1:1のH 2 SO 4、H 2 O 2）に（100μm幅と0.9μmの厚さの長い500ミクロンを測定する各カンチレバー） 。 </li><li>約20分後、ピラニア溶液からカンチレバーチップを除去し、脱イオン水と作りたてピラニア溶液に直ちに転送にそれらを徹底的にすすいでください。チップは他の方法で次のステップに進んで汚れのスポットが含まれている場合、上記の手順1.1を繰り返します。 </li><li>脱イオン水で徹底的に洗浄後、純エタノールで洗い流し、水の痕跡を除去するために75℃のホットプレート上にカンチレバーチップを乾燥。彼らの清浄度を確認するために、光学顕微鏡を使用してそれらを点検します。 </li><li>蒸発室に洗浄カンチレバーチップを移し、ポンプダウン、真空を達成するためにターゲティング10 -7ミリバールの圧力。 </li><li> 20nmの厚さの金の付加的な層の前に接着層として作用する第2 nmのチタン、各カンチレバーアレイの必要な真空圧力が達成されれば、コート片側。彼らの厚さを確認するために、対象となるソースの上に直接配置水晶モニターを使用しています。 </li><li>開口部の前に真空下に冷却するために1〜2時間のためにチャンバー内に金被覆カンチレバーセンサチップにしておきます。 </li><li>汚染の任意のフォームを防ぐためにアルゴンを充填した真空収納容器に新たに蒸発させて、チップを転送する。 </li></ol> 2。カンチレバーチップの機能化<ol><li>まず、250μmのカンチレバーピッチサイズに応じて2官能ステージにマイクロキャピラリーチューブを手配。 </li><li>次いで、表面の標的分子、 すなわち細菌mucopeptides（D-Alaで及びD-ラック ）、および&#39;の慣性力2mMのエタノールチオールの溶液を注入するt &#39;の生体分子の吸着に抵抗することが知られているトリエチレングリコール（PEG）で終端するアルカンチオール。16キャピラリーチューブの各々は、ユーザバイアスを回避するためにランダムに決定各種の表面捕捉分子を含むべきである。 </li><li>表面捕捉分子を含むチオールソリューションで満たさマイクロキャピラリーでカンチレバー20分間次インキュベート。表面捕捉分子のソリ​​ューションは、クロスコンタミネーションを回避または最小限にするため、個々のカンチレバーセンサに限定されていることを確認します。このプロセスが正しく使用される場合、それは系統的受容体として、金コーティングされた表面上に形成するために、細菌ムコペプチド標的の自己組織化単分子層を形成させることにより化学的に活性なセンサーに新たに調製した金被覆カンチレバーを変えるべきである。 </li></ol> 3。ソリューションの準備<ol><li>超純水（18.2MΩ·cmの抵抗率）との組合せでtの0.1 Mモノ - およびジ - 塩基性リン酸ナトリウム塩を溶解さ7.4のpH値をもたらすO。 </li><li>ガラス製品への薬物分子の非特異的な相互作用によって引き起こされる凝集効果を最小限に抑えるため緩衝溶液にPS80の0.002％を加える。 </li><li> K Dの計算を可能にする目的の異なる濃度に新たにバッファリングされたソリューションと薬を希釈します。 </li><li> 0.2μmのフィルターを用いて新たに調製した薬液をフィルタリングし、アルゴンでパージする前に室温で5分間超音波処理する。 </li><li>全血清を使用してバッファリングされた血清中の薬物と同じ手順を繰り返します。完全な溶解性を確保するため、さらに5分で15分間穏やかにボルテックス。 </li></ol> 4。表面応力の検出<ol><li>液体フローセルチャンバーに官能化されたカンチレバーセンサチップを読み込む。 </li><li>各センサの自由端にレーザスポットの位置を合わせ、1℃で液体室を加熱することにより、位置合わせを確認全8金被覆カンチレバーセンサアレイは、包括を受ける必要がありますssive下向きのため、シリコンと金の膨張率の違いによるバイメタル効果の曲げ。 </li><li>約10分間加熱した後、カンチレバーはさらに10分間冷却することができます。 </li><li>個々のカンチレバーセンサー間最大曲げ信号における曲げ変化を計算し、曲げ信号の相対標準偏差は≤5％であれば望ましいが、そうでなければ処理を繰り返すように、その後の配置を受け入れる。 </li><li>次に、それらのバネ定数を計算するためにすべての8つのカンチレバーの共振周波数を測定します。チップ内の各カンチレバーセンサー間のバネ定数の変化は≤1％が、その後一貫し機械的性質は、他の方法でカンチレバーチップセンサーを置き換えるものとしてチップを受け入れている場合。 </li><li>次に、データ取得がように、自動のLabViewを用いて達成されるべきである一方、フローセル内の液体の交換を達成するために6方弁を介して流体システムモデル（ジニープラス）を使用するftware。 </li><li> 、カンチレバーの曲げデータを監視し、以下の測定プロトコルを使用するには、次のI）をベースラインを確立するために5-30分間持続する制御測定のために薬なしで緩衝液または血清のいずれかを注入し、ii）30〜60分間、薬液を注入し、ⅲ）結合した薬物複合体を解離するために10〜60分間、10mMのHClで洗浄を注入し、iv）が、最終的に表面ペプチドを再生成し、基準信号を復元するために別の5〜30分間緩衝液を用い、さらに洗浄工程を注入する。常にすべての信号は30〜180μL/分の一定の液体流量下で温度制御キャビネット内25℃の一定温度で取得されていることを確認する。 </li><li>すべての8つのカンチレバーの絶対曲げ信号は、単一の位置敏感型検出器を用いて光ビーム方式を多重シリアル時間を使用して監視する必要があります。 </li><li>薬剤の各濃度から曲げ信号を分析するために、得られた差分曲がることが差動STRESに変換されるストーの式を用いてカンチレバーの上側と下側との間にsである。 </li></ol>

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</ol>

利害の衝突は宣言されていない

分子認識パラダイムを支える生物学と医学の大帯状。薬理学では、例えば目標は、transglycoslyationまたは細菌細胞壁のペプチドの架橋を触媒するペプチド転移などの生化学的プロセスの主要な参加者を対象として病理学的経路を妨害することである。薬物設計は、したがって、完全な適合を誘導するために、特定の細菌のドッキング部位を対象とする適切な分子を画定するまで低減される。このアプローチの成功をエミュレートする典型的な例はペプチドグリカン細胞壁を標的とバンコマイシン（ バン ）、細菌の保存された構造的特徴である。初期のグラム陽性菌では、ペプチドグリカン行列はここにD-Alaで呼ばれるC55脂質リンカ8-10介してつながシーケンスリジン-D-アラニン-D-アラニンで終端ペプチドで構成されています。ペプチドグリカン前駆体上のこれらの暴露ペプチドはための基本である過酷な環境力に対する細菌細胞の機械的保護、および重要なことは、それらの抗生物質にも理想的な目標を作り、ヒト細胞で発見されていない。 バンは、具体的にはやや強いファンデペプチドを形成する細菌細胞壁のペプチドのC-末端に結合する図1に示すような複雑。 ヴァン露出したペプチドブロック、効果的に架橋するからそれらを停止するため、nanomechanically破裂1,6ことによって、その死に至る細菌細胞を弱める、細胞壁1の架橋触媒transpeptidasesとtransglycosylasesの行動、の間のこの相互作用7。 バンコマイシン耐性腸球菌 （VRE）の出現が増加医療問題11で、 腸内細菌の抵抗はアミド林の微妙な変化に起因し発生したためエステル結合8、細菌が削除の表面結合ポケットのその後の変更でヴァンのドッキング部位から単一の水素結合で、この一見単純な構造変化への影。重要なのはこのプロセスはバン-D-Lacの結合親和性での大幅な削減をもたらし、ここでD-Lacのと呼ばれる、リジン-D-アラニン-D-乳酸10,12にバンコマイシン感受性の腸内ペンタペプチド末端アラニン存在（VSE）を変更する腸球菌感染症1、抗生物質耐性菌の驚くべき成長に対する治療効果のない大きさのレンダリングバンの3桁は、したがって、耐性菌多剤に対する抗菌剤の抗菌活性またはより強力な薬の発見を加速し、復元するために革新的なアプローチの開発を推進しています感染症。 <pクラス= &quot;jove_content&quot;&gt;自立型カンチレバーを用いた我々の実験は、このような運動に化学エネルギーを活用した細胞のようなシステムに触発されています。機械的運動に化学エネルギーを変換するカンチレバーセンサの能力は、それらをリアルタイムで細菌細胞壁ターゲットの機械的な中断を監視するための顕著な利点を有するプローブを一意になる。カンチレバーセンサーはない記者 &#39;タグ&#39;を必要とし、生体分子は、シングルステップ反応で急速に検出されます。彼らはそのような緩衝液と全血清などの生理的な環境下において、並列に複数の薬をスクリーニングすることができる。また、カンチレバー技術は、標準的な半導体処理経路を介して、それらの製造のおかげで、それらは数千のハイスループットスクリーニングのための大量生産と並列化のために適している、それらが特異的薬物標的相互作用を検出することができ、差動測定のためにその場で参照に使用され、時間あたりの薬剤。参加者をでウラル複数カンチレバーセンサアレイは、バンコマイシンに抗生物質耐性を研究するための有用なツールである-バンコマイシンへの抵抗は、基本的に機械的な問題が1,6,7であるためです。溶液中のモデル細菌細胞壁対象とバンの間の反応は、薬物標的の結合相互作用から誘導された臨床的に関連する応力の変化を監視することによって検出することができる。カンチレバーの曲げ信号に現れる表面反応から発生する応力は、レーザビームを照射センサにより光学的に分析される。またカンチレバーセンサーの上に細菌表面の標的分子の受容コーティングを調整することにより、検体の非限られた数（ ヴァン ）、特異的な生化学的相互作用に近く、モデル細菌の細胞壁マトリックスの力学がリアルタイムで監視されます。別に分子認識イベントから、デフにカンチレバーセンサーを引き起こす可能性がありますいくつかの要因があります温度変動、非特異的な結合または溶液の屈折率の変化を - LECT含む。非特異的なシグナルを考慮して、 その場で差動測定では 、測定と基準カンチレバー両方の屈曲が連続特異的相互作用を分析するために監視されている場所に実行されます。また、表面の化学的性質および形状に依存するカンチレバーセンサの検出感度は、pがカンチレバーの上面全体領域に捕捉分子によって占有される表面積の比として定義される面密度ウェブ （調整することによって向上させることができるX線光電子分光法（XPS）1によって決定される分子の総人口によって覆われている。 ここでは、このプロトコルの詳細をどのようにバンコマイシンまたは緩衝液中で臨床的に関連する濃度で細菌細胞壁前駆体アナログ（mucopeptides）に、他の抗生物質の結合番目の血清は、ラベルフリーカンチレバー技術を用いて検出することができる。自己組織化単分子膜（SAMの）が容易にクリーンな金13,14に安定した層を形成する傾向があるため、新たな金の表面が使用される。 SAMのは、通常、他の端にある希望のキャプチャユニットを自由溶液中の分析物のターゲットと相互作用することが許されている間に共有結合的に金表面に取り付けチオール部分と短い分子で構成されています。チオールは、特に、異なる化学末端基を有する多くのチオール化合物は市販されているか、容易に実験室で合成されることを考えると柔軟なシステムを形成する。しかし、注意がチオール部分を有する分子が正しい末端基を持っている必要があることを保証するために取られるべきである、タンパク質またはペプチド共役で例えば、アミノ基につながチオール基のカルボキシル基との反応のために内側に向くように発生する表面。ここでは、チオールは、Bから細菌脂質IIのトリペプチド模倣物と直接共役あっacterial細胞壁を用いた固相方法により合成目標市販の王-D-Alaのと王-D-Lacの樹脂や標準的なFmoc保護基化学15プリロード。この説明はバンコマイシンに集束されていますが、明らかにそれは他の抗生物質に拡張することができ、実際にさらなる研究が異なる特に生化学、薬理学のフィールド、そして簡単に、独自の実験のためにこのプロトコルを採用する材料科学の研究者によって招待されています。

<table><tbody><tr><td>Scentris</td><td></td><td>Scentris, Veeco Instruments, Inc</td><td>生産されていません</td></tr><tr><td>6方向バルブ</td><td></td><td>MVP, Hamilton, Reno, NV</td><td>多重濃縮注入が可能</td></tr><tr><td>EBエバポレーター</td><td></td><td>BOC Edwards Auto 500, UK</td> 熱<td>加熱の問題によるカンチレバーの変形のため、電子ビームが望ましい</td></tr><tr><td>貯蔵容器</td><td></td><td>Agar Scientific, UK</td><td>金コーティングされたフィルムを新鮮に保ちます</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td></td><td>キングプレシジョングラス、クレアモント、カリフォルニア州、米国</td><td>カンチレバーアレイの毛細管機能化用</td></tr><tr><td>ポンプ</td><td></td><td>モデルGenie Plus、ケントサイエンティフィック、トリントン、コネチカット州、米国</td><td>マイクロ流体チャネル内の液体サンプルの制御された流量に適しています</td></tr><tr><td>0.2-4.5 &mu;m フィルター</td><td>1511940001</td><td>メルクミリポア</td><td>サンプルろ過用</td></tr><tr><td>カンチレバーチップ</td><td></td><td>ロンドンナノテクノロジーセンター(LCN)</td><td>高感度</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性</td><td>10049-21-5</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>緩衝液の製造用</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>7558-79-4</td><td>Sigma-Aldrich, 英国</td><td>緩衝液の製造用</td></tr><tr><td>ポリソルベート80 (PS80) or Tween 80</td><td>9005-65-6</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>ガラス器具の非特異的相互作用を防ぐための緩衝液に使用</td></tr><tr><td>DI水</td><td></td><td>Millipore Co., Billerica, MA, USA</td><td>溶液の製造に使用</td></tr><tr><td>全血清</td><td>GEM-700-110-H</td><td>Sera Laboratories International Ltd, UK</td><td>生理学的条件を模倣する測定に使用</td></tr><tr><td>バンコマイシン (バン)</td><td>1404-93-9</td><td>Sigma-Aldrich(英国</td><td>) 使用薬物</td></tr><tr><td>硫酸</td><td>7664-93-9</td><td>Sigma-Aldrich(英国)</td><td>ガラス製品の洗浄手順に使用</td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>7722-84-1</td><td>Sigma-Aldrich(英国)</td><td>ガラス製品の洗浄手順に使用</td></tr><tr><td>D-Ala および D-Lac</td><td></td><td>ロンドンナノテクノロジーセンター(LCN)</td>薬物<td>と標的の相互作用を検出するためにカンチレバーにコーティングされた表面受容体</td></tr><tr><td>LabView</td><td></td><td>National Instruments Co., Austin, TX, USA</td><td>制御された計測を可能にする機器インタフェースに使用されるソフトウェア</td></tr></tbody></table>

薬物ターゲット相互作用と抗菌抵抗検出のナノメカニクス

Nanomechanics of Drug-target Interactions and Antibacterial Resistance Detection

溶液中のその表面と抗生物質上に固定化されたモデル細菌の細胞壁マトリックスとの間の反応の変換器として作用するカンチレバーセンサは、前例のない感度と特異1-5と生化学的検知用途において大きな可能性を示している。薬物標的相互作用は、カンチレバーが曲がることを引き起こして、表面応力を生成し、それがレーザによって照射されるときの信号は、光学的に分析することができる。ナノスケールの精度で測定された表面応力の変化は、リアルタイムで追跡するモデル細菌細胞壁対象の生体力学の中断を可能にする。かなりの利点は、複数のカンチレバーセンサアレイを提供するにもかかわらず、薬物標的結合相互作用の定量化に適用されていない。 ここでは、定量的STUに細菌細胞壁マトリックスを模倣するアルカンチオール自己組織化単分子膜でコーティングされたシリコン複数のカンチレバーアレイの使用について報告DY抗生物質結合相互作用。細菌の細胞壁構造1,6,7の力学上のバンコマイシンの影響を理解する。我々は、湾曲そのカンチレバーは、2つの独立した要因によって説明することができる提案する新しいモデル1を開発し、i）は、即ち古典的なラングミュア吸着等温線により与えられる化学的因子は、そこから我々は、熱力学的平衡解離定数を算出する（K d）およびⅱ）幾何学的要因、細菌ペプチド受容体はカンチレバー表面に分布されている方法の本質的尺度。ペプチド受容体の表面分布（p）は形状およびリガンドローディングの依存性を調査するために使用される。これは、pのしきい値〜10％が検出アプリケーションにとって重要であることが示されている。この値を超えて、曲げ信号はそのストレスを明らかにし、ほぼ直線的に増加している間は検出曲げ信号がありませんこれを下回ると、局所的な化学結合FACの産物である器と反応した地域の機械的な接続性によって結合幾何要因と超強力な感染症に対抗するための強力な薬剤の設計のための新しいパラダイムを提供します。

単H結合の削除に前例のない感度でナノスケールの精度を使用して測定された応力変化をリアルタイム（ 図2a-d）は 、モデル細菌細胞壁のバイオメカニクスの中断を追跡するために利用される。 バンのための薬剤の検出感度の限界が直列〜-9の平均値±を生じる最低検出濃度としては10nM（約15 ngの/ ml）を明らかにし、1,000μMから≤10 nMでのステップで、その濃度を希釈することにより調べた2差曲げ信号（ 図2c）のようなNM。生理的環境下で抗生物質を検出する能力は、さらに3-27μM17の臨床的に関連する濃度範囲において血清を調べた。同一の条件の下で、すべての片持ち梁の両端血清17.78μM ヴァン （90％ウシ胎児血清プラス10％のリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4）用の差動信号の注入の際血清中のダラだった 105±4nmのDLacコーティングカンチレバーのため、全く曲げます（ 図3）が観察されなかった。 ダラ被覆（バンコマイシン感受性の）カンチレバーに対して観察かなり曲げ信号が強い薬物標的の結合相互作用によって引き起こされます。しかしDLacの被覆（バンコマイシン耐性）カンチレバー、バンコマイシン結合ポケット10,12の酸素孤立電子対と減少NH結合の基底状態の反発力の存在をより少なく、その結果、薬物標的結合相互作用の弱体化に貢献または全くカンチレバーは特に低バンコマイシン濃度（ 図3）のために、曲げない。しかし、高バンコマイシン濃度のために、我々はDLacため測定可能曲げ信号を観測。さらに、我々の実験的なデザインは、 その場で参照のために重要であるすべてのCAダラとDLac両方でコーティングntileversを同時にリアルタイムで同じ検体にさらされている。 化学とジオメトリの正確な役割を理解するために、我々は、溶媒の相互作用と表面力学の間の相関関係を記述するモデル1を設計しました。これは、表面応力を生成します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/50719/50719eq1.jpg" /> P&gt; PCとそうでない場合はゼロ（1） 式の最初の項（1）は、ラングミュア吸着等温線、薬剤標的結合事象の会計処理であり、第2項は、ストレスを受けたネットワーク形成の大規模な機械的な影響を記述べき乗則フォームです。すべてのアクセス可能な結合部位が占有されている時定数は最大表面応力に対応し、K dは表面の平衡解離短所ですカンチレバーに重要。 図4に示すように、分析は明らかに測定された応力差動信号に重畳式のグローバルフィッティング（1）の結果である。〜29.7±1.0または14.1±3.0 MN / mおよびK dは 1.0〜0.3±または800±310表面応力の測定に対応し、すべてのアクセス可能な結合部位が占有されているD-アラまたはDLacペプチド用μM。 ウェブの関数として応力データを監視しながら抗生物質濃度はそれぞれ10,100、および250μM、（ 図5）に固定しながら、カンチレバーの感度の向上を系統的ペプチド濃度pを変化させることによって調整した。ペプチド密度が pに固定しながらプロセスがヴァン濃度の関数としてストレスを繰り返した〜100％。 &lt;IMG ALT = &quot;図1&quot;のfo：コンテンツ幅= &quot;5インチ&quot; SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg&quot; /&gt; 図1。抗生物質の表面結合相互作用のカンチレバー検出。薬物標的相互作用がnanomechanically検出されることによりカンチレバーセンサアレイ及びモード）模式図。b）は、薬物分子（ バン ）および細菌ムコペプチドアナログ（D-Alaで又はD-ラク ）との間の化学的結合相互作用。 c）の変異バンコマイシン感受性の細菌によるメカニズム（VSE）が結合ポケット内の単一の水素結合を削除することによって、バンコマイシンに対する耐性を獲得します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig1large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig2.jpg" /&gt; 図2。リアルタイムでモデル細菌細胞壁バイオメカニクスの中断を追跡。 A）D-Alaの、D-LACとリン酸緩衝液と250μMバンコマイシンにおけるPEGコーティングカンチレバーの絶対曲げ信号。差動PEG基準信号は、黒線で示されている。b）のD-Alaでリン酸緩衝液および250μMのバンコマイシンでD-Lacの被覆カンチレバー時間の関数としての用量依存信号。c）の差動カンチレバーのたわみの差曲げ信号10 nMの（黄色の線）、100 nMの（赤線）と、それぞれ1,000 NM（濃い赤線）の順にバンコマイシン濃度の存在下で、D）の差動カンチレバー偏向信号3 D-Alaでコーティングされたカンチレバーセンサー用として10の存在下における、時間の関数nmのバンコマイシンは<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50719/50719fig2large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig3.jpg" /> 図3。牛胎児血清で7μMバンコマイシンの存在下でD-アラとD-Lacのコーティングされたカンチレバーをリアルタイムでモデル細菌細胞壁のバイオメカニクスの混乱の追跡。 <img alt="図4" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig4.jpg" /> 図4。薬物ターゲット相互作用のナノメカニクスを調査。バンコマイシンの関数として測定差表面応力のD-Alaのための応答（黒丸）とD-Lacのを示すプロット（赤丸）コーティングされたカンチレバーは溶液中の濃度[バン]。データは、（1）式（実線）に記載されている。1 <img alt="図5" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/50719/50719fig5.jpg" /> 図5。混合された単層を介して受容体の負荷および形状の依存性を調べることにより、受容体-リガンド相互作用のナノメカニカル検出感度の最適化D-Alaで表面被覆率の関数として、カンチレバーセンサの測定差動表面応力応答は、の固定バンコマイシン濃度の存在下におけるp 10μM（黒線）、100μM（赤線）、および250μM（緑の線）での解。

抗生物質に対する獲得耐性は、主要な公共医療問題であり、現在は人間の生命への最大の脅威の一つとしてWHOによってランク付けされています。ここでは、多剤耐性菌のに対して新規かつ強力な薬剤の発見に重要な、抗菌性を定量化するカンチレバー技術の使用を記載している。

The cantilever sensor, which acts as a transducer of reactions between model bacterial cell wall matrix immobilized on its surface and antibiotic drugs in ...

本手順の全体的な目的は、薬物標的結合相互作用によって引き起こされる基礎となるモデル細菌細胞標的の機械的特性の変化を測定し、抗菌剤耐性を定量化することである。これは、まず、事前に洗浄したカンチレバーセンサーアレイの一面に20 nanometersの金薄膜を堆積させることで達成される。次のステップでは、薬物感受性および薬物耐性細菌の表現型を模倣した適切な表面標的を6つのカンチレバーセンサー上に自己組織化させ、残りの2つのカンチレバーセンサーには測定コントロールとして機能させるために、無関係な細菌モデル標的を組織化させる。次に、カンチレバーセンサーアレイを液体フローチャンバーにロードします。最終ステップとして、臨床的に適切な濃度範囲で薬物溶液を調製し、各濃度の薬物をカンチレバーセンサーアレイの上に順次注入します。最終的に、カンチレバーセンサーアレイの自由端に集光させたレーザー光を用いて、薬物と標的の結合相互作用から生じる表面応力の変化によって引き起こされるカンチレバーのたわみを測定します。表面プラズモン共鳴や水晶振動子マイクロバランスなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、薬物と標的の結合相互作用によって生じる表面歪みを検出し、各薬物が表面標的に結合することで生じる特定のナノ機械的な力を直接測定できる点にあります。この手法は、投与の速度、効率、および正確性など、薬理学分野における重要な疑問への回答に寄与します。一般的に、この手法に不慣れな者は、煩雑なサンプルのアライメントに苦労することがあります。しかし、我々は最近、初期のサンプルアライメントを必要としない新しい読み出し機構を開発しました。将来的には、この手法を用いることで、操作がより簡単かつユーザーフレンドリーになります。まず、テフロン製ピンセットを用いて、カンチレバーチップを調製したばかりのパラマ溶液に20分間浸します。本実験で使用するカンチレバーの寸法は、長さ500 microns、幅100 microns、厚さ0.9 micronsです。20分後、カンチレバーを取り出し、脱イオン水で十分に洗浄します。光学顕微鏡を用いて洗浄後のチップを検査し、不純物がないか確認してください。ダストや汚れが残っているチップは、再度新しいピラニア溶液に入れ、さらに20分間処理します。脱イオン水で十分に洗浄した後、チップを純エタノールでリンスし、ホットプレート上で75 °Cで約30秒間乾燥させて水分の痕跡を除去します。その後、光学顕微鏡を用いて再度点検し、清潔であることを確認します。洗浄済みのカンチレバーチップを、チタンおよび金ソースが装填された蒸着チャンバーへ移します。真空度が1×10⁻⁷ mbarに達するまで排気します。必要な真空度に達したら、各カンチレバーアレイの片面に厚さ2 nmのチタン層をコーティングします。次に、密着層として機能するチタンの上に厚さ20 nmの金層を堆積させるようにシステムを設定します。ターゲットソースの直上に配置した水晶振動子モニターで、各層の膜厚を確認します。適切な膜厚に達したら、金コーティングを施したカンチレバーチップをチャンバー内に1～2時間放置し、真空状態で冷却してからチャンバーを開けます。次に、いかなる汚染も防ぐため、カンチレバーセンサーチップをアルゴンで満たした真空保管容器に移します。カンチレバーチップは、ここで無期限に保存することが可能です。ただし、保存容器がない場合は、実験の直前に直ちに使用する必要があります。カンチレバーのピッチサイズである250 micronsに従って、機能化ステージ上のチャネルにマイクロキャピラリーチューブを配置します。次に、ガラススライドを用いてそれらを整列させ、実験中に動かないようクランプで固定します。続いて、純エタノールを用いて、薬剤感受性および薬剤耐性の細菌細胞壁標的に由来する葉酸修飾表面受容体の2つのミリモル溶液を調製します。次に、それぞれのマイクロキャピラリーチューブに個別のカンチレバーを挿入します。コンタミネーションを防ぐため、表面捕捉分子の溶液が各カンチレバーセンサー内にのみ限定されていることを確認します。次に、これらの表面捕捉分子の混合物をマイクロキャピラリーチューブにランダムに割り当て、割り当てられた各チューブに表面ターゲット溶液を 8 µL 注射します。カンチレバーを溶液中で 20 分間インキュベートします。この間に、調製したばかりの金コーティングカンチレバーの金コーティング表面に、標的となる細菌粘膜ペプチドが自己組織化して単分子層を形成し、化学的に活性なセンサーとなります。まず、0.1 molarの一塩基性および二塩基性リン酸ナトリウム塩を超純水に溶解し、pH値が7.4になるように混合した後、0.2 micronフィルターを用いて溶液をろ過します。次に、この緩衝液に0.002%のポリソルベート80を添加します。これにより、薬物分子のガラス器具への非特異的な相互作用に起因する凝集効果を最小限に抑えることができます。次に、バンコマイシンおよびオリンを、新鮮な緩衝液を用いて100 pico molarから250 micromolarの目的の濃度まで希釈します。これによりKDの算出が可能になります。サンプルをボルテックスおよび超音波処理し、緩衝液中での薬物の完全な溶解を確認します。また、血清タンパク質によって薬物作用が修飾されるかどうかを判定するため、血清中での溶解度も確認します。同様の薬物濃度を用いてこの手順を繰り返し、今回はそれらを全血清に添加します。また、薬剤を完全に溶解させるため、混合中に血清サンプルを計20分間ボルテックスします。最後に、カンチレバー全体の表面応力の検出を開始するため、溶液をアルゴンでパージします。まず、チップ上の機能化された8つのカンチレバーセンサーを液体フローセルチャンバーにロードします。次に、各センサーの自由端にレーザースポットを合わせます。液槽を1 °C加熱して、アライメントを確認してください。シリコンと金の膨張率の差によるバイメタル効果により、金コーティングされた8つのカンチレバーセンサーアレイすべてが、下方へ圧縮的に曲がります。約10分間加熱した後、個々のカンチレバーセンサー間における最大曲げ信号の曲げ変動を算出します。信号の相対標準偏差が5%以下であれば、アライメントが適切であると判断します。そうでなければ、アライメントの手順を繰り返してください。平衡状態を確実にするため、カンチレバーを10分間室温まで冷却します。次に、8本すべてのカンチレバーの共振周波数を測定し、ばね定数を算出します。各カンチレバーセンサー間のばね定数のばらつきが1%以下であれば、校正を承認します。あるいは、ここに示すシリンジポンプのようなカンチレバーチップセンサ接続流体システムを、6方弁を介して承認済みのチップに置換します。システムの流量を30から180 µL/minの一定速度で動作するように設定し、システム全体を25 °Cの温度制御キャビネット内に設置します。その後、薬物を添加しないバッファーのみ、または血清のみの注入を開始し、5分から30分間にわたってコントロールのベースライン測定を行います。自動ラボビューソフトウェアを起動し、各カンチレバーからの偏向データを同時に取得します。単一の位置感応検出器を用いたシリアル時間多重光ビーム法を使用して、8本すべてのカンチレバーの絶対曲げ信号をモニタリングします。ベースラインが取得されたら、テストサンプルの後に薬剤溶液を30〜60分間注入します。結合した薬剤複合体を解離させるため、10 millimolar HCL洗浄液を10分から1時間注入します。本システムを用いることで、ナノスケールの精度および単一の水素結合の欠失に対する前例のない感度を実現することが可能です。ペプチド鎖末端がD alanineからD lactateに変化すると、バンコマイシンの結合が著しく減少するため、DLAC配列を持つ細菌はこの治療法に対して耐性を示します。D alanineで終わるペプチド鎖に対して様々な濃度の薬剤でテストしたところ、バンコマイシンは用量依存的な効果を示し、検出可能な最低濃度は約10 nanomolarであることが示されました。このシステムの生理的環境における抗生物質検出能をさらに検討するため、臨床的に意義のある濃度である7 µMの血清を用いて検証を行いました。D-アラニンでコーティングしたカンチレバーは、これらの条件下でも依然としてかなりのたわしみを示しましたが、DLACでコーティングしたものは示しませんでした。複数の薬剤濃度のデータポイントを用いることで、薬剤と標的の結合事象を記述するモデルを作成することが可能です。ここに示されているフィッティングラインは、ラングミュア吸着等温線と、ストレスを受けたネットワーク形成による大規模な機械的影響を記述する項を組み合わせたものです。この手法を習得すれば、適切に実施することで、薬剤投与の効率と正確性の確認、および細菌耐性の兆候の検出を数分で行うことができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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