Name: Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 31 s
Description: 学ぶアルファヘルペスウイルスの順行性輸送と細胞間スプレッドの生細胞イメージング法。蛍光融合タンパク質を用いて一次ニューロン内のウイルス動態を可視化し、感染メカニズムの理解を深める。

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LWEとRKは健康補助R37 NS033506-16とR01 NS060699-03の米国の国立研究所によってサポートされています。 MPTは、アメリカ癌協会ポスドク研究フェローシップ（PF-10から057-01-MPC）によってサポートされていました。博士マシュー·ライマン博士とオレンKobilerのアドバイスや知識は、顕微鏡の構成と生細胞イメージング法を設計に尽力しました。また、顕微鏡の取得、インストール、およびパフォーマンスの彼らの技術支援のためにニール·バーロウとニコンインスツルメンツ社のブライアン·T·ケインのおかげで拡張します。

セクション1 - ライブセル蛍光顕微鏡のための環境制御条件<ol><li>任意のイメージング実験前に30分接続し、顕微鏡ステージトップインキュベーターを温め始める。 <ol><li>顕微鏡、透過および落射蛍光光源、および自動化されたハードウェアコントロールをオンにします。顕微鏡に接続し、EM-CCDカメラの冷却を開始する顕微鏡制御ソフトウェア、NISの要素を開く。 </li><li>適切な目標（どちら60Xまたは100X油浸）に暖かいレンズを取り付け注：実験の種類に基づいて対物レンズを選択します。 60X相目的は順行性の広がりを可視化するために適している間100X微分干渉コントラスト（DIC）は、順行性輸送ビリオンアセンブリの追跡のために最適です。彼らはサンプルに直接接触しないように低倍率、非油浸対物レンズは、レンズが暖かい必要としません。 </li><li>マイルの電動ステージ上にステージ天インキュベーターを取り付け<html> croscope。サンプルが所定の位置にある保持する適切な挿入を確認してください。インキュベーターコントロールからステージトップインキュベーターの入力ポートに加湿空気ラインを取り付けます。 </li><li>インキュベーターとレンズ暖かいコントロールをオンにして、撮像されている客観的サンプルの特定以前に検証条件に温度設定を調整（説明を参照してください）​​。 </li><li>トップインキュベーターを上演するためにCO 2補足空気を提供するために、5％CO 2/95％大気のタンクに制御バルブを開きます。流量は毎分ガスの60〜80ミリリットルであるべきである。速い速度は、加湿チャンバーにもかかわらず、大規模なサンプルの脱水になります。 </li></ol></li><li>対物レンズにレンズオイルを追加し、すぐにステージ天インキュベーターに結像される文化を配置。 </li><li> 10分の最低文化の中での温度の平衡を許可します。一時間は、特に第3章で述べた一晩イメージングのため、好ましい。 </li></ol>ve_title &quot;&gt;セクション2 - 順行ビリオントランスポートイベントプロトコルのリアルタイムイメージング<ol><li> 6〜8時間前のイメージングに、テイラーらに記載された方法を使用して興味のあるウイルスの1×10 6プラーク形成単位を持つ成熟した、解離SCGニューロンの35ミリメートルカバースリップボトムディッシュ（例：ウイルスについては、表1を参照）感染ら 2012A 11。複数のウイルスをテストする場合は、30〜60分間でオフセット接種は、同様の回感染後に、順次サンプルのイメージングを可能にするために。 </li><li>どんな実験を実行する前に、10分の最低限の舞台トップインキュベーターに皿を挿入します。温度が平衡しながら、焦点面がシフトしていると否定的に任意のイメージング実験に影響を与えます。 </li><li>透過光、顕微鏡の接眼レンズを使用して、はっきりと分離された軸索の拡張子を持つ神経細胞体を見つける。また、検出を発現する細胞を見つけることが、適切な蛍光照明を使用蛍光タンパク質の表の金額。それがために、光誘起される細胞の損傷のと蛍光タンパク質の漂白、このステップとその後のステップで、蛍光灯照明にサンプルの露出を制限することが重要である。 </li><li>細胞が暴露される励起光の強度を低減する蛍光照明を減衰させる。蛍光照明光路中の中性密度（ND）フィルターを減衰させる光を従事。 1分よりも長く持続するムービーでは、ND4の最小は、光漂白蛍光タンパク質と軸索の光損傷広範囲を防ぐために使用しなければなりません。高い蛍光の構造は、一般的な場所にND8フィルターで可視化することができます。 </li><li>顕微鏡ソフトウェア（ 図2及び補足作品1A）を使用して、EM-CCDカメラへの光路を切り替える。 </li><li>各蛍光チャネルに最適な画像処理時間と条件を決定する。 <ol><li> &quot;プレイ&quot;ボタンを使用したライブ画像ウィンドウを開始します&lt;/李&gt; <li>各蛍光タンパク質のための最適なカメラの露出設定を決定します。高速移動ビリオン構造の運動収差が発生するようにチャネルあたり300ミリ秒を超えないようにしてください。 （メーカーが最大利得を示唆）、露光時間を短縮し、薄暗い信号の検出を強化するために300の設定にカメラのEMゲインを利用する。適正露出時間は、低いバックグラウンド強度の高い特定の信号で画像を生成する必要があります。 </li></ol></li><li>エクスポージャーを設定し、軸索の明確に定義された領域を発見した後、ソフトウェアは、自動画像取得を実行するように構成されなければならない。漂白サンプルを防ぐために、ライブイメージングウィンドウを停止します。 <ol><li> NISの要素ソフトウェアで、6Dを選択-定義/ダウンメニュー&quot;アプリケーション&quot;ドロップダウンから実験アプリケーションを実行します。 </li><li> ND取得ウィンドウで、画像取得の頻度を決定するであろう時間]タブをクリックします。 &quot;遅延なし&quot;と時間5分にする間隔を設定します。木曜日電子ソフトウェアは、5分間の間、可能な限り高い周波数で画像フレームを取得する。 </li><li>複数の蛍光画像取得のために使用され、あらかじめ設定ハードウェア構成の選択を可能にする &quot;ラムダ&quot;のタブを選択します。最初のボックスをクリックし、メニューダウン続くドロップ適切なハードウェア構成を選択する。撮像されるすべての蛍光タンパク質について、この手順を繰り返します。 </li><li> &quot;XY体位&quot;、 &quot;Zシリーズ&quot;と &quot;大画像&quot;のタブが非選択であることを確認してください。 </li><li>タブの上に、マークされたボックスが自動的に取得中にハードディスクに画像を保存するには、 &quot;ファイルに保存&quot;を選択します。実験出力ファイルの場所とファイル名を設定する。シーケンシャルな実験が行われたように、ソフトウェアは、指定されたファイル名の末尾に連番が追加されます。 </li><li>一度にすべてのタブが選択されています。 &quot;実行今&quot;ボタンをクリックして実験を開始します。 </li><li>露出設定を介して画像取得速度を最適化し、IMAGEサイズ。イメージ可能領域の小さな領域を使用すると、多くの場合、フレーム取得率をスピードアップします。 25％、総画像面積の50％との間の領域を選択して、NIS-ElementsでROIツールを使用して、関心領域を定義する。あるいは、より短い露光時間がフレーム取得速度を増加させるが、信号の品質を低下させる（議論を参照）になる。 </li></ol></li></ol>セクション3 - 順行スプレッドイベントの晩タイムラプスイメージング<ol><li>イメージングの前に四時間は、35ミリメートルμ-ディッシュ上に構築区画神経文化に感染。テイラーらに記載された方法を使用して（たとえば、ウイルスについては、表1を参照）興味のあるウイルスの1×10 6プラーク形成単位と神経細胞体を接種する。2012B 12。 </li><li>ゆっくりステージトップインキュベーターに培養皿を置きます。目的の位置が皿の側に設定されていることを確認。ゆっくり焦点、ensurに目的を持って目的をINGは、サンプルに押し上げていません。フォーカスフィールドが識別されると、徐々に軸索コンパートメントの内部側に境界を定める内部障壁の近傍に、皿の中心に対物レンズを移動させる。移動中に、焦点深度が維持されていることを確認し、試料中に押し上げ避ける。目的によってプラスチック表面のたわみは、軸索とプラスチックが破損します。 </li><li>暖かいの約2 mlを加え（〜37°C）、リン酸はテフロンリングの外で培養皿に緩衝生理食塩水。これは、サンプル脱水を最小限に抑え、断熱を提供するために、PBSのリングと神経細胞培養物を取り囲んでいる。 </li><li>温度が自動化された画像取得（3.8）を開始する前に1時間の最小平衡化することができます。 3.7〜ステップ3.5は、この期間中に設定することができます。 </li><li>すべてのNDフィルターを係合することにより、可能な限り低いレベルに照明の強度を制限します。これは、頻繁な画像取得がオベできるようになります過度の光損傷せずにrを長期間。照明を減らすことは（説明を参照してください）​​より長い露光を必要とする、低信号になります。 </li><li>歴史的な露出設定を使用するか、前に実験のセットアップ2.5節で説明したように露出設定を確立するために、ターゲットの蛍光タンパク質を発現する感染上皮細胞のパラレルディッシュを生成します。 </li><li>必要なチャネルに対してエクスポージャーを設定した後に、自動化された画像取得用のソフトウェアを構成するための時間である。漂白サンプルを制限するために、ライブイメージングウィンドウを停止します。 <ol><li>要素ソフトウェア（ 図2および補足映画の2）において、6Dを選択- ND集録ウィンドウを表示するためにダウン&quot;アプリケーション&quot;ドロップダウンメニューから実験アプリケーションを定義/実行します。 </li><li> ND取得]ウィンドウで、[時間]タブをクリックします。 &quot;5分&quot;の間隔を設定します。 20時間の時間を設定します。ループフィールドが自動的にPROGRA繰り返し数について計算されるmは、実行されます。 </li><li> &quot;ラムダ&quot;タブを選択します。最初のボックスをクリックし、メニューダウン続くドロップ位相コントラストのための適切なラムダ構成を選択します。撮像される各蛍光タンパク質の適切な設定を選択すると、その後のポジションのために繰り返します。 </li><li>ビューの単一のより大きなフィールドに結合される複数の画像のパラメータを決定する &quot;大画像&quot;タブを選択します。良いサイズの面積は7％ステッチのオーバーラップを使用して5×2の画像で構成されています。これは、画像取得の周波数に影響を与えずに撮像される位置当たりのセル数の最大値を可能にする。また、 &quot;ステージ移動中に閉じるアクティブシャッター&quot;のチェックボックスを選択解除します。このオプションでは、画像間のシャッターを閉じていないことで買収の速度を向上させます。 </li><li>順次一夜映画の過程で並行して画像化される複数の位置を識別するために、 &quot;XY体位&quot;タブを選択します。中心Poを定義する位置を選択してくださいそれぞれの大きな画像領域のint型。試料中に6-8画像位置を選択します。良好な画像領域は、明確に定義された軸索に近い並置内のセルの小さなクラスターを有する。細胞は最小化されるべきで互いに軸索同梱の上に積まれてはいけません。ピント位置は、細胞の核である。明確に定義された核膜は細胞の大多数のために見られるような目標を置きます。 </li><li> &quot;Zシリーズ&quot;のタブの選択が解除されていることを確認。 </li><li>セクション2.6.5に上記のような自動保存機能を設定します。 </li><li> &quot;1時間のループ&quot;をクリックすることで、露出や位置の設定をテストします。透過光照明、フォーカス、フレーミングの結果の画像を評価します。焦点がずれている場合は、XY]タブの下に、それぞれのポジションにフォーカスをリセットします。 10分待って、フォーカスが安定するまで、この手順を繰り返します。 </li><li>すべての設定が検証され、テストされた後、 &quot;今すぐ実行&quot;ボタンをクリックすることで、自動化された実験を開始する。 </li></ol></lI&gt; </ol>セクション4 - 画像処理とエクスポートデータのエクスポート<ol><li>輸送やスプレッドのイベントのライブセルイメージングの間に得られたデータセットは、プレゼンテーションや出版物（補足ムービープレビュー3）後で使用するために一般的に使用されるフ​​ァイルタイプにNISの要素ソフトウェアからエクスポートする必要があります。エクスポートするには映画はNISの要素に適切なRAW。ND2ファイルを開いて、目的の蛍光チャンネルを視覚化する &quot;スプリット·コンポーネント&quot;ビューを選択します。適切な速度で再生ファイル;毎秒5フレームは、高速輸送の可視化のための良い出発点です。 </li><li>動画再生中にリアルタイムクロックを表現するためにタイムスタンプが含まれています。画像を右クリックして、選択して、ND-情報を追加します。デジタルカウンターは、左上隅に表示されます。 <ol><li>情報を表示するには、タイムスタンプを編集します。右カウンターの上にクリックし、[Edit] ND-情報を選択します。その後のポップアップウィンドウで、イマジを反映するためにテキストを編集重要なパラメータはNG。わかりやすくするためにフォント、色、サイズを編集します。 </li></ol></li><li> &quot;編集​​&quot;メニューに移動し、 &quot;ビューのスナップショットを作成します&quot;または &quot;X&quot;キーを押して見つける。このコマンドは、 &quot;ビューのスナップショット&quot;ウィンドウが開きます。 8ビットを生成するために、RGB、ムービー全体からの蛍光チャンネルを含むエクスポート対応ファイル &quot;すべてのフレームに適用&quot;を選択します。 </li><li>クロスプラットフォーム互換性のために。aviファイルとして保存します。フレームあたり200ミリ秒で、再生速度を設定します。 NISの要素によって生成された。aviファイルは、その後、さらに目的のファイルの種類に他の変換ソフトで圧縮することができます。 </li></ol>

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

彼らは観察の行為によって重大な変更を加えること無く発生したライブセルイメージングの目的は、生物学的プロセスを観察している。環境制御、撮像速度、および蛍光照明：この目的は、3つの変数を最適化することによって達成される。これらの相互依存変数が実行可能な撮影条件を達成するためにバランスをとらなければなりません。提示プロトコルは、代表的な結果を生成するために特定の条件を利用する。我々は簡単に提示された具体的な方法を詳述する前に、環境コントロールと観察ダメージを説明します。 顕微鏡に関連する生物学的な条件を確立し、維持することは、携帯電話のイベントの成功を監視するために重要である。ターゲット条件を達成する顕微鏡インキュベータ構成に固有の変数の数に依存する。すべてのインキュベーターの設定は取らインキュベーター内でモックサンプルの独立した温度測定を使用して検証されるべきである客観的な接点、培養皿の真ん中に、培養皿の端;を含む複数の位置で。設定は1より37℃以上C暖かい°Cと同様℃で客観接触点で近い37の温度を維持している領域を最小化するために最適化する必要があります。イメージングのために使用され...

alphaherpesなどの単純ヘルペスウイルスなどのウイルス（HSV）-1、-2、および仮性狂犬病ウイルスによる末梢神経系（PNS）の感染（PRV）ウイルスのライフサイクル全体を通じて、いくつかの複雑かつ高度に規制の手順が必要。 PNSの神経細胞内の輸送は、プライマリウイルス感染とその後のホスト間の広がりの両方のイベント中に、非常に重要です。ウイルスのライフサイクルの二つの成分を調節する分子機構、感受性細胞へ離れて軸索内の細胞体（順行性輸送）からのウイルスアセンブリの監督輸送とビリオンのその後の送信（順行スプレッド）はヘルペスウイルスの病因を理解する上で重要です。 神経細胞におけるウイルス粒子の輸送と出口は、成熟感染性ビリオン1,2のアセンブリに依存しています。免疫蛍光法（IF）および電子顕微鏡（EM）を含む予め固定されたアッセイは、粒子の組立て状態とprotのを研究するために使用されたビリオン輸送と広がり3-6関連付けられたEINの相互作用。しかし輸送ビリオンおよび化学固定によって導入された実験的な成果物の動的な性質は、固定された画像7,8の解釈を混同。最近、ウイルスの蛍光融合タンパク質の数は、タンパク質の機能にほとんど影響を与えるHSVおよびPRVについて記載されている。キャプシド、被包、および糖タンパク質9-11：緑色蛍光タンパク質（GFP）及びレッド蛍光タンパク質（mCherryまたはmRFPを）フルオロフォアは、しばしば、成熟ビリオンの3つの構造構成要素のうちの2つの撮像を可能にするように対になっている。二重標識ウイルスを用いた順行性輸送の生細胞イメージングは​​輸送中のウイルス粒子の組立て状態を可視化する。ウイルス株を発現する同様の蛍光体は、数および拡散12,13に続くウイルスゲノムの多様性を可視化するために使用される。蛍光タンパク質の特性は（14,15で検討）が大きく影響しウイルスまたは細胞のアセンブリを視覚化する能力。野生型の機能性の保全のための新規なタンパク質融合を設計し、テストするときに、自己相互作用と安定性を含む蛍光タンパク質、、の本質的な特性を考慮する必要があります。 蛍光タンパク質融合と組み合わせて、二人はインビトロでの細胞培養系において十分に特徴付けヘルペスウイルス感染の生細胞のイメージングのために使用される（ 図1A）16解離し、17区画ラット上頸神経節（SCG）ニューロン。両方のシステムでは、胚のSCGのは、単一の細胞体への解離、解剖され、in vitroで培養する18のためにメッキ。 SCGニューロンは、自律神経系の一部であり、容易に成熟した偏光状態を ex vivoで培養し、神経細胞への成長因子（NGF）によって区別することができる。解離SCGニューロンは、Fを可能に軸索の拡張されたネットワークを形成彼らは順行性輸送6を受けるようにウイルス粒子のか視覚化。区分SCG文化が神経細胞体（S区画）および遠位軸索末端（Nコンパートメント）19の流体分離を提供。原稿20又は変性Campenotチャンバ17を用いて区画ニューロンの構造及び使用のための詳細なプロトコルの数は、以前に公表されている。流体分離は、神経細胞体と孤立軸索末端への輸送後の子孫ビリオンの検出を選択的に感染することができます。感染前末端上の上皮細胞をメッキするとウイルス感染の広がりのためにレシピエント細胞を提供する。 そこにすべてのライブセルイメージング実験のための重要な多くの重要な要素がありますが、我々のプロトコルに最も関連性があります：自動画像取得、蛍光灯照明、画像処理の速度、および環境制御。すべてのイメージング実験のために、我々が使用する反転、自動化され、落射蛍光照明顕微鏡（ 図1B）。顕微鏡はニコンエクリプスTiの基盤を中心に構築され、急速に再構成する自動画像取得中に顕微鏡を、コンピュータ制御電動システムの数を採用しています。蛍光照明のために、我々は、照明経路に沿って中性密度フィルタを減衰させることができる広域スペクトル水銀アークランプを使用する。励起フィルタは、蛍光照明のスペクトルを制限し、マルチパスダイクロイックミラーと蛍光発光フィルター特定の蛍光化合物を可視化と組み合わせた場合。励起および発光フィルターが異なる蛍光チャネルの急速順次取得を可能にするために独立した、高速スイッチングフィルターホイールに取り付けられている。画像取得速度が低い強度信号と短い画像の検出のための読み取り時間を有用な、高感度かつ高速のEM-CCDカメラではさらに向上する。 microsc上の環境制御OPEをインキュベーター加熱ステージ上と加湿CO 2に富んだ雰囲気をインキュベーターに渡されながら高温で試料を保持する対物レンズヒーターで達成される。顕微鏡は近い25までのすべての窓に遮光カーテンで最小化℃、外光を維持し、周囲温度と暗い部屋に保管されています。以下のプロトコルでは、順行性輸送及び拡散アッセイのための本システムの使用を記載している。 選択肢の数は、ライブセルイメージングの変数をコントロールするために存在します。顕微鏡の制御設定は、手動またはプロプライエタリ·ソフトウェアに依存して自動化システムを介して行うことができる。蛍光照明は、ハロゲン、LEDまたはレーザーソースで実現することができる。イメージング速度は、フィルタ切り替えの速度および一対の検出系と信号を可視化する時間によって修正される。環境制御は、マイルに専用のハードウェアで実現することができますcroscopeステージ全部または加熱および加湿ボックスで顕微鏡の一部、または顕微鏡検査が実行される部屋の温度を上げることによってのエンクロージャ。これらの選択肢の各々は、コストおよびパフォーマンスに関連する利点と欠点を有する。 その後のプロトコルでは、我々は詳細換えウイルス株を使用することにより迅速な順行性輸送とalphaherpesウイルスの順行広がりを研究するライブセルイメージングを使用すること。リアルタイムのライブセルイメージングは軸索11内輸送を受けて動的構造体上のカプシド、被包、および/ ​​または糖タンパク質の共局在を可視化する。区分ニューロン培養の一夜タイムラプスイメージングは、感受性細胞の軸索のビリオン出口と感染12を可視化する。ここで提示プロトコルは、我々の特定のイメージング·システムと共に使用するために最適化されているが、生細胞のイメージングの四つの要素に対して大まかに示されている。議論では、私たち更に詳細は成功実験のために必要である最適化のいくつかの意志。

<table><tbody><tr><td>35 mmガラス底培養皿</td><td>MatTek Corporation;アッシュランド、マサチューセッツ州</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>35 mm &mu;-Dish </td><td>Ibidi USA LLC、ヴェローナ、ウィスコンシン</td><td>州81156</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡本体 </td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>ニコンエクリプスTi</td><td></td></tr><tr><td>電動顕微鏡XYステージ</td><td>Prior Scientific;マサチューセッツ州ロックランド</td><td>H117 ProScan フラットトップ</td><td></td></tr><tr><td>電動フィルターホイール</td><td>Prior Scientific</td><td>HF110 10 ポジションフィルターホイール</td><td></td></tr><tr><td>蛍光照明源 </td><td>Lumen Dynamics;カナダ・オンタリオ州ミシサガ</td><td>X-Cite 120Q</td><td></td></tr><tr><td>マルチバンド蛍光フィルターセット</td><td>Chroma Technology Corp.;ベローズフォールズ、VT</td><td>89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET</td><td></td></tr><tr><td>EM-CCDカメラ</td><td>Andor Technology USA;コネチカット州サウスウィンザー</td><td>iXon3 897</td><td></td></tr><tr><td>Chamlide ステージトップ環境インキュベーター</td><td>Live Cell Instruments;ソウル、韓国</td><td>TC-L-10</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズヒーター</td><td>Bioptecs;バトラー、ペンシルバニア</td><td>州150803コントローラー150819-12-08ヒーター</td><td></td></tr><tr><td>分析ソフトウェア</td><td>Nikon Instruments Inc.;ニューヨーク州メルビル</td><td>NIS Elements</td><td></td></tr></tbody></table>

alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

生細胞の蛍光顕微鏡技術と同様に、蛍光融合タンパク質を発現する組換えウイルス株の構築の進歩は、輸送およびニューロンのalphaherpesウイルス感染の広がりのリアルタイム可視化を有効にしている。ライブセルイメージングと一緒にウイルス膜、被包、およびキャプシドに新規蛍光融合タンパク質の有用性は、軸索内輸送を受けてウイルス粒子アセンブリを同定した。同様のツールが正常細胞との間で送信さビリオンの数と多様性を定量化するウイルス粒子の広がり細胞 - 細胞の分析に用いられてきた。重要なのは、順行性輸送と普及のライブセルイメージングの技術は、粒子輸送速度、粒子の分布、およびタンパク質の局在の時間的分析を含む豊富な情報を生成します。古典的なウイルスの遺伝子技術と並んで、これらの方法論は、重要な洞察を提供してきた重要な機械論的な質問へ。この記事では、詳細にalphaherpesウイルス輸送と広がりの基本的な質問に答えるために開発された撮像法について説明します。

順行性輸送 PRV 348と解離SCG文化の感染症にこのプロトコルのアプリケーションでは、GFP-US9とGM-mCherry膜融合タンパク質を発現する組換えPRV株は、ビリオンの順行性輸送（ 図3及び補足作品4）の可視化を促進してきた。涙点を輸送する上でそれらの検出でウイルス粒子の結果、および前述の撮像条件にこれらの融合タンパク質の取り込みは、フィルタ切替時の移動粒子の各蛍光体のオフセットを最小限に抑えます。 3分間の映像ウィンドウでは、多数の輸送涙点は、一般的に観察されると共局在解析のための大規模なサンプルサイズが急速に生成されます。我々は以前、このアプローチ11を使用して他の構造タンパク質で、タンパク質を標的alphaherpesウイルスは軸索、GFP-US9の共局在を定量化している。他のデュアルrecombinan同様の分析tのPRV株はまた11に記載されており、最近の研究は、このプロトコル21のさらなる拡張で蛍光標識ホストモータータンパク質とPR...

alphaherpesウイルス感染のライブセルイメージングに向け輸送と細胞間スプレッドの動的事象の分析を可能にします。ここでは、一次ニューロンのウイルス感染中にアセンブリの可視化を容易にするために、蛍光融合タンパク質を発現する組換えウイルス株を利用する手法を提案する。

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

この手順の総合的な目的は、一次神経細胞培養において蛍光タンパク質融合を用いてヘルペスウイルスの輸送と拡散のイベントを可視化することです。これは、まず、蛍光照明の高速切り替えが可能な顕微鏡上で、生理学的に適切な温度でサンプルのインキュベーションを行うことで達成されます。第二のステップでは、妥当なデータを取得しつつ、細胞への光損傷を制限するように蛍光イメージングのパラメータを設定します。次に、蛍光チャネルの逐次取得またはマルチポジションでの取得を行います。最終ステップで、マルチイメージのタイル状フレームを取得します。その後、データを解析し、プレゼンテーションや出版用に再フォーマットします。最終的に、この生細胞イメージング法は、ニューロン内における蛍光標識ウイルス粒子の移動を追跡し、細胞間での感染の広がりを追うために用いられます。この手法により、ヘルペスウイルスがニューロン内でどのように輸送され、拡散するかについての知見を得ることができます。また、粒子のエンドサイトーシスによる取り込みや細胞遊走など、細胞生物学および微生物学におけるその他の動的な現象にも適用可能です。イメージング実験を行う前に、顕微鏡ステージトップインキュベーターを接続し、温め始めてください。30分後、顕微鏡、透過光およびエピ蛍光光源、ならびに自動ハードウェアコントロールの電源を入れます。次に、顕微鏡制御ソフトウェアであるNIS elementsを開き、顕微鏡に接続します。ここでは、NIS elementsの標準的なユーザーインターフェースのスクリーンショットが表示されています。再生および停止ボタンは、現在のイメージング用ハードウェア構成および現在イメージングされている対象を示すライブイメージウィンドウを制御します。上部パネルには、透過照明または蛍光検出用に顕微鏡を構成するためのプリセットハードウェア設定を実装する一連の光学構成が並んでいます。カメラ制御および露出設定により、画像品質と速度を最適化するようにカメラ検出を構成できます。すべての実験は、ND撮影コントロールを使用して調整されます。次に、適切な油浸対物レンズにレンズウォーマーを取り付け、その後、顕微鏡の電動ステージにステージトップインキュベーターを取り付けます。サンプルを保持するための適切なインサートが装着されていることを確認し、インキュベーターコントロールからの加湿エアラインをステージトップインキュベーターの入力ポートに接続します。インキュベーターとレンズウォーマーのコントロールをオンにし、イメージングする目的物およびサンプルに合わせて事前に検証された条件に温度設定を調整します。最後に、5%carbon dioxide 95%atmosphericタンクのコントロールバルブを開き、ステージトップインキュベーターに二酸化炭素を補充した空気を供給します。ビリオンの輸送イベントをリアルタイムでイメージングするには、まず、感染させたニューロンを含む細胞培養ディッシュを、実験を開始する10分前までにステージトップインキュベーターに挿入します。次に、透過光と顕微鏡の接眼レンズを用いて、軸索伸展が明確に分離している神経細胞体を探します。神経培養物の中で撮像可能な領域を見つけることが、この手順において最も困難な部分です。細胞の増殖不良や感染が発生した場合に備えて複数の培養物を準備しておくか、あるいは撮像中に培養物を物理的に刺激することで、成功率を高めることができます。次に、顕微鏡ソフトを使用して光路をEM CCDカメラに切り替え、「再生」ボタンをクリックしてライブ画像ウィンドウを開始します。各蛍光タンパク質セットに対して最適なカメラ露出設定を決定した後、カメラの電子増倍ゲインを300に設定します。これは、露出時間を最小限に抑え、微弱な信号の検出能を高めるためです。サンプルの退色を防ぐため、ライブイメージングウィンドウを停止させてください。次に、露光時間を設定し、NIS Elementsで軸索の明確な領域を特定した後、連続画像取得の設定を行います。アプリケーションのドロップダウンメニューを開き、「6D define run experiment」アプリケーションを選択します。ND acquisitionウィンドウで「time」タブをクリックし、画像取得の頻度を決定します。間隔を「遅延なし」に、時間を5分に設定します。次に、「Lambda」タブをクリックして、複数の蛍光画像取得に使用されるプリセットハードウェア構成を選択します。最初のボックスをクリックし、続いて表示されるドロップダウンメニューから、適切なハードウェア構成を選択してください。「ファイルに保存」ボックスを選択し、実験出力ファイルの保存場所とファイル名を設定します。すべてのパラメータを設定したら、「今すぐ実行」ボタンをクリックして実験を開始します。画像取得速度は、露光設定および取得画像のサイズによって最適化されます。NIS elementsの関心領域（ROI）ツールを使用して、関心領域を定義します。全画像面積の25%から50%の範囲の領域を選択し、エンターグレード（enter grade）拡散イベントのオーバーナイトタイムラプスイメージングを行います。まず、培養ディッシュをステージトップインキュベーターにゆっくりと設置します。対物レンズの位置がディッシュの横に設定されていることを確認した後、サンプルを押し上げないように注意しながら、ゆっくりと対物レンズのピントを合わせます。焦点面が特定できたら、対物レンズをゆっくりとディッシュ中央の内部バリア付近まで移動させ、深度のピントを維持し、サンプルを押し上げないように注意しながら、軸索コンパートメントの内側をマーキングします。次に、サンプルの脱水を最小限に抑え、断熱性を確保するため、テフロンリングの外側に約2 mLの37 °CのPBSを加え、培養ディッシュ内のニューロンを囲みます。次に、すべてのNDフィルターを適用して照明強度を可能な限り低く制限し、過度な光損傷を抑えながら長期間にわたって頻繁に画像取得を行えるようにします。ND取得ウィンドウで「large image」タブをクリックし、5×2枚の画像で構成される領域を選択します。7%のステッチングオーバーラップを用いて、複数のポジションを並行して順次撮影します。オーバーナイト撮影の間、「XY positions」タブを選択します。次に、各広視野領域の中心点となる位置を定義します。焦点は細胞核に合わせ、大部分の細胞で核膜が明確に観察されるように対物レンズを調整してください。次に、1回のループをクリックして露光と位置の設定をテストし、得られた画像について透過光、照明、フォーカス、およびフレーミングを確認します。すべての設定が検証およびテストされた後、[run now]ボタンをクリックして自動実験を開始し、ライブセルイメージング中に得られたムービーをエクスポートします。まず、NIS elementsで適切なraw ND2ファイルを開き、[split component view]を選択します。目的の蛍光チャネルを視覚化するために、適切な速度でファイルを再生します。高速輸送の視覚化には、動画再生中にリアルタイムクロックを示すタイムスタンプを含めるため、毎秒5フレームから開始するのが適しています。画像上で右クリックし、[ADD ND information]を選択してください。画面左上にデジタルカウンターが表示されます。タイムスタンプを編集するには、カウンターを右クリックし、「edit ND information」を選択してください。続いて表示されるポップアップウィンドウ内で、関連するイメージングパラメータを反映するようにテキストを編集します。視認性を高めるため、テキストのフォントの色とサイズを調整してください。次に、編集メニューから「Create view snapshot」を選択してビュースナップショットウィンドウを開き、全フレームに適用を選択して、全ムービーの蛍光チャネルを含む8ビットRGBエクスポート用ファイルを生成します。最後に、クロスプラットフォーム互換性のためにファイルをAVI形式で保存し、再生速度を1フレームあたり200 millisecondsに設定します。この位相差画像には、逆行性ビリオン輸送イメージングに用いられた、代表的な成熟した解離上頸神経節（SCG）培養細胞が示されています。偽狂犬病ウイルス（PRV 3 48）に感染したニューロンは、GFP-S9およびGm-mCherry膜融合タンパク質を発現しています。この図では、P RV 3 48感染後8時間におけるSCG軸索の代表的な生細胞イメージングを示しています。遠位軸索内の順行性輸送構造が、GFPとmCherryの2つの蛍光チャネルで可視化されています。白い矢印で示された順行性輸送構造が、軸索内を前進しています。蛍光チャネルの逐次的な取得とウイルス構造の急速な移動により、2つの蛍光タンパク質の位置にずれが生じています。本プロトコルをPRV 3 48で感染させた解離SCG培養に適用することで、Vonの順行性輸送の可視化が容易になりました。これらの融合タンパク質がウイルス粒子に取り込まれることで、移動する蛍光点として可視化される輸送プンクタ上での検出が可能になります。前述のイメージング条件により、フィルター切り替え時における移動粒子上の各蛍光色のオフセットを最小限に抑えています。高速切り替えフィルターホイールとペアのマルチパスダイクロイックミラーを利用することで、3分間のイメージングウィンドウ内で、最大0.8 frames per secondの速度で2つ以上の蛍光チャンネルを迅速に連続取得することが可能です。多数の輸送Puntaが一般的に観察され、共局在解析のための大きなサンプルサイズを迅速に生成できます。ここでは、本画像に示されているコンパートメント化培養システムの概略図を示しており、左側のコンパートメントにSCGニューロンを播種し、軸索突起が内部障壁の下を通って右端のコンパートメントまで伸びている様子が描かれています。以下の画像は、PRV 4 27に感染した軸索から受容上皮細胞へのビリオン伝播を捉えた、大規模なタイル状タイムラプス動画から選択したものです。最初のパネルでは、感染後の時点における伝播したYFPおよびRFPの蛍光画像が表示されています。ここでは、受容細胞が膜結合型YFPおよびVP 26 MRFP融合タンパク質を発現し始めた様子が示されています。白い枠で囲まれた部分は、感染したカプシドアセンブリを含むレシピエント上皮細胞の領域を示しています。ここでは、前の画像と同じ領域をRFPチャネルのみで観察した状態で示しています。実線の白線は、細胞の輪郭の模式図を表しています。破線の白線は細胞核を示し、青線は軸索の輪郭を示しています。この2番目のパネルでは、YFPおよびRFPチャネルのみを重ねて表示しています。軸索路に伴って多数のMRFP punctaが存在していることに注目してください。これらの細胞は最近感染したものであり、いずれの融合タンパク質も発現していません。感染細胞を遡って追跡することで、ウイルス感染を開始させた蛍光カプシドを可視化できます。これらの個々の細胞を大きなフレームから分離し、詳細な情報を大幅に失うことなく追跡することが可能です。この手順を行う際は、生細胞顕微鏡観察が観察対象である生物学的プロセスに影響を与える可能性があることを忘れないことが重要です。しかし、これらのプロトコルを慎重に最適化することで、プロセスを変質させることなく可視化することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

オルガネラの人身売買のダイナミクスを研究するときに、ライブセルイメージングには特に有用です。ここでは、広視野蛍光顕微鏡を用いた培養神経細胞における高密度コア小胞のライブイメージングのためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは柔軟性があり、画像その他のようなミトコンドリアなどのオルガネラ、エンドソーム、およびペルオキシソームに適合させることができます。...

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

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アストロサイトにおけるオルガネラおよび他の貨物の細胞内輸送の可視化と解析

ここでは、初代海馬げっ歯類ニューロンのトランスフェクションと生細胞共焦点イメージングを組み合わせて、軸索輸送に対する病理学的タンパク質誘発性の影響を解析し、これらの影響を媒介する機構経路を特定する方法を示します。...

生細胞イメージングを使用して、初代海馬ニューロンの軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響を測定する

原形質膜からトランスゴルジネットワークへのタンパク質のエンドサイトーシスおよび逆行性輸送は、膜恒常性を維持し、シグナル伝達を調節するために不可欠です。ここでは、HeLa細胞における誘導体化抗GFPナノボディを用いた生細胞顕微鏡による膜貫通カーゴタンパク質のエンドサイトーシス輸送を画像化し、定量する方法を記述します。...

培養細胞における官能化ナノボディを用いたエンドサイトーシス輸送の生細胞イメージング

学ぶアルファヘルペスウイルスの順行性輸送と細胞間スプレッドの生細胞イメージング法。蛍光融合タンパク質を用いて一次ニューロン内のウイルス動態を可視化し、感染メカニズムの理解を深める。

Alphaherpesウイルス順行性輸送とスプレッドの生細胞イメージング

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