全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のためのバークホルデリア種

バークホルデリア属のメンバーは、臨床的に重要な病原体である。我々は、機械的破壊、およびその後のプロテオーム解析のための2-Dゲル電気泳動を用いて、全細菌タンパク質抽出するための方法を記載している。

この手順の全体的な目標は、細菌のプロテオームの 2 次元マップを生成することです。これは、最初に細菌培養物を培養し、タンパク質を収穫することによって達成されます。次に採取されたタンパク質は、そのpHに従って1次元で分離されます。

1次元分離後の等電点電気泳動により、タンパク質は分子量に応じてさらに2次元で分離されます。最後に、2次元ゲルを染色し、タンパク質を可視化します。最終的には、2次元電気泳動によりタンパク質発現の違いを示す結果を得ることができます。

この方法は、特定の条件下でどのタンパク質が産生されるか、分離細菌ごとに異なるタンパク質産生はどのように異なるかなど、細菌の病因分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この情報は、病原性に関与する可能性のある候補タンパク質を特定するのに役立ちます。100ミリリットルのバール冷酪農培養物を固定相に成長させた後、35ミリリットルを遠心分離管に移し、4,500Gおよび摂氏4度で20分間回転させる。

同様に、ペレットを35ミリリットルの冷たいPBSに懸濁し、遠心分離を繰り返します。Resusがペレットを1ミリリットルの冷たいPBSに懸濁した後、溶液を滅菌した2ミリリットルのマイクロチューブに移し、再び回転させます。4°Cおよび14、000 Gs.Forで回る前に冷たいPBSの1ミリリットルで洗浄を繰り返し、1分間、上澄みを捨て、P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-Fの解決の1ミリリットルを加えて、溶解させたペレットを約0.5ミリリットルの予め滅菌されたガラスビーズを含む2ミリリットルのスクリューキャップチューブに移した。

次に、コールドルームで細胞を破壊するために、ミニビーズビーズを1分間ずつ3回使用し、各ラウンド遠心分離機の後にサンプルを氷上に置いてから、上清を滅菌済みの5ミリリットルポリスチレンチューブに移します。歩留まりを増やすには、P-B-S-E-D-T-A-P-M-S-F のアリコートを追加して、ビーズバッシングを 2 回繰り返します。サンプルをプルします。

次に、タンパク質量をアッセイした後、200マイクログラムのアリコートを摂氏マイナス80度で保存し、最初の次元を実行するために使用する準備が整います。等電点電気泳動(IEF)は、ストリップ洗浄液を使用してストリップホルダーを洗浄することから始まります。続いて、ストリップをミリQ水ですすいでください。

次に、乾燥後、それらを逆さまにして乾燥させ、各サンプルにゲルストリップホルダー番号を割り当てます。あらかじめ準備した200 μgのタンパク質サンプルをストリップホルダーの横方向のウェルにロードし、ピペットを使用して、清潔な鉗子を使用してホルダーに沿ってサンプルを分配します。ジェルストリップをパッケージから引き出します。

次に、ゲルストリップから保護層を剥がしてから、ゆっくりとスライドする動作で粗い面を下にして裏打ちし、ストリップをネガティブエンドからポジティブエンドに濡らします。焼損を防ぐため、滅菌水で湿らせたあぶらとり紙を電極の上とゲルストリップの下に置きます。気泡を取り除き、ミネラルオイルの薄い層で覆って乾燥を防ぎます。

IEFマシンにゲルストリップホルダーを並べます。ここに記載されているプログラムを使用してサンプルを実行します。ゲルは、最後のステップでいつでも取り外すことができます。

プログラムが完了したら、ストリップホルダーからストリップを取り外し、すぐに使用しない場合は、ラップで覆い、2次元SDSページを実行する準備ができるまで摂氏マイナス80度で保管します SDSページ用のゲルキャスター装置を組み立てた後、ドラクエル1.5モルトリスバッファーとMCU水を加えて、真空チップと攪拌棒を備えたフラスコでゲル溶液を準備します 溶液を混合して脱気します真空で適度な速度で20分間。真空が終了したら、フラスコの側面にピペッティングしてゲル溶液に10%SDSを加えます。気泡の発生を避けるために、次に、新しく調製したアンモニウムを硫酸塩ごとに加え、攪拌します。

ゲルを注ぎ、固まらせてから、DTTを事前に調製した平衡溶液に溶解します。マイナス80°Cの保管からストリップを取り出し、包みを解いてIPGストリップゲルを下にしてバッファーに置き、30分間インキュベートします。次に、4.5リットルの電気泳動バッファーをランニングタンクに追加します。

次に、ピンセットを使用して、e平衡化溶液からストリップを取り出し、ペーパータオルを使用して余分なバッファーを排出します。ゲルキャスター装置を分解し、ガラスプレートを温水で洗浄します。ゲル上部の水をランニングバッファーに交換した後、清潔なピンセットを使用して、ゲル側を手前に向けて長いプレートの上にストリップを置きます。

1 x バッファーでストリップを潤滑し、プラスチックストリップを使用して IPG ストリップをゲルに対してさらにスライドさせ、ストリップとゲルの間の気泡をすべて取り除きます。ストリップの上部にアガロシーリング溶液を追加して、所定の位置にシールします。次に、すべてのストリップに対してこのプロセスを繰り返した後、ゲルタンクに下げます。

アウターチャンバーのone x bufferレベルが指定レベルにあることを確認した後、アッパーチャンバーを取り付けます。上部バッファーチャンバーのフレームをガラス板の上に置き、押し下げます。2 x ランニング バッファーを上部チャンバーの中央線まで追加します。

次に、one x ランニング バッファーを外側のチャンバーに追加して、一番上の行に到達します。蓋を上にして、電気泳動ユニットとパワーパックの電源を入れます。サンプルを52ボルト、96ミリアンペア、5ワットで一晩実行します。

リードラインが底から1cmになるまでゲルを流します。実行後、プレートをキャスターから取り外します。ゲルをガラスプレートから取り出したら、1液中に1液中4°Cで少なくとも1時間または一晩固定します。

次に、ゲルを固定溶液2に移し、1時間揺とうします。Milli Qの水でゲルを4回、それぞれ15分間洗います。次に、硝酸銀溶液を使用して、ゲルを30分間または最大48時間染色します。

Milli Q水でゲルを1分間洗浄した後、ゲルが染色されるまで現像液に移します。反応を止めるために約5〜30分、ゲルを10分間停止溶液に移します。ここに示されているのは、ol dia multivoransからの全細胞タンパク質抽出物のKumasi Blues染色ゲルです。

LBまたは酵母マンニトールブロスで増殖し、固定相で収穫された臨床分離株。同じ細菌培養物から抽出されたタンパク質プロファイルを2つの異なる機会に比較分析したところ、タンパク質抽出が成功したことを示す同様のバンディングパターンが示されました。この図では、Bural dio 由来の全タンパク質 200 μg の 2D ゲル電気泳動分析では、質量分析によって個別に同定できる 500 を超えるスポットがシュード

この手順に続いて、密接に関連する細菌分離株間の定量的および定量的な違いを決定するために、サイトメトリーなどの他の方法を実行できます。さらに、染色法に変更を加えることで、研究者はスポット切除と質量分析によってタンパク質スポットの同一性を判断できます。