全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための

この手順の最終的な目的は、細菌プロテオームの2次元マップを作成することです。まず、細菌を培養してタンパク質を回収します。次に、回収したタンパク質をpHに基づいて1次元で分離します。

一次元分離後の等電点電気泳動により、タンパク質は第二次元において分子量に基づいてさらに分離されます。最後に、第二次元ゲルを染色し、タンパク質を可視化します。最終的に、二次元電気泳動を通じてタンパク質発現の違いを示す結果を得ることができます。

この手法は、どのような条件下でどのタンパク質が産生されるか、また細菌の分離株間でタンパク質産生にどのような違いがあるかといった、細菌の病原性研究における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これらの情報は、病原性に関与している可能性のある候補タンパク質の同定に寄与します。100 mLのbur cold dairy培養物を定常期まで増殖させた後、35 mLを遠心チューブに移し、4,500 G、4 °Cで20分間遠心分離します。

ペレットを35 mLの冷PBSに懸濁し、遠心分離を繰り返します。ペレットを1 mLの冷PBSに懸濁した後、溶液を滅菌済みの2 mLマイクロチューブに移し、再度遠心分離を行います。1 mLの冷PBSで洗浄を繰り返し、4 °C、14,000 Gで1分間遠心分離した後、上清を捨て、1 mLのPBSEDTAPMSF溶液を加えます。溶解したペレットを、約0.5 mLの滅菌済みガラスビーズを含む2 mLスクリューキャップチューブに移します。

次に、細胞を破砕するため、コールドルーム内でミニビードビーターを1分間×3回使用し、各サイクルの後にサンプルを氷上に置きます。その後、1分間遠心分離し、上清を滅菌済みの5 mLポリスチレンチューブに移します。収量を増やすため、PBS-EDTA-PMSFを追加し、ビード破砕をさらに2回繰り返します。サンプルを回収します。

次にタンパク質量を測定した後、200 µgずつ分注し、1次元電気泳動に使用するまで-80 °Cで保存します。等電点電気泳動（IEF）は、まずストリップクリーニング溶液を用いてストリップホルダーを洗浄することから始めます。続いて、ストリップをmilli Q水で洗浄します。

その後、逆さまにして乾燥させ、乾燥後に各サンプルにゲルストリップホルダー番号を割り当てます。あらかじめ調製した200 µgのタンパク質サンプルをストリップホルダーの側方ウェルにロードし、清潔なピンセットを用いてピペットでサンプルをホルダーに沿って分配します。パッケージからゲルストリップを取り出します。

次に、ゲルストリップから保護層を取り除き、粗い面を下にして、陰極側から陽極側へゆっくりと滑らせるように配置してストリップを濡らします。焼き切れを防ぐため、滅菌水で湿らせたブロッティングペーパーを電極の上およびゲルストリップの下に配置してください。気泡を取り除き、乾燥を防ぐために鉱物油の薄い層を重ねます。

IEF装置のゲルストリップホルダーを整列させます。ここに記載されているプログラムを使用してサンプルを泳動させます。最終ステップの間は、いつでもゲルを取り出すことができます。

プログラムが完了したら、ストリップホルダーからストリップを取り出します。すぐに使用しない場合は、プラスチックラップで包み、2次元SDS-PAGEを行うまで-80°Cで保存してください。SDS-PAGE用のゲルキャスター装置を組み立てた後、真空チップと撹拌子を入れたフラスコに、1.5 M Tris緩衝液と超純水の混合液を加え、真空状態で中速で20分間脱気してゲル溶液を調製します。脱気が完了したら、10% SDSをフラスコの壁面に沿ってピペットで加えてください。気泡の混入を防ぐため、次に調製直後の過硫酸アンモニウムとTEMEDを加え、撹拌します。

ゲルを流し込み、凝固させた後、あらかじめ調製しておいた平衡化溶液にDTTを溶解させます。-80 °Cで保存していたストリップを取り出し、包装を解いてIPGストリップのゲル面を下にしてバッファーに入れ、30分間インキュベートします。次に、電気泳動槽に4.5 litersの電気泳動バッファーを加えます。

次に、ピンセットを使用してストリップを平衡化溶液から取り出し、ペーパータオルで余分なバッファーを拭き取ります。ゲルキャスター装置を分解し、ガラスプレートを温水で洗浄します。ゲルの上の水をランニングバッファーに交換した後、清潔なピンセットを使用して、ゲルの面を自分側に向けて、長いプレートの上にストリップを配置します。

1xバッファーでストリップを潤滑し、プラスチックストリップを使用してIPGストリップをゲルのさらに下方へ滑らせ、ストリップとゲルの間の気泡をすべて取り除きます。ストリップの上端にAgarroシーリング溶液を加え、固定します。すべてのストリップに対してこの操作を繰り返した後、ゲルタンクに浸漬させます。

外槽の1xバッファーが指定のレベルにあることを確認し、上槽を取り付けます。上部バッファー槽用のフレームをガラスプレートの上に置き、押し下げます。2xランニングバッファーを、上槽の中央線まで加えます。

次に、外槽に1xランニングバッファーを上限線まで加えます。蓋を閉め、電気泳動装置と電源装置のスイッチを入れます。52 V、96 mA、5 Wの条件で、サンプルを一晩泳動させます。

リーディングラインが底から1 cmのところまで到達するまで、ゲルを泳動させます。泳動後、キャスターからプレートを取り出します。ガラスプレートからゲルを剥がした後、溶液1で1時間以上、または4 °Cで一晩固定します。

次に、ゲルを固定液2に移し、1時間揺盪させます。Milli Q水で15分間の洗浄を4回行います。その後、硝酸銀溶液を用いて、30分から最大48時間までゲルを染色します。

ゲルをMilli Q水で1分間洗浄した後、ゲルが染色されるまで現像液に浸します。5分から30分後、反応を停止させるためにゲルを停止液に移し、10分間置きます。ここでは、ol dia multivoransからの全細胞タンパク質抽出物のクマシーブルー染色ゲルを示しています。

LB培地または酵母マンニトールブロスで培養し、定常期に回収した臨床分離株。同一の細菌培養物から2回に分けて抽出したタンパク質プロファイルの比較分析では、同様のバンディングパターンが示されており、タンパク質抽出が成功したことが確認された。この図では、Bural dio, pseudoから得られた200 microgramsの全タンパク質の2Dゲル電気泳動分析の結果を示しており、質量分析によって個別に同定可能な500以上のスポットが豊富に存在することがわかる。

本手順の後、フローサイトメトリーなどの他の手法を用いることで、近縁の細菌分離株間の定性的および定量的な違いを決定できます。さらに、染色方法を変更することで、スポットの切り出しと質量分析により、プロテンスポットの同定を行うことが可能です。