遺伝的に探索するために種皮寝具アッセイ

本手順の全体的な目的は、種皮ベッディングアッセイを構築し、遺伝子レベルおよびin vitroレベルの両面から、さまざまな環境条件下におけるrabbit opsisの胚乳による種子発芽の制御メカニズムを探索することです。まず、注射針と切断鉗子を用いて、Arab Opsisの種子から種皮と胚を慎重に分離します。次に、分離した種皮を、発芽培地の上に緩やかに転移させます。

次に、種皮を単層の円形に組み立てます。最後のステップで、組み立てた種皮のベッドの中央に胚を配置します。これも同様に、単層の円形に配置します。

胚乳は、我々が解析している種子の発芽制御において不可欠な役割を果たしています。種皮湾曲アッセイは、種子発芽の制御のために胚乳で機能するシグナル伝達経路の分子遺伝学的コンポーネントを特定するためのin vitro遺伝学的手法です。一般的に、胚を迅速に、かつ損傷させることなく摘出することが困難であるため、この手法に不慣れな方は苦労されます。

使用する材料の齢も重要であり、老化に伴い細胞分化を制御する能力が失われるためである。まず、成熟した乾燥したArabidopsisの種子を50～60 µL、1.5 mLマイクロ遠心チューブに分注する。次に、チューブに70% ethanolを1 mL加え、ボルテックスミキサーを用いて室温で1200 RPMに設定して種子を振とうする。10分後、4,000 Gsで3秒間遠心分離を行い、種子をチューブの底に集める。

次に、バキュームサクションチップを用いてエタノールを慎重に吸引し、チューブの底に種子が残るようにします。ここに滅菌蒸留水 1 mL を種子に加え、さらに 10 分間振とうします。再び種子を遠心分離して沈殿させた後、上澄み液を吸引し、さらに 1 mL の滅菌蒸留水をチューブに加えます。この際、水の流れによって種子がチューブ全体に均一に懸濁するようにしてください。

次に、チューブをラックに立て、種子がチューブの底に沈殿するまで待ちます。約30秒後、種子をプレートに播種するために、慎重に水を吸引します。まず、新しく調製した50 °Cの発芽培地30 mLを100 mmのペトリ皿に注ぎます。種子を200 µLの滅菌蒸留水に再懸濁し、1 mLマイクロピペットチップを使用して、発芽培地の表面に転移させます。

種子の周囲の水を吸引し、その後、ペトリ皿と種子を覆わない状態でラミナーフローキャビネット内に放置してさらに乾燥させます。2時間後、ペトリ皿に蓋を閉め、さらに90分間フード内に種子を保持します。次に、ステレオ顕微鏡をフード内に設置します。

別の100 millimeterペトリ皿に30 millilitersの発芽培地を注ぎ、培地表面にオートクレーブ滅菌済みの3 millimeter厚のWatman矩形濾紙2枚を並べて配置します。この手順で最も困難なステップは種子の解剖です。種子が非常に薄いため、滅菌済みのDumont 5番鈍端ピンセットで種子を保持して切断する際、胚を損傷させないよう細心の注意を払う必要があります。

種子を紙の上に移動させ、ピンセットを閉じた状態で保持します。個々の種子を紙にそっと押し付けます。次に、29ゲージのインスリン注射針の先端を使用し、子葉の導入部が根端に接している箇所にできるだけ近い位置で、種皮の最長半主軸に沿って切り込みを入れます。

次に、ピンセットを使用して種子を紙に押し付けます。再び、胚根の先端に最も近い子葉の先端に圧力を加え、種皮から胚を切り離し、種皮ベッドアッセイを組み立てます。まず、3.5 by 5 cmの滅菌ナイロンメッシュを、新しく注いだ別の100 mm発芽培地プレートに入れます。

次に、シリンジを用いて胚と種皮をピンセットの金属端にそっと押し当て、植物組織をナイロンメッシュ上に移動させます。ピンセットとシリンジを使い、種皮の開口部を上に向け、種皮同士ができるだけ密接するように配置して、単層の円状に組み立てます。その後、胚を種皮層の中央に、同様に胚同士ができるだけ密接するように単層の円状に配置します。

最後に、以前の結果に基づき、20から21 degrees Celsiusの連続光条件下で種子播種アッセイをインキュベートします。gier illinを合成できないrabbit opsys変異体種子またはGA欠損変異体は、種子浸漬から80時間後でも発芽しません。対照的に、また以前の結果とさらに一致して、培地中にOB CIC acidまたはBAが存在しない限り、種皮の除去によりGA欠損変異体の胚の成長が誘発されます。このことは、GA欠損変異体の胚乳が胚に向けてBAを放出し、その発芽を阻止していることを示唆しています。

この画像は、種子抑制から80時間後、80枚のGA欠損変異体種皮のベッド上でGA欠損変異体胚を用いた種皮ベッドアッセイを行った様子を示しています。我々の仮説通り、GA欠損変異体の種皮はGA欠損変異体胚の成長を抑制しています。ここでは、種子抑制から80時間後、BAを合成する能力も欠くGA欠損変異体種皮のベッド上でGA欠損変異体胚を培養した種皮ベッドアッセイを示しています。予想通り、この変異種皮はGA欠損変異体胚の成長を抑制することができていません。

同様に、RGL2因子を欠損したGA欠損変異体の種皮上のベッドで培養したGA欠損変異体胚においても、この手順に従った後、GA欠損変異体胚の成長を阻止することはできませんでした。種皮浸漬法を用いて遺伝的相互作用を調査するために、種皮および種子から切り出した胚の遺伝子発現解析などの他の手法も実施可能です。したがって、本手法を習得すれば、種子発芽分野の研究者が、種皮が環境の手がかりに反応してどのように胚の成長を制御しているかを探索できるようになるはずです。