ジェネラリストの腸内で代謝的に活性な細菌の同定ハスモンヨトウリットラリス DNAを安定同位体を経由して使用するプロービング ¹³ C-グルコース

次の実験の全体的な目標は、昆虫の腸内の代謝活性細菌を系統的に特徴付けるために採用された効率的な方法論を詳述することです。これは、最初にC 13標識グルコースを昆虫に供給して、腸内の代謝活性細菌のDNAを同位体的に濃縮することによって達成されます。次のステップは、腸内に存在する細菌群集のDNAを抽出することです。

第3のステップは、C 13を組み込んだ代謝活性種のDNAを分離することです。次に、DNAを系統発生的に同定し、パイロシーケンシングによって存在する種について定量化します。したがって、昆虫の腸内に存在するコミュニティを構成する代謝活性細菌種を特定します。

したがって、多細胞生物の腸は、微生物の代謝能力を利用して複雑な有機物を溶解または可溶化し、最終的に昆虫宿主の栄養素として役立つようにするための独創的な発明です。システムを理解するには、まず誰がそこにいるのか、次に誰がどの代謝活動を行っているのかを分析する必要があります。これらのデータがあれば、分解微生物と昆虫宿主との間の代謝物と分解生成物の流れを再構築することができます。

この方法は、微生物生態学の分野における重要な疑問、特にこれらの微生物が宿主とどのように相互作用しているかについて答えるのに役立ちます。その意味で、これらの生物が宿主に対して果たしている機能が何であるかをより深く理解し、明確にし、定義することができます。しかし、この方法では、一般的な活性腸内細菌についての洞察を得ることができます。

ウクレグルコースを追跡することにより、オクラント栄養素の消化プロセスに関与する活性細菌を特定するためにセロースを標識するなど、他の炭素源に対しても実行できます。オプリットル、卵、シャーレを維持し、孵化するまで室温で追加します。次に、新しく孵化した幼虫を清潔なプラスチックの箱に移し、摂氏23〜25度の人工飼料で飼育し、16時間の照明と8時間の暗闇で数日後に、9〜15匹の健康なセカンドインスター幼虫を飼育箱から新鮮なC 13グルコースを含む個々のペトリ皿に移します。

スパイク人工飼料は、治療ごとにそれぞれ3匹の幼虫の少なくとも3回の複製が必要です。対照群に栄養を与えるために、綿などの天然の食物源と同量の天然ブドウ糖を提供する人工飼料を使用してください。次の24時間で。

人工食を頻繁に更新します。まず、柔らかい鉗子で幼虫を蒸留水のプールに移し、大きな破片を取り除きます。次に、新しいきれいな皿に移して麻酔をかけ、昆虫を殺します。

それらを氷の上に置き、クーラーボックスで温度を摂氏マイナス5度に下げます。次に、死んだ昆虫を70%エタノールで消毒し、PBSに浸して解剖します。また、ツールは70%エタノールで洗浄する必要があります。

キューティクルの右側と左側を切開することから始めます。頭から始めて肛門で終わります。外骨格全体、マリ尿細管、脂肪体を切除します。

次に、腸を開く前にバッファーを他の組織から分離された腸と交換します。腸全体または腸の中腸または後腸の切片を処理します。科学的な問題によります。

PBSを含まない腸組織を小さな滅菌チューブに移し、冷凍庫で保管します。DNA抽出の前に、組織のサイズに応じて、真空濃縮装置でサンプルを摂氏45度で30〜90分間乾燥させます。次に、乾燥させた組織を滅菌プラスチックのペレで粉砕し、土壌DNA抽出用キットを用いてゲノムDNAを抽出します。

次に、分光光度計を使用して、最終的に逃れたDNAの濃度を決定します。細菌の一般的なプライマー27 Fおよび1、492 R.For診断を使用して診断用PCRアッセイを準備することにより、昆虫の腸からの微生物メタゲノムDNAの成功した抽出を確認します。各PCR産物の5マイクロリットルを1%agrosゲルに300ボルトおよび115ミリアンペアで約20分間泳がせます。

アンプリコンの正しいサイズは1.5キロベースです。各実験複製に対応する抽出されたDNAを一緒に引っ張ります。C 13グルコースの有無にかかわらず、それらを分離します。

DNA濃度を正規化して、各サンプルがそのプールに等しく寄与するようにします。500 〜 5, 000 ナノグラムの DNA の最終濃度が超遠心分離プロセスに適しています。無菌の15ミリリットルスクリューキャップチューブ内の分光光度計で予想される濃度を再確認してください。

グラデーションメディウムを設定します。定量したDNAを4.8ミリリットルの塩化セシウム溶液と組み合わせます。次に、6ミリリットルのグラジエントバッファーでボリュームを補充します。

混合物を5.1ミリリットルの超遠心チューブに慎重に移します。注射器と針を使用して、チューブを首の付け根まで満たし、気泡が汲み上げたり形成されたりしないようにします。各分析に DNA を含まないブランクグラジエントを少なくとも 1 つ含めます。

参照グラジエントとして機能するには、チューブのペアを選択し、10ミリグラム以内でバランスを取ります。各チューブにチューブトッパーを取り付け、チューブを反転させ、手で適度な圧力を加えることにより、チューブが漏れないようにします。8つのウェルを備えたほぼ垂直のローターを使用します。

ローターウェルを慎重に密封し、製造元の指示に従ってローターを超遠心分離機にロードします。DNAを50, 000 RPMで摂氏20度、真空下40時間スピンダウンします。最大加速とブレーキなしの減速を選択します。

2日後、鉗子を使用して遠心分離機ローターからチューブを慎重に取り外します。形成された勾配を乱さずにラックに置き、すぐにチューブを処理します。まず、毎分850マイクロリットルの流速を使用してHPLCを平衡化します。

次に、超遠心チューブをクランプスタンドに取り付け、注射器に取り付けられた23ゲージの1インチ針でチューブの底を突き刺します。したがって、コントロールマイナーでチューブの上部を慎重に貫通して、フォーム、勾配、および事前に練習を乱さないようにして、PSAの動きを成功させます。次に、ポンプチューブに取り付けられた針をチューブの上部に液体がない場所に挿入し、底から直接無菌の1.5ミリリットルに液滴を収集しますマイクロフージチューブは、30秒ごとにフラクションを1フラクションあたり425マイクロリットル収集します。

この例では、各グラデーションから 12 個の分数が収集されます。次に、分析天びんで分離された各フラクションの密度を測定します。DNA回収とパイロシーケンシングを、テキストプロトコルを24時間参照して進めます。

10ミリモルC 13グルコースをssopリットルの食事に添加しました。幼虫。同量の正常グルコースを対照昆虫の食物に加えた。次に、昆虫の腸の細菌群集からDNAを抽出しました。

電気泳動ゲル上では、上部に強力なゲノムDNAのバンドがあり、DNA抽出の成功、診断用PCRが確認されました。細菌のユニバーサルプライマーを使用して、細菌DNAの存在が示され、定量的なパイロシーケンシングを代表的なSIP勾配で直接実行して、種の系統とその相対的な存在量を明らかにしました。合計120, 045の高品質リードが生成され、平均長さは404のOTでした。

パイロシーケンシングプロファイルは、対照群と比較して、標識サンプル中の腸球菌やパント菌などの特定の種の存在量が増加していることを示しました。したがって、これらの細菌は代謝活性があると考えられており、さらなる研究に値します。したがって、この手順を試行する際には、CYP分析に適切な制御を含めることを忘れないでください。

したがって、背景の影響を差し引くと、髪の毛のフラッシュの汚染が、出現または消える細菌の多様性と豊富さが質量自体のアーティファクトではないことを確認します。この手順に従うか、蛍光in situハイブリダイゼーションなどの方法論を使用して実行し、追加の質問に答えることができます。その場合、昆虫の腸内の細菌の局在と配置の世話をすることになります。