Name: げっ歯類におけるオロ顔面ノシチブ応答の尺度としての食事期間 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: 学ぶ、げっ歯類におけるオロ顔面痛の定量的評価法として食事時間を測定する手法。拘束や訓練を必要とせず、顎関節炎や歯髄露出による疼痛を検出できる。自動化された給餌モジュールを用いて連続的に行動をモニタリングし、疼痛研究に有用なツールとなる。

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このモデルでは、ラットまたはマウスに食物および水のアドリビタムを与えた。テキサスA&M大学ベイラー歯科施設動物ケア使用委員会は、すべての実験プロトコルを承認しました。以下の特定の設定は斜体で示され、ラットTMJ関節炎モデルのために特別に利用される。マウスもまたこのモデルで利用することができ、代替歯の痛みや筋顔面疼痛動物モデルも42,43.
1. ソフトウェア設定
<ol><li>フィーダーユニットの動物モニタソフトウェアをコンピュータにロードします。</li>
	<li>動物モニターソフトウェアは、アイコンをクリックして開かれ、ファイルメニューの選択の下に「構成」プルダウンオプションを選択します。</li>
	<li>「動物モニタ構成」ウィンドウで、「ペレット配信入力」と題するチェックボックスをオフにします(図1A)。 注: このボックスは、通常、デフォルトで工場でチェックされます。このオプションの選択を解除します。研究者がこのオプションを選択解除すると、ペレットが分配されるときではなく、トラフからペレットを除去することによって結果が記録されます。 注: [ファイルの自動命名] ボックスにチェックを入れると、ソフトウェアは自動的にファイルに名前を付けます (図 1A)。このボックスは、通常、デフォルトで工場でチェックされます。</li>
	<li>タイマーライトを06:00(午前6時)に点灯し、20:00(午後8時)に消灯するように設定します。 注: フィーダーユニットのハードウェアは、ボックス内のライトがソフトウェアによって制御されず、隔離された24時間のタイマーに配線されるように変更されました。したがって、構成ソフトウェアに示された「ハウスライト」は、これらの例では機能しなかった。</li>
	<li>編集プルダウンメニューを選択し、実験を選択します。「Box 01 -」というタイトルのウィンドウが表示されます (図 1B)。</li>
	<li>このウィンドウ内でデータを保存するファイル名を入力します。 注: ファイル名を入力しないと、データファイルは自動的にソフトウェアによって命名されます。実験の詳細はこのウィンドウに追加され、データファイルと一緒に保存することができます。ウィンドウ上の情報は保存し、後続の実験に使用することもできます。</li>
	<li>「実験の長さ (日):」と題する入力ボックスに、実験の合計時間より大きい数値を入力します。 注: これは、実験が完了するまでソフトウェアがデータを保存することを保証します,間違いはこの値を短く設定しすぎ、動物がまだ給餌モジュールに残っていてもデータを記録するのを止めます。</li>
	<li>「1 日の時間数」と題する入力ボックスに「24」と入力します。 注: 長さは実験者の仕様に変更できます。</li>
	<li>「食事期間終了基準 (分):」と題するボックスに「10」と入力します。 注:ラットの食事は、以前の研究48 に基づいて食事の終末10分を使用して定義された(すなわち、食事はペレットを服用しない10分の期間で前後に括弧で囲まれた)、最小食事サイズは、このソフトウェアパッケージの食事ごとに3ペレットに設定した。</li>
	<li>「ペレットサイズ (mg)」と題するボックスに「45」と入力します。個人がこのウィンドウ内でマウス入力20を使用したい場合。</li>
	<li>ラットの場合は、フィーダーディスペンサーホッパーに45mgのげっ歯類のチョウペレットを追加します。 注:マウスの場合は、チャウホッパーに20mgのげっ歯類のチョウペレットを追加します。</li>
	<li>実験ウィンドウの「フェーズ」セクションで、「名前」フィールドに「曜日」と入力し、「時間の数」フィールドに「24」と入力します(図1B)。 注意: 「フェーズ」のセクションの下には、2 つの大きなオープンフィールドがあります。 最初の大きなオープンフィールドは、前の「フェーズ」フィールドと「名前」フィールドに入力されたテキストによって設定されます。</li>
	<li>次の大きなオープンフィールドには、「Day Phase」という見出しが「名前」というフィールドに「ライト」という名前が付けられており、そのフィールドに「パーセント」という数字60を入力します。 注: この入力されたテキストは、下の大きなフィールドに入力されます。</li>
	<li>次に、"名前" という名前のフィールドに「Dark」と入力し、数値 40 の「パーセント」と題するフィールドに入力します。注: これらのエントリでは、1 日の 60% は明るい位相に起因し、40% は暗位相に起因します。ソフトウェアが食事パターンを計算する際に、この情報が使用されます。14:10明暗サイクルで飼われているサイクリングの雌の動物のためのこれらの設定。</li>
	<li>[すべてのボックスをこのように設定]ボタンを選択します。この情報を保存し、[OK] をクリックします。</li>
	<li>「スタートボックス」画面が表示され、アクティブにするフィーダーを選択してOKを押します(図1C)。</li>
	<li>次に、動物モニタのランタイムウィンドウが食事パターンデータとともに表示されます(図1D)。 注: このウィンドウから「ペレットの塗布の#」を監視して記録し、ラットの現在の状態を確認します。約300グラムの健康な雄のラットは、通常、1日300〜800 45mgペレットの間で食べます。</li>
	<li>ファイルは毎日生成され、自動的に保存されます。CSV 拡張子。これらのファイルを開くと、食物摂取、食事数、食事時間、食事サイズ、食事間隔などの食事パターンデータを取得できます。これらの食事パターンの間隔は、一日または暗いおよび明るい段階などの一日の段階のために計算することができます。前述のように、設定は 14:10 の明暗サイクル用です。各ペレットがトラフから取り除かれた時の生データも生として記録される。CSV ファイル。 注: ソフトウェアの古いバージョンでは、最小の食事サイズは 3 ペレットは、 を生成するための計算では使用されません。CSV ファイル。 さらに、古いソフトウェアを使用して平均食事時間を取得するには、 の平均食事時間列の値から 10 分を減算する必要があります。CSV ファイル。 ソフトウェアが動作しているとき、オペレータは手動でファイルプルダウンメニューオプションを選択し、毎日「生データを保存」を選択することができます。これにより、実験全体ではなく、24 時間の期間の生データが保存されます。この生データは、ユーザーの裁量で代替ソフトウェアによって処理することができます。 注:結果では、我々は3ペレットの最小食事サイズを含むように代替ソフトウェアを使用しました。</li>
</ol>2. 食事時間アッセイ
<ol><li>光ビームコンピュータ作動ペレットフィーダーを備えた音減衰チャンバーに個々のラットを配置します。 注:これらの供給ユニットには、厚い吸収性紙のシートが配置されている段階的な水のボトルや廃棄物の鍋があります。フィーダーディスペンサーホッパー45mgのげっ歯類のチョウペレットは、ラットまたは20mgのげっ歯類のチョウペレットをマウスに加えることができる。チャウペレットはV字型給餌トラフに分配され、このトラフの底にはフォトビームがあります。トラフに分配されたペレットは、この光ビームを壊すことによって検出されます。ラットがフィーダートラフからこのペレットを取り除くと、光ビームが復元され、これはコンピュータに別のペレットを落とすように合図します。光ビームの復元はまた、日付と時刻を記録するためにコンピュータをトリガし、分配されたペレットの実行集計を維持します。このペレットの集計は、Med Assoc. Inc.ソフトウェアを使用して、一日の任意の部分の間に食物摂取量、食事数、食事時間、食事のサイズ、または食事間間隔を決定するために分析されます。再び生.CSVデータファイルは、外部ソフトウェア39,40,49-51で分析することができます。</li>
	<li>ペレットの総食数、消費水量、および実験中のラットの一般的な健康状態を識別する動物の重量を記録します。</li>
	<li>水のボトルをすすいで、毎日新鮮な水で満たし、必要に応じてフィーダーホッパーにチャウを追加します。</li>
	<li>毎日ゴミ鍋とケージの下の厚い吸収紙をダンプし、高圧空気を使用して毎日フィーダーの一部を移動からほこりを吹きます。 注意:個人的な保護具(例えば、ガウン、手袋、マスク、マスク)が必要です。</li>
	<li>実験が完了した後、床、廃鍋、水筒を取り除き、これらの部品を洗浄します。また、手洗いまたは食器洗い機でケージ洗浄から供給エレクトロニクスを取り外します。</li>
</ol>3. TMJ関節炎の誘導
<ol><li>実験の少なくとも4日前に動物をフィーダーに入れる。 注: このデータは、ベースラインフィード動作を取得するために前の日として報告されます。次いで、動物は治療のためにフィーダーから取り除かれます。一つの治療法は、関節炎TMJを誘導することであった。このモデルでは、ラットがイソフルラン(5%流量)で麻酔された後、08:00(すなわち光相の開始)に完全なフロイントアジュバント(CFA)を注射する。</li>
	<li>各TMJの垂直空間に250mgのCFAを両側に注入する。 注: 例(図2)では、50LのCFAの250mgを各TMJに注入したが、15μlの小さな体積で10mgの低用量は、より短い期間の時間52にわたって有効である。</li>
	<li>コントロールラットTMJを0.9%生理液の50 Lで注入する。注:すべての動物は麻酔の誘導後5分以内に移動した。より少ない量のCFAがより少ない量で与えられる場合、対照ラットはこの同じ量の生理的な生理を受け取るだろう。</li>
</ol>

開示するものは何もありません。

TMJ患者は、咀嚼時間の増加による疼痛の増加を報告し、その様に、咀嚼サイクルは、個人が45,53-56を噛んでいる時間が長くなるほど長くなる。我々の行動アッセイは、食事の持続時間39を測定する際に、ラットとマウスで同様の検査を可能にする。最近の未発表の研究では、フォン・フレイ・フィラメント検査は食事期間測定よりも感度が高く、より長い期間の有意な変化を示すが、フォン・フレイ・フィラメント検査は反射応答成分を有することができるのに対し、食事期間測定は中枢神経系の領域による処理を必要とする。したがって、フォン・フレイのフィラメント試験では感度が高くなるかもしれませんが、応答の一部は反射を反映する可能性があります。しかし、中心効果を有する薬物による治療は、アッセイを示唆するフィラメント試験結果を改変し、中央疼痛処理57のいくつかの側面を反映する。
食事期間アッセイでは、分配されたペレットの総数を毎日監視する必要があります。オスラットは通常、45mgペレットの400-800を摂取し、雌ラットは300〜600ペレットを摂取する。...

動物モデルは、顔面損傷や炎症に関連する痛みやノシセプションを研究するために使用されてきましたが、適切な動物モデルの欠如は、メカニズムの不完全な理解をもたらします。現在のモデルは、急性および慢性のオロ顔面痛に関与する様々なメカニズムを理解するのに役立ちますが、これらの動物モデルには長所と短所があります。
多くのモデルは、短時間の行動性の忍化応答を測定します。顔のグルーミングは顔面神経の収縮に続く既知の行動応答である3.他の研究は、イプシラショナル前頭またはヒスポとの顔面擦れ、ならびに、顎関節(TMJ)または唇4-7にホルマリン注射を投与した後に頭部をひるむを測定した。頭部離脱遅延は、ラット8の剃毛ビブリッサエパッドに熱を加えた後に、修飾されたテールフリック鎮痛計を使用して、可分化応答(すなわち頭部離脱)を定量化するノシシブ挙動を測定するための別のモデルである。Digastricおよびマッサージ筋活性は、TMJ9にグルタミン酸注射後の痛みの相関としても記録されている。別の研究は、炎症を起こしたTMJを有する雄および女性ラットにおける夜行化応答を評価するための睡眠パラメータの変化を測定し、これらのパラメータには睡眠遅延、急速眼球運動(REM)、非レム睡眠の割合、およびレム睡眠10の割合が含まれていた。行動性の特性応答を測定するほとんどの動物モデルは、短い時間枠、すなわち1日11-14日の分から時間を利用する。さらに、ほとんどの動物モデル試験は、ラットのような夜行性動物の光相および夜行性動物において起こり、これは、夜起性の結果15〜18を混乱させ得るストレスを引き起こす可能性がある。上記アッセイは、様々なオロ顔面状態での起分の応答を測定するが、短い期間のため、したがって急性障害を研究するためにのみ使用することができる。代替アッセイは、中程度の持続期間の分性の尺度として表情を用いてきたが、この方法論は主観的な19である。
持続的または慢性のオロ顔面の結知を評価するために、一部の人は、皮膚の表面にフォン・フレイフィラメントの適用を使用して、神経収縮またはTMJ炎症を受けた動物の機械的感受性を評価する3,20。Liverman ら 2009ラット 21,22のマッセター筋へのCFA注射に続く等級モノフィラメントを用いた離脱応答を測定した。2008年、山崎 らは、TMJをCFAに注入し、その後14日間にわたってTMJ地域に適用される機械的または熱的または冷たい刺激に対する加性挙動を定量化した。残念ながら、これらのノシセ化行動アッセイは、動物の拘束を伴い、ストレスホルモン、学習、または測定結果を妨げる可能性のある代替行動を生み出す。
歯の中での分知を測定するモデルは顎の開口反射を利用するが、この方法は信頼できない23 または不正確な24である可能性がある。歯の分電を測定するために筋電図活性が用いられてきたが、この方法では通常、動物が無意識である必要があるが、一つの研究では歯の交知は自由に動くラット26で調べられた。2008年、カーンは敏感なひずみゲージ27 を用いて歯科線切りと咀嚼機能の関係を研究したが、この咬傷持続時間モデルは正常な活動 28から動物を拘束する必要がある。咬傷力は人間の歯の痛みの信頼できる尺度ですが、ラットは咬傷力を測定するための訓練および/または拘束を必要とするため、ストレスの原因が導入され、疑わしい生理学的意義を持つ所見を生み出すことができます29-31
拘束とストレスのいくつかの制限は、衝動的な行動を評価するためにオペラントデザインを使用することによって克服することができます。1つのオペランモデルは、不快な温度の回避を使用して、顔面のノシセプション32-35を評価し、特徴付けます。この報酬競合モデルは、加熱または冷却された熱プローブ34,36に対して自発的にその顔を配置するためにげっ歯類を誘導するために甘味ミルクの報酬に基づいています。しかし、テストは動物の訓練を必要としますが、アッセイの強みは、データが自動化された方法で収集される方法です。
さらに別の動物モデルは、顔面ノシセプション37の指標として、ノシセプション誘発性かじり機能不全を使用した。しかし、げっ歯類はチューブに閉じ込められており、その唯一の脱出はダボをかじって出て行くだけです。このモデルの利点は、マウスの急性または慢性顎損傷後の顎機能を測定することです。しかし、げっ歯類は閉じ込められ、混乱する代替競合行動、 すなわちエスケープが追加され、ストレスが多く、したがって発知アッセイの結果に影響を与える可能性があります。
食事期間は、TMJ関節炎38-41、歯髄暴露42、及び筋肉損傷43を有する動物におけるノシセプションを測定するために使用されてきた。動物が食事を始めた後、顔面のノシセプションを経験したげっ歯類はよりゆっくりと食べました。TMJの痛みを経験している患者はまた、彼らの食べ物を噛むために長い時間がかかり、TMJの痛みが減少するとサイクル長が短くなります44-46.TMJ疼痛が存在する場合の食事期間の延長は「ガード行動」であると予想され、動作上、補助的行動47と定義される。
食事期間は、雄マウスおよび雌ラットにおいて最大19日間の非侵襲的方法を用いたTMJノシセプションを測定し、雄マウスにおいて6日間(最長期間試験)し、ノシセプション38〜41の生物学的マーカーとして記述することができる。食事の持続時間が起き上がった応答を測定することを支持して、薬物学的介入によって薬物の受け入れが減少し、動物の食事期間が正常38,40,41に戻る。これはまた、カプサイシンを使用してノシシ化ニューロンが破壊されたときに確認されました。神経破壊後、動物の食事期間は、TMJ 40へのCFAの注入後に増加しなかった。
以下は、食事の継続時間データを取得し、統計的に分析する方法に関するプロトコルです。

<table><tbody><tr><td>動物モニターソフトウェア</td><td>Med Assoc. Inc</td><td>SOF-710</td><td>East Fairfield, VT</td></tr><tr><td>Dustless Precision Pellets, Rodent, Grain-Based&nbsp;</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>45 mg ペレット、50,000/箱</td></tr><tr><td>無塵精密ペレット、げっ歯類、穀物ベース&nbsp;</td><td>Bio-Serv</td><td>FO163</td><td>20 mg ペレット</td></tr><tr><td>コンプリート フロイントのアジュバント</td><td>コンドレックス株式会社</td><td>7001</td><td>5 mg/mlの濃度を提供するロガーはありません。&nbsp;治験責任医師がこのソースを一貫して使用している限り、他のソースからのCFAを使用できます</td></tr></tbody></table>

げっ歯類におけるオロ顔面ノシチブ応答の尺度としての食事期間

Meal Duration as a Measure of Orofacial Nociceptive Responses in Rodents

食事時間の延長は、顔面痛みを伴うヒトの保護行動と類似性を有する顔面機械的過痛の増加を測定するために使用することができる。食事の持続時間を測定するために、無制限のラットは継続的に減衰し、コンピュータ化された給餌モジュールを数日間から数週間、摂食行動を記録する。これらの音減衰室はチャウペレットディスペンサーが装備されている。ディスペンサーは、トラフの底に配置された光ビームを備えたペレットトラフを有し、げっ歯類がフィーダートラフからペレットを除去すると、このビームはもはやブロックされず、コンピュータに別のペレットを落とすように合図する。コンピュータは、ペレットがトラフから採取された日時を記録し、このデータから実験者が食事パラメータを計算することができます。食事パラメータを計算する際に食事は前の作業に基づいて定義され、10分(つまり動物が10分間食べない場合は、動物の食事の終わりとなる)に設定した場合、最小の食事サイズも3ペレットに設定した。食事の期間、食事数、食物摂取量、食事の大きさおよび食事間隔はオペレータが望む任意の期間のソフトウェアによって計算することができる。食事期間を算出できる摂食パラメータのうち、雄ラットおよびマウスおよび雌ラットにおけるオロフェイシャル・ノシセプションの連続的な非侵襲的生物学的マーカーであることが示されている。食事の期間の測定は、定量的であり、訓練や動物の操作を必要とせず、皮質の参加を必要とし、他の実験的に誘発された行動と競合しない。これらの因子は、このアッセイを、顔面の異性の記録のための他のオペラまたは反射法と区別する。

食事期間は、TMJ関節炎(図2)および虫歯を有する動物に適用された顔面痛および食事期間測定の行動相関である(図3)。1つの実験では、ラットはCFAの高い250mg用量を投与した後にTMJ関節炎を有し、この治療は19日間の食事期間の有意な増加を誘発した(図2)。各TMJ関節に注入された低用量のCFA(10mg)は、この食事期間アッセイを用いたCFA投与に対する用量応答を示すわずか2〜3日間52の食事期間の増加を生じさせる。食事の持続時間は、顎顔面領域における可射性応答を測定したが、膝の内側の関節炎からの応答を検出しなかった(図2)。
第2の実験では、食事期間は、パルプ露光を有するラットの可食応答も検出した(図3)。パルプ暴露は虫歯をもたらし、ヒト42における歯痛のモデルであった。食物摂取量、食事数、食事サイズなどの他の摂食パターンは、これらの他の食事パターンが食事期間<su...

食事の持続時間の延長は、顔面痛を有するヒトの保護行動と同様のげっ歯類における顔面のノシシブ行動を表す。食べることは、訓練や動物操作を必要とせず、皮質の参加を必要とし、他の実験的に誘発された行動と競合せず、このアッセイを代替反射またはオペラの測定と区別する行動である。

A lengthening in meal duration can be used to measure an increase in orofacial mechanical hyperalgesia having similarities to the guarding behavior of ...

本手順の全体的な目的は、食事時間の測定値が顎および歯の痛みと定量的な相関関係にあるかを判断することです。まず、ラットを給餌ケージに入れ、食事時間のベースライン値を測定します。ベースライン値が得られた後、顎関節または対照としての膝関節に疼痛誘発剤を注入します。注入後、動物を飼育ケージに戻し、摂食行動がベースラインレベルに戻るまで観察します。最終的に、顎関節痛のある動物は食事時間が長くなることを示すために、データを収集し分析します。げっ歯類モデルにおける痛みの分析に食事時間や食事パターンを用いることには多くの利点がありますが、他のモデルと比較した本モデルの主な利点として、動物を拘束する必要がなく、また動物にトレーニングをさせる必要もないという2点が挙げられます。数年前、動物モデルにおいて口腔顔面痛を測定するための適切な方法がないことに私たちは気づきました。これをきっかけに、食事パターン分析を用いて口腔顔面痛を測定できる可能性を検討し、現在、口腔顔面痛の測定に利用しているモデルの開発に至りました。食事時間の研究は、コンピュータ制御のペレットフィーダーを備えた遮音室で行われます。このフィーダーは、45 milligramのペレットからなる齧歯類用飼料をフードホッパーに供給します。これらのペレットは、フォトビームが設置された下のトラフに dispensed されます。フォトビームの開口部には、粒子が光路を遮るのを防ぐため、ガラスカバーのスリップが配置されています。ラットがトラフからペレットを取り出すと、フォトビームが復帰し、コンピュータに別のペレットを落とすよう信号が送られます。これにより、動物が追加の動作を行うことなく、常にペレットが利用可能な状態になります。水ボトルに水を満たした後、下の廃棄パンに吸収紙を敷いてください。まず、アニモンモニターソフトウェアを起動し、プルダウンメニューから「configuration（設定）」を選択してフィーダーユニットをセットアップします。「pellet delivered（ペレット配送済み）」の入力ボックスのチェックを外し、ペレットが dispensed（配送）された時ではなく、トラフから除去された時に記録されるように設定します。次に、「automatic file naming（自動ファイル命名）」のボックスにチェックを入れ、ファイル名が自動的に設定されるようにします。編集プルダウンメニューから「experiment」オプションを選択した後、データが適切に収集されるように、新しいウィンドウにファイル名を入力します。「experiment length days」ボックスに、実験の総時間を超える値を入力してください。次に、食事期間および基準として、「number of hours in a day」の値を24に設定します。10分と

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行動

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マウスで誘導機械的異痛症の倹約神経損傷（SNI）モデル

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げっ歯類におけるオロ顔面ノシチブ応答の尺度としての食事期間

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