Name: マイクロインジェクションアッセイをキズやインビボ表皮の局在は、応答記者傷ショウジョウバエ胚。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-01T21:20:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 学ぶマイクロインジェクション法によるショウジョウバエ胚の表皮傷応答の可視化。ガラス針で穿刺し、共焦点顕微鏡で傷周辺細胞の遺伝子発現をリアルタイムに観察する手法です。

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このプロトコルは、マクギニスラボ、キムA.メイスとヨセフC.ピアソンの以前のメンバーと共同で開発されています。私たちは、貴重な株式を整理し、配布するための自​​分の仕事のためのブルーミントンショウジョウバエストックセンターの継続的な努力に感謝します。この作品は、国立衛生研究所（R01 GM077197およびK12 GM68524）とハーバート·スターンの家族からの資金によってサポートされていました。 MTJは現在、少数の健康と健康格差の国民の協会からの研究資源のための国民の中心および認可番号8G12MD7603-27からの助成金番号5G12RR003060-26でサポートされています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも少数の健康と健康格差や国立衛生研究所国立研究所の公式見解を示すものではありません。

ショウジョウバエ胚性創傷プロトコルは、5つのステップに要約することができる：（1）胚収集、（2）胚の調製（3）胚負傷（4）胚のマイクロインジェクション、および（5）胚固定。 1。胚コレクション<ol><li> 2〜3日後にeclosing、大人のハエを集め、胚収集ケージに50人の女性と25人の男性を追加します。 </li><li> 3日間、毎朝、新鮮なリンゴジュース寒天プラス酵母プレートを置きます。 （注）25℃のインキュベーターで12時間昼間のスケジュールで最適な胚収集、サイクルのためのハエ（17:00ライト「OFF」「ON」5時点灯）、女性のハエは、明サイクルの変化に対応し、光を&quot;OFF&quot; 10,11 &quot;ON&quot;ラ ​​イトから切り替え中の卵の大きな数量を堆積する。 </li><li>デイ3の午後には、ケージの新鮮なリンゴジュースを加えた酵母寒天プレートを配置し、2時間の胚を収集します。ケージに新しい酵母プレートを配置し、保存2時間の回収プレート。 </li><li>胚を熟成25℃でさらに14時間回収プレートを保管してください。 注：創傷治癒はショウジョウバエの開発中にどの段階でアッセイすることができるが、このホワイトペーパーで説明した損傷誘発性の転写レポーターは、ステージ15〜16 12の間で最適な活性を有する。後期17で、胚は簡単に成熟キューティクルを貫通し、効率的に創傷の記者をアクティブまたは創傷誘導性転写を検出するにはあまりにも古いです。収集時間とピークラボ時間中に発生する創傷時間を確保するために、我々は2時間（16:00〜18:00）のための胚のコレクションのスケジュールに従う、18:00に新しいプレートとコレクションプレートを交換し、年齢コレクション·14時間（一晩）25℃でプレート、08:00（翌日）の胚を取った。 </li></ol> 2。胚の準備注意事項：このプロトコルは、シャープで多くのツールと​​オブジェクトの使用を含むまたはGで作られた小娘。けがをしないように注意して、すべての鋭利とガラスのオブジェクトを処理します。 <ol><li>優しくプレートおよび旋回2-3 mLの水を添加することにより、絵筆を持つコレクションプレートから胚を取り出します。ナイロンメッシュとコレクションチューブにプレートから水や胚を移す。 </li><li>プラスチックシャーレプレートのキャップに漂白剤4〜5 mlを添加し、2分間の漂白剤で胚を含むコレクションチューブのメッシュカバーの端を浸し、胚の外側の卵殻を除去する。手動でコレクションチューブを漂白剤にに凝集から胚を防ぐために、数回回転させます。水10倍で胚を洗浄し、ペーパータオルの上絨毛膜を除去した胚を含むメッシュカバーコレクションチューブを乾燥させます。 </li><li>寒天プレートにナイロンメッシュから〜50胚を転送するために解剖針を使用してください。私たちは、胚の位置合わせのコントラストや助剤を添加する寒天プレートに緑色の食品着色料を追加します。解剖顕微鏡下で、エンブリーを揃える、〜25胚の2列を作るスライド上のOSそれらはマイクロインジェクション装​​置上の穿刺針に対して直角になるように。ガス交換の目的での胚の間に小さなスペース（約1胚の長さ）のまま。 2列は離れて約5ミリメートルである必要があります。 </li><li>整列胚の上に両面接着テープでスライドを置き、慎重にスライドに緑のプレートから胚を転送するスライドを押してください。次いで、空気胚を乾燥〜25分間胚の内部の圧力を低下させ、創傷時バーストを防止する。 </li><li>さらに脱水を防ぐために、胚の上にハロカーボンオイルミックスの2〜3滴を配置します。 </li></ol> 3。胚創傷は<ol><li>注射顕微鏡ステージにおける胚のスライドを配置します。視野内の胚を見つけ、倒立顕微鏡のステージを移動練習。 注針で作業を始める前に、背腹軸に沿った胚の中央面に焦点を当てています。の効率的な創傷を可能にするために整列胚は、針装置に近い行を負傷させ始める。視野内に整列された胚の行の上端を持って、ステージを移動します。 </li><li>慎重に配置して、針ホルダ引き込ま針を固定します。スライドに向かって針を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用してください。同じ焦点面に、胚と針の位置を合わせます。針は胚に焦点が合っていると、マイクロマニピュレータで針を移動しないでください。 </li><li>行の次の胚に移動して、根っから胚を穿刺する段階を移動します。最初の行が負傷し終わったら、スライドを移動する前の段階から持ち上げて完全に針を移動するためにマイクロマニピュレーターを使用して、手動でスライド180°回転し、二行目を取った。 </li><li> （プロシージャのステップ5を参照）を室温でハロカーボンオイルの下で胚を保存し、in situハイブリダイゼーションまたは抗体染色でやっている場合、胚の固定を進める。代わりに、4〜6時間の胚を保存するハロカーボン油の下および創傷転写蛍光レポーターの可視化（代表的な結果）に進む。 注：蛍光レポーターの可視化のために、我々は50％の1 -フェノキシ-2 -プロパノール13を用いて胚を麻酔する。胚はハロカーボン油から除去し、新しいスライド上に配置されている。我々は、胚の周りにガラスビーズを置き、麻酔を数滴を追加し、胚にカバースリップを配置。 </li></ol> 4。胚のマイクロインジェクション注：我々は、プロトコルで使用するマイクロインジェクション装​​置は、アッセイ中に特定のボリュームを提供するために自動化されていない。我々はマイクロインジェクションを視覚化し、配信ボリュームを正常化しようとするソリューションに染料を追加します。あまりにも多くの溶液を胚に注入されている場合は、卵黄膜が破裂します。 <ol><li>化学溶液を加えた色素の1μlのリアからのロード針（ 例えば 0.6 H 2 O 2）。毛細血管を許可する針の先端に薬液を描画する行動。 </li><li>針を破るために、スライドとコートハロカーボンオイルミックスとエッジの角度でカバースリップを配置。角度のついたカバーガラスのエッジに焦点に取り付けられた針を持って、ゆっくりと壊れたまで針の先端間でカバースリップの端を移動します。マイクロインジェクション装​​置に圧力を適用し、化学溶液を加えた染料は、針を流出していることを確認してください。 </li><li>顕微鏡ステージ上に整列した胚を含むスライドを置きます。胚と同じ平面内針を焦点に進みます。同時に穿刺し顕微注入する薬液を加えた各胚に染める。 注：詰まっ針が頻繁に発生し、不完全なマイクロインジェクションを回避するために、新しい針を破る。鈍針の先端のようにきれいに角度のついた針の先端のように巻かれていません。破損の際に非90°の角度にカバースリップを調整すると、角度のついた針の先端を製造することが最適である。 </li></ol> 5。ホルムアルデヒドFiのxation 注意事項：このショウジョウバエの固定に使用される化学物質は有害である。化学薬品を取り扱う際の個人用保護具（ 例えば 、手袋、白衣、および安全ゴーグル）を使用します。規制化学物質の廃棄のための個々の施設のガイドラインに従ってください。 <ol><li>傷に誘導される遺伝子の転写活性化が起こるために負傷した後、15、30、60、またはそれ以上の分を待ちます。注入スライドから胚を削除するには、慎重に、スライドからハロカーボンオイルミックスを排出ラックに対してスライドリーンとキムワイプで終わりをブロット。 </li><li>スライド上でヘプタンをすすぎ、ガラスペトリ皿にリンス液を洗浄するためにガラスピペットを使用してください。ヘプタンは、テープを溶解し、胚をリリースする予定。すべての胚をスライドから除去されるまで洗い流し続ける。すべての胚をスライドから除去されるまで、次のスライドに進みます。 </li><li> 20ミリリットルSCIにガラス皿からヘプタンを加えた胚ソリューションを転送ntillationバイアル。 2〜3分間バイアルを振る、ヘプタンを除去し、新鮮なヘプタン5ミリリットルを追加。 </li><li>新鮮な固定液を5ミリリットルを追加します（レシピのための試薬のリストを参照）。バイアルに蓋をし、軌道プラットフォームシェーカーに接続します。 220〜230 rpmで25分間胚を含むバイアルを横に振る。 </li><li>振盪後、インタフェースのポップで泡をしてみましょう。完全に胚を引き上げ避け、下、ピペットを用いて水相を除去します。底部層は、固定液で構成され、適切に配置されるべきである。 </li><li>メタノール5ミリリットルを追加するバイアルにキャップをして、20〜30秒間、手でよく振る、スワールやベンチの上に置きます。負傷した胚は、間に滞在し、底に沈むことはありません。 注：固定後無傷の胚の卵黄膜は、通常、メタノールと脱水工程中に破裂します。しかし、負傷した胚における卵黄膜は、すでに分割され、脱水工程は、卵黄MEMBは削除されませんRANE。手devitellinzationは固定プロトコールを完了するために必要です。 </li><li>慎重にトップヘプタン層を除去した後、新鮮な5mlのメタノールを加える。バイアルを振る、胚をシンクする必要があります。 </li><li>ガラス転移ピペットを用いてメタノールプラス胚溶液を除去し、ガラス皿にナイロンメッシュコレクションチューブに集める。 </li><li>メタノールを除去し、1×PBS溶液で胚をすすぐ。 </li><li>リンゴジュースプレートにナイロンメッシュからの胚を転送します。プレートの表面に沿って胚を広げる。 </li><li>ダブル粘着テープガラススライドに胚を移す。 1X PBSで胚をカバーしています。 注：胚が原因卵黄膜の凝集する傾向があります。リンゴジュースの場所を使用すると、凝集した胚の迅速な分離を可能にする。力から胚を除去するために適用されたときに胚を寒天プレートに沈むため、胚をプレートから除去し、両面接着テープをガラススライドに移されなければならない卵黄膜。 </li><li>慎重に卵黄膜を「POP」する解剖針で胚を押してください。胚はPBS中に沈むはずです。 </li><li> 1.5ミリリットルチューブに1×PBSプラス胚を転送するためにガラスピペットを使用してください。 4℃で1×PBSおよびストアとの胚をすすぐエタノールを用いて胚を脱水するために進んでください：PBSシリーズ、in situハイブリダイゼーションや免疫局在プロトコル14 で続行します。 </li></ol>

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利害の対立が宣言されていません。

外部の合図にすぐに転写調節応答は、細胞がストレス、損傷、または感染を含むことができ、細胞外刺激に対する局所的な応答を調整することができます。ローカライズされた応答の不適切な制御は、傷害を修復するために有害な隣接セルへの影響だけでなく、資源の無駄を持つことができます。 ショウジョウバエの胚は、安価で容易な保守のモデル生物で、基本的な創傷治癒実験を行うための優れたシステムを提供します。他のモデル生物の研究とショウジョウバエの間のコラボレーションの可能性は、多くの生物学的な質問を探検するユニークな機会を提供します。 創傷レポーターの付加的な技術は、表皮の創傷応答経路の活性化に新しい遺伝子の寄与を試験するための効率的な方法を提供し、突然変異体の遺伝的背景を組み合わせたものである。我々は、表皮の創傷誘発性の転写レポーターがAV持って2 回目と3 回目の染色体5の両方でailable。本研究では、UAと過剰発現16のGAL4システムを使用しています。致死突然変異対立遺伝子を用いた研究のために我々は蛍光バランサー染色体、 例えばクルッペル GFP 17を使用して遺伝的背景を決定する。我々は、いくつかの遺伝的背景（ 表1）に巻かれたレポーター局在を解析した。 技術の可能性のある変更は、マイクロインジェクションおよび創傷を組み合わせることである。マイクロインジェクションは、胚への薬液を導入するために使用することができる。いくつかの化学化合物が試験されており、表皮の創傷レポーター9の活性を調節することが見出された。同時創傷およびマイクロインジェクションのこの方法は、創傷信号に応答し、直接18を創傷後の遺伝子発現変化をモニターするために使用することができるショウジョウバエ胚における細胞の数を増加させるために有用であり得る。マイクロインジェクション技術の将来の応用は、表皮創傷応答の調節のための新規な化学物質を試験するであろう。 遺伝子研究のためのモデル系として、ショウジョウバエを効率的に複雑な問題に対処するための簡単なプロトコルを幅広く提供しています。 ショウジョウバエの技術の実現可能性に関する最近の報告では、さらにショウジョウバエ研究者コミュニティの影響を拡大する手段として、血球移行19と寄生蜂感染20の使用を強調しています。傷の修復の研究に加えて、 ショウジョウバエ成虫ディスクシステム21,22と再生のための古典的なモデルを提供します。成虫椎間板再生研究やパンク/マイクロインジェクション負傷中の組み合わせの進歩は、組織修復のよく保存されたコ​​ンポーネントを発見するための優れたシステムを提供します。

マイクロインジェクション技術を用いて、 ショウジョウバエの胚の操作は、十分に確立されたアッセイの1である。表皮創傷応答レポーター法の重要性は、蛍光リポーターでパンク/マイクロインジェクションのためのプロトコルを組み合わせて、 ショウジョウバエの胚における表皮損傷に対するin vivoでの応答を視覚化することです。このメソッドの目的は、表皮の穿刺損傷に対する転写応答を制御するプロセスを調査するツールとしてショウジョウバエを使用するために科学者のより広範なセットを有効にすることです。 ショウジョウバエの単層、表皮、穿刺負傷2の後に表皮の創傷応答を研究するための簡単なシステムを提供します。 ショウジョウバエの胚は、遺伝的に創傷応答、炎症、および再上皮3を含む、創傷修復の段階を分析する堅牢なモデル系である。多くのまたはほとんどの接合体変異体はembryogenesの最後に生き残るため、これは一部にはあるで、発達パターニングが深くゆがんで行く場合でも、表皮の障壁を開発しています。 GRH-標的遺伝子ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）およびチロシンヒドロキシラーゼ（PLE）は転写的傷害4部位を中心に活性化することが確認され、よく保存された転写因子粒子の粗いヘッド（GRH）、以前のキャラクタリゼーション。 ショウジョウバエ創傷応答のためのモデル生物として哺乳動物の創傷治癒5の研究を進めるために、調査の補完的なラインを提供しています。その後の研究では、追加のショウジョウバエの創傷誘導される遺伝子を同定し、6が負傷きれいにするin vivoでの表皮創傷応答を監視するために、多くの蛍光創傷記者の「ツールキット」を開発しました。 ショウジョウバエ創傷治癒の調節に関する最近の報告では、細胞遊走を調節する多くの7,8経路の発見を可能にする、創傷閉鎖表現型に焦点を当てている。の分析を蛍光創傷記者が、私たちの研究では、表皮の傷誘導性遺伝子9の局所的な発現に必要な遺伝子の新規のセットを同定した。創傷応答レポーター方法の利点の一つは、結果は、信号が隣接セルへの損傷部位から形質導入されるかの機構により多くの洞察を提供することである。しかし、創傷応答レポーター方式のデメリットの一つは、結果が直接、創傷治癒や修復に表現型にリンクしていないということです。遺伝的および化学的な画面できれいな創傷穿刺プロトコルの広範な使用は、転写応答の新たな規制当局が特定することが負傷表皮および傷害治療の哺乳動物モデルに発見創傷治癒の翻訳を促進することができます。

<table><tbody><tr><td>酵母</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>51475</td><td></td></tr><tr><td>リンゴジュース</td><td>ジェネリック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>50-824-297</td><td></td></tr><tr><td>漂白剤</td><td>ジェネリック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボン オイル、700 W</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H8898</td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボン オイル、27 W</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>H8773</td><td></td></tr><tr><td>1-フェノキシ-2-プロパノール</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>484423</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>H324</td><td></td></tr><tr><td>メチル-&β;-シクロデキストリン</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>C4555</td><td></td></tr><tr><td>トルイジンブルー</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>89640</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアルデヒド、16%</td><td>Polysciences, Inc</td><td>18814-20</td><td>有毒化学物質</td></tr><tr><td>ヘプタン</td><td>フィッシャー科学</td><td>的なH360-1</td><td>有毒な化学</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー科学</td><td>的なA412-1</td><td>有毒な化学薬品</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>フィッシャー科学</td><td>50-899-90013</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>のフィッシャー科学</td><td>的な50-255-956</td><td></td></tr><tr><td>RNase自由なH2O</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP2819-100</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエインキュベーター</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-197</td><td></td></tr><tr><td>フライケージ</td><td>Genessee Scientific</td><td>59-100</td><td></td></tr><tr><td>胚採取チューブ</td><td>Genessee Scientific</td><td>46-101</td><td></td></tr><tr><td>プラスチック ペトリ皿</td><td>フィッシャー Scientific</td><td>50-202-037</td><td></td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>汎用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペイントブラシ</td><td>汎用</td><td></td><td></td></tr><tr><td>解剖針</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-965A</td><td>鋭利な物体</td></tr><tr><td>ガラスカバースリップ</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>3306</td><td>鋭利な物体</td></tr><tr><td>顕微鏡 スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>4445</td><td>鋭利な物体</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>Stemi-2000</td><td></td></tr><tr><td>毛細血管針</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>鋭利な物体</td></tr><tr><td>ニードルプラー</td><td>成重</td><td>PC10</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクション ニードルホルダー</td><td>成重</td><td>MINJ4</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MN151</td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td>プリモヴェール</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ペトリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-747A</td><td>鋭利な物体</td></tr><tr><td>ガラス パスツールピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-063-172</td><td>鋭利な物体</td></tr><tr><td>移送バルブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>シンチレーションバイアル</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>03-337-7</td><td>鋭利な物体</td></tr><tr><td>オービタルシェーカー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-259-260</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mlチューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td>ック05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>レーザー走査型共焦点</td><td>ライカ</td><td>SP2</td><td></td></tr><tr><td>固定液</td><td>(5 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% ホルムアルデヒド</td><td>2.5 ml</td><td></td><td>有毒化学物質</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>0.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EGTA</td><td>0.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase free H2O</td><td>1.5 ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボンオイルミックス</td><td>(10 ml)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハロカーボンオイル、700 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr>ハ<tr><td>ロカーボンオイル、27 W</td><td>5 ml</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロインジェクションアッセイをキズや<em&gt;インビボ</em&gt;表皮の局在は、応答記者傷<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚。

Microinjection Wound Assay and In vivo Localization of Epidermal Wound Response Reporters in Drosophila Embryos.

ショウジョウバエ胚は、両方とも厳しい外部環境から内部の細胞を保護するだけでなく、細胞の恒常性を維持するのに役立つ堅牢な表皮層を現像する。ガラス針で穿刺損傷は生きている胚または幼虫に局在レポーターシグナルで可視化することができる傷の転写レポーターを活性化し、迅速な表皮、創傷応答を誘発する直接的な方法を提供する。パンクやレーザー損傷はまた、創傷部位に血球の動員を促進する信号を提供する。胚を穿刺サイトから血リンパの即時漏れを最小限に油媒体中に注入されると、このような負傷の胚の90％以上が成人期まで生き残るように驚くべきことに、後期胚における重度（根っから）穿刺損傷はまれにしか、正常な胚発生を破壊しない。傷手順はAG上胚の手動アラインメントを含むショウジョウバエの胚の顕微操作を、必要としませんARプレートやスライドを顕微鏡に整列胚の移植。 ショウジョウバエ上皮創傷応答アッセイは、創傷治癒、ならびに創傷治癒を促進する潜在的な化学的化合物をスクリーニングする方法を促進する生物学的機能の種々の遺伝的要件をテストするための迅速なシステムを提供する。短いライフサイクルと簡単に培養ルーチンは、 ショウジョウバエの強力なモデル生物にする。 ショウジョウバエクリーンな創傷治癒には保存された調節を見つけるための優れたシステムを提供し、調査中である方法で、自然免疫応答、、で、表皮再生応答を調整するために表示されますショウジョウバエや哺乳動物の表皮創傷に共通するメカニズム。

この方法に示す結果を得るために、緑色蛍光タンパク質（GFP）のオープンリーディングフレームは、 ドーパデカルボキシラーゼ（DDC）からのプロモーター/創傷誘導性エンハンサー配列に融合されたDsRedは、（ チロシンヒドロキシラーゼから創傷エンハンサー配列に融合されているPLE）4,6。ライブショウジョウバエ胚において、蛍光創傷レポータータンパク質の成熟は、最適な4-6十分なタンパク質の蓄積のための時間を視覚化することを可能にする創傷後時間、だけでなく、蛍光状態15に酸化する蛍光タンパク質のための時間です。レポーター局在を観察するために、化合物蛍光顕微鏡で十分である。レポーター局在の高倍率を観察するために、共焦点顕微鏡は、複数の光学切片の最大投影（ 図1）を生成するために最適である。 ショウジョウバエの胚のin vivoイメージング共焦点は、RAによって複雑になる胚のPIDうねり。 。胚の完全なビューは、20X対物レンズを得ることができ、創傷部位の拡大図は、40X対物レンズを用いて得ることができる。表皮創傷レポーター局在の上面図は、連続する101μmの光学切片を用いて画像化することができる。表皮創傷レポーター局在の横図40は、連続1μmの光学切片を用いて画像化することができる。 標準的な遺伝子交差方法を使用して、それが遺伝子変異を創記者を組み合わせることが可能である。本論文で提示つの例は、 フロティリン-2（FLO-2）であり、なぜなら機能喪失（P因子の挿入で生成ヌル対立遺伝子）および機能獲得（過剰発現は全ての細胞に遍在する表現で生成される）の変異株FLO-2フロー-2遺伝子産物は、レポーター9 Ddcに巻か-GFPの局在化を阻害するのに必要かつ十分で実証する（ 図2Aおよび2B）。マイルを使ってcroinjectionプロトコルは、薬液のsuperactivatesの導入や、創傷記者の局在を阻害するか否かを試験することが可能である。化学的に負傷した胚を同時に負傷し、1％トルイジンブルー染料および可溶化化合物の1:4の比を注射した。トルイジンブルー色素は、体腔内に注入される可溶化化合物の視覚的確認を可能にした。対照胚は、化学せずに、1％トルイジンブルー色素と溶質の1:4の比を含む壊れた針で負傷した。両方の薬液がグローバルに十分であるので、この論文で提示つの例は、DDC-GFPの局在9（ 図2Cおよび2D）レポーター創傷活性化、過酸化水素（H 2 O 2）、メチル-β-シクロデキストリン（MβCD）である。過酸化水素（H 2 O 2）2 O M.メチル-β-シクロデキストリン（MβCD）0.6は1メートルに可溶化したHで希釈した3 mmまでのNaOH。胚の固定プロトコールを用いて、創傷部位の周囲の、ローカライズされたドメインに巻か応答遺伝子の転写活性化を検出することができる。本論文で提示一例DDCはとPLE転写物4,6,9（ 図3Aと図3B）を検出するためにRNAプローブのin situハイブリダイゼーションである。 <img alt="図1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig1.jpg" width="600px" /> 図1。 DDC-GFP及びPLE-DsRedのは、（B）は（A）DDC-GFP巻かレポーターのトップビュー。負傷野生型の胚で記者ローカリゼーション。明と蛍光像を巻か PLE-DsRedのトップビューは、レポーターを取った。全ての画像は、20X対物レンズで、ライカSP2共焦点顕微鏡で収集した。矢印は、創傷部位をマーク。 [データ]パネルの破線Sは、胚の輪郭をマークします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig2.jpg" width="500px" /> 図2。遺伝的変異体背景や化学微量注入した胚。明と負傷フロティリン-2（FLO-2）変異胚の蛍光画像におけるDDC-GFP巻かリポーターの局在。（A）の機能喪失FLO-2 {KG00210}の変異体、すべての表皮細胞全体のレポーター活性の膨張（B）の機能獲得フロー-2（アルマジロ-GAL4、UAS-Flo2）変異体、すべての表皮細胞全体のレポーター活性の阻害。（C）過酸化水素（H 2 O 2 ）ソリューションマイクロインジェクション、REPの拡大すべての表皮細胞全体orter活動。（D）メチル-β-シクロデキストリン（MβCD）ソリューションマイクロインジェクション、すべての表皮細胞全体でレポーター活性の拡大。全ての画像は、20X対物レンズで、ライカSP2共焦点顕微鏡で収集した。矢印は、創傷部位をマーク。データパネルの破線は、胚の輪郭をマークします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig2highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750fig3.jpg" width="600px" /> 図3。創傷応答遺伝子のRNA転写物の検出。傷ついた野生型の胚におけるin situハイブリダイゼーション及びRNAの検出における蛍光画像。DDC（A）及びPLE（B）RNA転写物は、創傷部位の周囲に蓄積する。全ての画像コレクション1だった20Xの目的とライカSP2共焦点顕微鏡、上のテッド。矢印は、創傷部位をマーク。データパネルの破線は、胚の輪郭をマークします。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750fig3highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="表1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50750/50750table1.jpg" width="600px" /> 表1。表皮の創傷応答記者の概要。4創傷応答記者（DDC、PLE、MSN、KKV）の挿入は、2番目と3番目の両方の染色体上に用意されています。創傷応答レポーターのすべては、 野生型の背景（ 例えば 、 &quot;ローカル&quot;表現型）の穿刺損傷部位の周囲の表皮細胞の限られた数の蛍光遺伝子（GFPまたはDsRedの）を活性化。DdcにおよびMSN創傷応答記者が探しGRHを必要とするfluorescenの活性化穿刺損傷（ 例： &quot;none&quot;に表現型）の後にCE遺伝子。創傷記者はすべて、穿刺損傷（ 例えば 、 &quot;グローバル&quot;表現型）後の蛍光遺伝子の局在のためにFLO-2が必要です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50750/50750table1highres.jpg" target="_blank">拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

非常に後期ショウジョウバエの胚の胚性表皮は、急速な刺し傷応答解析のためのin vivoのシステムを提供し、哺乳動物モデルへの変換のための創傷治癒の研究を進めるために遺伝子操作や化学マイクロインジェクションの治療と組み合わせることができます。

The Drosophila embryo develops a robust epidermal layer that serves both to protect the internal cells from a harsh external environment as well as to ...

この手順の全体的な目的は、ショウジョウバエ胚における表皮創傷反応のin vivoレポーターを可視化することです。これは、まずレポーター活性が一貫して検出される発生段階を収集することによって達成されます。手順の第2ステップでは、ガラス針とマイクロインジェクション装置を用いて胚に穿刺を行います。3番目のステップは、レポーターを可視化するために胚を麻酔することです。最終ステップでは、RNAプローブの発現パターンを検出することで、レポーターの局在を検証します。最終的に、共焦点顕微鏡を用いることで、穿刺傷害部位の周囲の細胞においてのみ、表皮創傷応答レポーターが特異的に活性化していることを示すことができます。創傷閉鎖を観察する既存の手法に対する本手法の主な利点は、穿刺による創傷で誘発される遺伝子発現を生体胚で観察できる点にあります。この方法は、損傷周囲の細胞がどのようにして即時的な創傷応答を制御し、修復を促進するかといった、組織修復分野における重要な疑問の解決に寄与します。創傷応答の制御は初期段階であるため、本手法の意義は組織再生の治療や診断へと広がります。創傷治癒のアッセイは、発生のどの段階においても行うことができます。しかし、ステージ17までにクチクラが成熟しすぎると、既知の創傷レポーターが活性化されなくなります。実演のため、胚を採取するためにステージ15から16の個体を傷付けます。2〜3日齢の成虫（メス50匹、オス25匹）を収集してください。それらを、リンゴジュースとアガーの新しいプレートと少量の酵母ペーストを入れた胚収集ケージに移します。今後3日間、毎朝ケージを25 °Cに維持してください。プレートを新しいものに交換します。3日目の午後に、新しいプレートに2時間卵を蓄積させます。このプレートを25°Cで14時間保存します。2時間の産卵により、翌日には約200個の胚が得られるはずです。プレートに数mLの水を加え、静かに揺らして混ぜ合わせます。次に、絵筆を用いて、プレートから水と胚を回収チューブ内のナイロンメッシュバスケットに移します。続いて、希釈した漂白剤を用意し、その中に胚を2分間浸します。この工程により、COR（卵殻残渣）が除去されます。胚が凝集するのを防ぐため、バスを数回ゆっくりと回転させます。2分後、流動水で胚をすすぎ、ペトリ皿でそれぞれ5秒間すすぎます。その後、胚バスケットをペーパータオルの上に移し、胚の水分を拭き取ります。次に、解剖針を使用して、メッシュから緑色の食用色素を加えたアガープレートに胚を約50個移動させます。この色素は、膝卵の視認性を高めるためのものです。解剖顕微鏡下で、胚を約5 mmの間隔で2列に並べます。ガス交換が行われるよう、胚1個分の幅を空けて列を配置します。次に、スライドガラスに両面テープを貼り、列がスライドの長手方向に対して垂直になるように胚の上に慎重に押し付けます。内部圧力を下げるため、胚を風乾させます。これにより、損傷を受けた際に胚が破裂するのを防ぐことができます。25分後には、最初に準備したスライドが乾燥しているはずです。ここで、さらなる脱水を防ぐために、胚にハロカーボンオイルを2〜3滴滴下し、直ちに乾燥した胚の損傷操作へと進みます。胚を載せたスライドを注射顕微鏡のステージに置きます。視野内で胚を探し、倒立顕微鏡のステージ移動の練習を行います。次に、背腹軸に沿った胚の中央平面に焦点を合わせ、最初に整列している列の最上段の胚を視野に入れます。次に、プルードニードルをニードルホルダーに慎重にセットし、固定します。マイクロマニピュレーターを使用して、ニードルをスライド上の位置まで降ろします。ニードルを胚と同じ焦点面に合わせます。ここで、マイクロマニピュレーターをそれ以上調整しないでください。次に、ステージを移動させて、胚を貫通するように穿刺します。その後、列の次の胚へ移動します。1列目の穿刺が完了したら、針をステージから完全に上に離します。次にスライドを回転させ、2列目の胚の穿刺を続けます。すべての穿刺が完了した後、胚を直ちに固定し、in situ ハイブリダイゼーションまたは抗体染色に供することができます。蛍光レポーターを確認するには、4～6時間待機してから胚を新しいスライドガラスに移動させ、胚の周囲にガラスビーズを配置します。次に、麻酔剤である50% One phenoxy, two propanolを数滴加え、マイクロインジェクションのために胚の上にカバーガラスを載せます。インジェクション針の後方から、0.6 molar hydrogen peroxideなどの染料を加えた化学溶液1 µLをロードします。毛細管現象により、化学溶液を針先まで吸い上げます。次に、ハローカーボンオイルミックスの中で、カバーガラスの端を利用して針先を切り落とします。まず、角度をつけたカバーガラスの端と、ほぼ90度にならない程度の角度で、固定した針のピントを合わせます。次に、カバーガラスの端を針先にそっと押し当てて、針先を折ります。その後、マイクロインジェクション装置に圧力をかけ、溶液が針から流出することを確認してください。溶液が流れない場合は、針先をさらに少し折ります。次に、胚に穿孔を行う際と同様の手順を実施します。ただし、今回は穿孔と同時に溶液をマイクロインジェクションします。理想的な注入量は 10 nanoliters です。胚に溶液を注入しすぎると、テキストプロトコルの固定手順に従っている間にVitale膜が破裂することがあります。以下のステップに細心の注意を払ってください。スライド上のヘプタンを洗い流す際は、プラスチック製ではなくガラス製ピペットを使用し、胚をガラス製ペトリ皿の中心に集める際にもガラス製器具を用いて撹拌してください。その後、固定液の中で胚を220〜230 RPMで25分間振盪させます。振盪後、界面の気泡が消えるまで待ち、底層の水相を完全に除去します。この際、胚を一緒に吸い上げないよう注意してください。メタノールを添加すると、損傷した胚が後に界面に集まりますので、このようにプレートの表面に胚を分散させ、このように両面テープを貼ったガラススライドへ移します。次に、解剖針で胚を慎重に押し、Vitale膜を破裂させてから脱水処理に進みます。野生型ショウジョウバエに、DOPA脱炭酸酵素またはチロシン水酸化酵素のエンハンサーに融合させた蛍光レポーターを導入し、上述のアッセイに供しました。明視野では創傷部位を観察でき、蛍光照明下ではDCD創傷レポーターの活性を観察することができました。チロシン水酸化酵素レポーターでも同様の結果が示されました。両画像は、Leica SP2共焦点顕微鏡を用い、20倍対物レンズで撮影しました。この手順は、loss of function flow 2変異体を用いて行われました。背景として、全細胞で普遍的に発現させた機能獲得型 flow two 変異体では、DOPAデカルボキシラーゼレポーター活性が表皮細胞全体に拡大しました。また、表皮細胞全体でレポーターの抑制が認められました。次に、胚に傷を付けるのと同時に、可溶化化合物、ウジンブルー染料、過酸化水素、および水を注入したところ、表皮細胞においてDOPAデカルボキシラーゼレポーター活性が拡大しました。同様の現象は、インサイチュハイブリダイゼーションを用いて、水酸化ナトリウム中のメチル-β-シクロデキストリンを注入した場合にも認められました。創傷応答遺伝子の転写活性化は、内因性DOPAデカルボキシラーゼを用いてアッセイされました。RNA発現は創傷部位周辺に局在していることが確認され、当然ながらチロシン水酸化酵素のRNA転写物も創傷部位に蓄積していることが見出されました。この手法を習得すれば、適切に実施した場合、60分で完了させることができます。本手順を行う際は、胚の配置調整に時間をかけすぎず、速やかに次のステップへ進むことが重要です。

microinjection-wound-assay-vivo-localization-epidermal-wound-response

Research

JoVE Journal

Bioengineering

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マイクロインジェクションアッセイをキズや

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