禁欲ラットで探しているヘロインに長期の食事制限の影響を研究するための手順

本手順の全般的な目的は、離脱条件下にある実験用ラットにおいて、慢性的食事制限などの環境操作がヘロイン探索行動の再発に及ぼす影響を調べることです。これは、まずラットの頸静脈に静脈カテーテルを外科的に挿入し、回復期間を経てヘロインの自己投与を可能にすることで達成されます。ラットは、オペラント条件付け装置を用いて10日間にわたりヘロインの自己投与訓練を受けます。

手順の次のステップは禁欲期であり、ラットを動物飼育施設に移動させ、餌へのアクセスを制限または非制限にする期間を設けます。最後に、ラットをオペラント条件付け装置に戻し、ヘロイン探索テストを行います。このテストでは、ヘロイン投与が停止したレバーを操作すると、ヘロインは投与されませんが、光と音というキューが作動します。最終的に、ヘロイン自己投与の履歴を持つ慢性的な餌制限ラットは、薬物投与環境および薬物に関連するキューに再曝露されることで、離脱条件下でヘロイン探索の顕著な増加を示すようになります。

本手法の既存の手法（再現手続きなど）に対する主な利点は、ヒトの状態では観察されない明示的なオペラント消去が行われない点にある。さらに、急性的な操作ではなく慢性的な操作を用いることで、ヒトの状態に対する構成概念妥当性をより高めることができる。本手法は、薬物探索行動と食物探索行動の根底にある共通の神経学的メカニズムなど、薬物依存分野における重要な疑問への回答に寄与し得る。

カテーテルは大量に調製し、オートクレーブで滅菌して長期間使用します。カテーテルを作製するには、まず弾性チューブを12 centimeterの長さに切断します。つまようじまたは18 gaugeの針を使用して、カテーテルの先端から3 centimeterの位置にシリコンを少量滴下します。

シリコンを24時間乾燥させた後、オートクレーブにかけます。その際、コネクターとして機能させるため、five-upカニューレの長いチューブを、プラスチック製ペデスタルの手前で直角に曲げておきます。手術当日にカテーテルを組み立てる際は、scholasticチューブの長い側を、five-upカニューレの曲げた金属チューブに沿って、プラスチック製ペデスタルのほぼ半分まで押し込みます。five-upチューブを、Tigonチューブと22ゲージの鈍端針を用いて、滅菌生理食塩水を満たした1 mLシリンジに接続します。

カテーテルに生理食塩水を流し、流れに遮断がないことを確認します。まず、動物を麻酔し、右肩および頭部の領域をアルコールとサージカルスクラブで除毛および洗浄します。乾燥を防ぐために眼にゲルを塗布した後、感染と脱水を防ぐためにペニシリンと生理食塩水を注射します。

周囲の組織から分離した後、標準的な手法を用いて外頸静脈を露出させます。曲がったピンセットを静脈の下に挿入し、静脈を持ち上げてわずかに伸展させた状態に保持します。静脈に小さなV字型の切開を加え、切開部が開いたままになるように保持します。

血管拡張器を用いて、カテーテルの短い3 cmの先端を、シリコンドロップが切開点に位置するまで心臓方向の静脈内へ進めます。カテーテルを3箇所の縫合糸で静脈に固定します。1つ目は可能な限り尾側に、2つ目はシリコンドロップの直近頭側に、そして3つ目は可能な限り頭側に結紮します。

カテーテルに生理食塩水を流し、閉塞していないこと、および縫合糸が締め付けすぎていないことを確認します。次に、ラットを腹側を下にして置きます。頭部を切開し、止血鉗子を挿入して皮膚を下の組織から剥離させ、皮下ポケットを作成します。

止血鉗子を皮膚の下に通し、カテーテルを挿入した肩の開口部へと導きます。結合組織を切開し、5-upの基部より最も吻側（頭側）の点において、カテーテルをしっかりとクランプします。5-upを取り外し、カテーテルの長い方を皮膚の下に通して、頭頂部の切開口から出します。

ハサミを使用し、止血鉗子でクランプした部分の下でカテーテルを切断し、5-upの長い端に再接続します。カテーテルを5-upの金属シャフトに沿ってプラスチック製台座まで完全に引き込み、生理食塩水を流して、流れに妨げがないことを確認します。縫合糸で創傷を閉鎖した後、ラットを脳定位固定装置に設置します。

露出した頭蓋骨を洗浄し乾燥させた後、手動ドリルを用いて表面に4〜5か所の穴を開けます。次に、ヘッドキャップの足場となるように、穴にマシンネジを挿入します。5-upコネクタをネジの間に配置し、カテーテルの余剰分を先に作成した皮下ポケットの中に収めます。

最後に、歯科用セメントを使用して5本の電極を頭蓋骨の上部に固定します。セメントが完全に乾燥した後、ラットを脳定位固定装置から取り外し、完全に回復するまで観察します。ラットはオペラント条件付けチャンバー内で個別に飼育されます。

ファンを備えた遮音室に囲まれています。右側壁の床から9cm上に2本の格納式レバーが取り付けられており、各レバーの上には合図灯が配置されています。作動レバーの上にはトーンモジュールが設置され、左側壁の上部中央には赤いハウスライトが配置されています。

餌と水は自由摂取（ad libitum）とする。薬剤ポンプは、リキッドスウィベルと金属スプリングで保護されたタイゴンチューブを介してカテーテルに接続する。手術からの回復および24時間の馴化期間の後、ヘロインの自己投与を開始する。

まず、カテーテルをヘパリン・ゲンタマイシン溶液でフラッシュします。次に、5-upコネクターをTigonチューブに接続し、金属スプリングを取り付けます。各セッションは、暗期の開始時に、アクティブレバーおよび非アクティブレバーの伸長、ハウスライトの点灯、およびQライト・トーン複合体の作動をもって開始します。

ラットに10日間、3時間間隔をあけて1日3回のセッションを行い、各セッションで30秒間、ヘロインを自己投与させます。アクティブレバーへの反応により、薬剤ポンプが作動し、22秒間のタイムアウト期間が開始されます。この期間中、ハウスライトは消灯し、アクティブレバー上のQライトおよびトーン複合体で作動します。不活性レバーへの反応も記録されますが、プログラム上の影響はありません。

自己投与訓練の後、ラットをオペラント条件付け室から出し、飼料と水が自由に摂取できる状態で動物施設にて個別に飼育します。翌日の1日間の薬剤ウォッシュアウト期間において、飽食群では飼料への自由アクセスを維持しつつ、飼料制限群では禁欲期間を開始するために飼料量を制限します。禁欲期間の朝に、薬物追求テストを実施します。

14日目に、ラットをオペラント条件付けチャンバーに戻し、金属製スプリングに取り付けます。1時間または3時間のセッションを行い、その間、能動レバーおよび非能動レバーへの反応に対して、薬物の提供を除き、自己投与トレーニング時と同じ結果が生じるようにします。これらの結果は、ヘロイン投与期間を通じて体重が安定していることを示しています。

自己投与トレーニング 禁欲期間中、飼料を自由に摂取できるラットは体重が増加し、食事制限を受けたラットは体重が約10～15%減少します。ここに見られるように、トレーニングが進むにつれて、注入回数とアクティブレバーへの反応回数は増加しましたが、インアクティブレバーへの反応回数は増加しませんでした。禁欲期間の後、食事制限を受けたラットのアクティブレバーへの反応は、満腹状態のラットと比較して有意に増加しました。一方、インアクティブレバーへの反応は極めて少なく、群間で同等でした。この手順に続いて。

特定の神経化学的および薬理学的システムを標的とするために、頭蓋内注射、マイクロダイアリシス、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学的手法などの他の手法を用いることができます。このビデオを視聴することで、ラットの頸静脈に静脈カテーテルを外科的に留置する方法、および標準的なオペラント条件付け装置を用いてヘロイン自己投与処置を行う方法について、明確に理解できるはずです。