Name: 精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: 学ぶLacIトランスジェニックマウスモデルを用いた造血幹細胞/前駆細胞のin vivo変異原性アッセイ。この手法により、自発的および変異原暴露後のDNA変異頻度、位置、タイプを特定し、遺伝的安定性と変異機構の理解を深める。

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我々は、この原稿でグラフィックデザインや写真撮影のためにデヴィッド·R·ロドリゲス、マサチューセッツ州に感謝したいと思います。この作品は、UTHSCSAフローサイトメトリー中核施設とUTHSCSAアドバンスト核酸基盤施設にGCCRI、NIH / NIA（5R21AG033339）とがんセンターサポート助成金（P30CA054174）からの資金によってサポートされていました。

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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

本明細書に記載のin vivo変異導入アッセイはもともとKohler らによって生成されたLacIトランスジェニックマウスモデルに基づいている。18このモデルは、lacIリレポーター遺伝子を有するλファージベクターを利用する。ベクトルは、感染性ファージ粒子に比較的単純な回復とその後のパッケージングを可能に隣接する2つのCOSサイトは、Eを感染させるために使用大腸菌 。ブループラークは、ファージに感染したEによって生成されます変異したlacI遺伝子が含まれている大腸菌 。ブループラークは、このように大幅に変異型得点のタスクを簡素化し、無色の背景に設定されています。 DNA配列決定技術は、変異誘発のメカニズムへのさらなる調査を助けることができるが発生した突然変異の位置及び種類を特定するために使用することができる。 我々は、この変異誘発アッセイのプロトコルに加えられた変更...

ほとんどの組織では、分化した細胞は、限られた寿命を持っている。機能的完全性を維持するために、長寿命の、組織特異的幹細胞は、連続的に順番に、その特定の組織の機能に必要な完全に分化した細胞を生じる前駆細胞を産生する。幹細胞は、自己複製と呼ばれるプロセスを通じて、自分の区画を補充する。このように、幹細胞は、彼らがそのためインチ常駐組織の機能的完全性を維持する責任があり、それは彼らが損傷を受けたDNAを検出し、潜在的に修復するために、堅牢なメカニズムが装備されていることが不可欠です。そうでなければ、彼らは彼らの子孫によって継承できる複数のゲノム（潜在的に有害な）摂動を、取得することができる。幹細胞は、生物の寿命の間に彼らのゲノムをセーフガードする方法を理解することは重要な問題であり、ゲノムの不安定性は、癌および（1,2に概説されている）他のいくつかの加齢に伴う疾患にリンクされている理由を私たちが理解するのに役立つことがあります。 3-6の直接DNA修復の特定のタイプを測定することが可能であることを実証した。なお、後者は低い忠実度および製造従ってリスク増加の修復プロセスであり、造血系において、例えば、二本鎖DNAの切断が相同組換え（HR）又は非相同末端結合（NHEJ）によって修復することができることが見出されたエラーが。両方が、造血幹細胞（HSC）4,5に利用されているが、マウスにおいて、早期前駆細胞がHR 4を利用し 、一方、それは造血幹細胞で主にNHEJであると思われる。同様の観察は、皮膚6中の幹細胞のために作られました。興味深いことに、ヒトHSC人事ではないNHEJにおいて、二本鎖切断3のための選択の修復機構であると思われる。 2種間のこの機能的な違いは本物であるか、単に技術的または実験の差を表しているかどうかは、見守らなければならない。 損傷を受けたDNAを修復する幹細胞のレパートリーは、例えば、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）およびミスマッチ修復（MMR）のような他のDNA修復機構を含む可能性がある。 MMR修正塩基塩基ミスマッチ、挿入/欠失ループながらBERとNERは、一本鎖DNAに、単一または複数の塩基対の病変を修復するための責任であり、DNA損傷のこれらのタイプは、NHEJまたはHRによって修復することができない。この概念をサポートすることは、HSCコンパートメント7-9に、これらの経路の1の変化と異常の間のリンクを示す造血系だけでなく、骨髄異形成症候群10月16日の発症リスクの増加に起因する疾患からのいくつかの研究であるHSCは、その疾患が進行するにつれて17ゲノム不安定性を増大と関連している。まだ今のように、造血幹細胞を直接、BER、NER、およびMMRの測定が報告されていない。 機構的レベルでの組織の完全性を制御する様々なプロセスを解明することに加えて、これらのプロセスのいずれかの収差の影響が遺伝子対正常に、例えば 、試験することができるように、突然変異したDNAの程度を測定することができることが不可欠である幹細胞を操作または若いに対する古い中。しかし、関連アッセイの開発が原因組織特異的幹細胞の不足および「幹細胞性」を維持し、培養条件の欠如のために困難である。さらに、そのようなアッセイは、環境や遺伝子操作に修正可能である必要があります。これらの制限および要件に可能な解決策は、具体的にはDNAの突然変異を検出するために設計されているマウスモデルの使用である。 MUL変異検出のためのTIPLEトランスジェニックマウスモデルが開発されている。例えば、トランスジェニックマウスのLacI 18 のLacI遺伝子はLacオペレーターのサプレッサーをコードする変異レポーターとして機能するLacIリレポーター系をコードする回復可能なλファージベクターを運ぶ。 LacIリ遺伝子の変異の際に、Lacオペレーターが活性化され、β-ガラクトシダーゼが生成される。それが青色に変わっβ-ガラクトシダーゼの発色性基質を切断するのX-gal（5 - ブロモ-4 - クロロ - 電子 - インドリル-β-D-ガラクトピラノシド）。 のLacIベクトルに隣接するCOSサイトはラムダファージタンパク質およびEのその後の感染により容易に回収することができ大腸菌 。感染したEをインキュベートした後大腸菌は、X-gal基質を含有するアガロースに、プラークをスコア付けすることができる。明確なプラークは非変異体を保有しながら、青斑は、推定される変異型ラック-I有するファージを含んでいる。目の中で青いプラークの周波数（電子明確なもの）は、DNAから抽出された元の細胞集団における突然変異頻度を示す。また、LacIリターゲットをホストするλファージは、容易に、比較的高いスループット分析のためのPCR技術を用いて配列決定することができる。複数の変異型のLacI遺伝子の配列を決定することは今度は特定のDNA修復経路で可能な欠陥または特定の遺伝毒性事象を指すことがあり、突然変異スペクトルに関する重要な情報を明らかにします。 のLacIトランスジェニックシステムは、複数の研究室19全体で標準化されており、試薬は、市販されている。 LacIリシステムの一つの主要な欠点は、大規模な欠失または再配列を検出する能力が限られているので、分裂中期スプレッド上の他の方法、 例えば 、多色FISHは、この欠陥を補完するために使用される必要がある。 LacIリマウスモデルのλファージベクターの中では、はるかに小さい遺伝子、CIIがあります、変異解析のために利用できる。そのサイズおよび変異体を選択することができるという事実は、このlacI遺伝子解析未満の労働集約的かつ安価なアッセイを20にする。しかしながら、lacI遺伝子は、より広範囲に突然変異誘発21に研究されており、発色基質22-25に関する表現型応答を生成するアミノ酸残基の明確な理解が存在するように突然変異遺伝子の感度はよく特徴付けられている。 変異検出のための他のマウスモデルがΦX174またはLacZを導入遺伝子の使用を含む。 T→G：オリジナルAとΦX174トランスジェニックマウスモデル、C復帰突然変異試験26又は塩基対置換のスペクトルの検出を可能に前進突然変異試験27は 、LacIリモデルより安価なシステムを表す。しかし、フォワードアッセイにおける突然変異画面は些細な突然変異の仕様ではありませんΦX174導入遺伝子のスペクトラムは、次のようにのLacIのものと十分に特徴づけされていません。 LacZを導入遺伝子を有するマウスモデルでは、LacZの突然変異レポーターを大腸菌を用いた回収され、ガラクトースおよびガラクトース28を含有する培地に対して感受性である大腸菌宿主細胞。このシステムの欠点は、LacZの対象の回復はまた、E.のライゲーションおよびエレクトロポレーションに続いて、制限エンドヌクレアーゼ消化を含むことであることが困難少数の細胞のためのシステムを適合すること大腸菌ホスト。多数の細胞が必要な場合には（ 例えば百万個以上）、（1、常により多くのマウスで始めることができます）幹細胞/前駆細胞集団を操作するための絶対条件ではありませんが、それはすぐに非現実的で費用対法外になります。また、LacZの比較的大きなサイズの、感受性突然変異レポーターを提供しつつ、DNA配列分析およびdetermために面倒でコストがかかる突然変異スペクトルの追うもの。このモデルの主な利点は、しかしながら、その大きな欠失および挿入を検出する能力、ならびに染色体再編成である。 LacIリ、ΦX174およびLacZトランスジェニックマウスモデル内のすべてのセルがレポーター系を運ぶので、これらのマウスモデルのいずれかは、それらが確実に採取することができるように、幹細胞および前駆細胞を含む、関心対象の任意の細胞型において突然変異誘発を測定するために使用することができる十分な数の。我々はのLacIマウスモデルとのLacI突然変異試験で豊富な経験を持っていたので、我々は造血幹細胞および前駆細胞集団内変異導入解析のための更なるこのシステムを追求することにしました。 造血組織は、リンの極めてまれな集団として同定可能であり、長期再増殖幹細胞を含むその個々の成分の細胞表面表現型の点でよく特徴付けられている- IL7R <suP&gt; - SCA-1 +するcKit + +（LSK）/ Flk2は- CD150 + CD48 -細胞29。 それは、DNA修復を研究になると、細胞はまだHSCのために良いの代表であり、最も原始的な骨髄球前駆細胞（CMP）の人口とは大きく異なる- Mohrin ら 4は LSK/Flk2のわずかに大きい人口があることを明らかにした。また、ときHSCに富むLSK（FLK-2 +およびFLK-2 - ） - IL7R -細胞が林と比較したSCA-1-するcKit + +（LS-K前駆細胞）は、有意差が残っていた純度の低い間NHEJ能力5、細胞に富むLSKの人口および前駆細胞を幹。この細胞数は極めて困難であり、我々は、少なくとも2×10 5個の細胞をこの変異誘発アッセイにおいて、一貫した信頼性のある結果を得るために必要であることを見つけたので、細胞-我々の研究ではHSCに富むLSK（のFlk-2 +およびFlk-2）を使用CD150 + CD48集団またはさえLSK/Flk2 - - （マウス、コストと実用性の点で）人口1はLSK/Flk2をソートする際に取得する。もともとはKohler らによって開発された一方に基づいて、このプロトコルは、 図18は、自発的なDNA突然変異頻度はLSK細胞および分化した骨髄細胞ならびに未分離の骨髄および脾臓細胞の規定された集団において決定することができる方法を詳細に記載している。

<table><tbody><tr><td>LacI トランスジェニックマウス&nbsp;</td><td>バイオリライアンス バイオ</td><td></td><td></td>リライアンス</tr><tr><td>RecoverEase DNA Isolation Kit、RNace-It リボヌクレアーゼカクテル</td>を含む <td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>720202</td><td></td></tr><tr><td>Transpack Packaging Extract、オレンジとブルーのトランスパックチューブ、SCS-8 E. coli</td><td>Agilent Technologies (Stratagene)</td><td>200221</td><td></td></tr><tr><td>DNA サイズスタンダードを含む &ndash; ラムダラダー</td><td>Bio Rad</td><td>170-3635</td><td></td></tr><tr><td>0.025 mM 細孔径メンブレン&nbsp;</td><td>フィッシャー(ミリポア)</td><td>VSWP 025 00</td><td></td></tr><tr><td>245 mm2 バイオアッセイディッシュ(トレイ)&nbsp;</td><td>フィッシャー(コーニング)</td><td>07-200-600</td><td></td></tr><tr><td>NZYブロス(粉末)</td><td>フィッシャー(テクノバ)</td><td>N1144</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィッシャー</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>アガロー</td><td>スフィッシャー</td><td>E-3120-500</td><td></td></tr><tr><td>N,N-ジメチルホルムアミド</td><td>フィッシャー</td><td>AC34843-5000</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>Research Products Intl Corp (RPI)</td><td>B71800-10.0</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>ロシュ</td><td>3-115-852</td><td></td></tr><tr><td>PCRエクステンダーTaqポリメラーゼキット</td><td>5 PRIME</td><td>2200500</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XPクリーンアップキット</td><td>ベックマン/コール</td><td>ターA63880</td><td></td></tr></tbody></table>

精製造血幹細胞/前駆細胞のdnaの変異を特定する

Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells

近年では、ゲノム不安定性がしっかり多くの発達障害、癌、および加齢に関連していることが明らかになった。幹細胞は生涯を通じて組織の恒常性および修復を確実にする責任があることを考えれば、幹細胞集団は、組織のゲノムの完全性を維持するために重要であると仮定することは妥当である。そのため、重要な関心は、幹細胞ベースの疾患の病因を理解することを目指し、幹細胞およびその子孫ゲノムの完全性に関する内因性および環境要因の影響を評価する際に生じている。 LacIリトランスジェニックマウスは、LacIリ遺伝子が変異レポーターとして機能するLacIリレポーター系をコードする回復可能なλファージベクターを運ぶ。変異したlacI遺伝子の結果は青に回し、切断する発色基質のβ-ガラクトシダーゼの製造である。 LacIリレポーター系は、iを搭載してnの全ての幹/前駆細胞を含む細胞、および容易に回収し、続いてE.を感染させるために使用することができる大腸菌 。感染したEをインキュベートした後正しい基質を含むアガロース上で大腸菌は 、プラークをスコアすることができ、明確なプラークが野生型を保有しながら、青いプラークは、変異型lacI遺伝子を示している。プラーク（クリア間の）青色の周波数は、DNAがより抽出された元の細胞集団における突然変異頻度を示す。変異型lacI遺伝子の配列を決定することは遺伝子の変異の位置および変異の種類が表示されます。 LacIリトランスジェニックマウスモデルは、in vivo変異導入アッセイとして十分に確立されている。また、アッセイのためのマウスおよび試薬は、市販されている。ここでは、このモデルを自発的に幹細胞富化林におけるDNA突然変異体を天然の周波数を測定するように構成することができる方法を詳細に説明する- IL7R -のSca-1 +するcKit + +（LSK）細胞および造血系の他の部分集団。

<html> in vivoでの変異誘発アッセイは、多くのイベント（すべてのPFU）の中で稀な事象（変異のPFU）を測定する。少数の細胞でアッセイを行うことにより、結果が大幅に正偽及び偽陰性の結果に影響されることが可能である。この問題に対処するために、我々は、3つの異なる動物から採取未分画骨髄細胞との連続希釈実験を行った。我々は、1.4×10 6、7.0×10 5を使用して、これらの動物の骨髄中の3.5×10 5の突然変異体頻度を測定したところ、1.75×10 5個の細胞。結果（ 図7）は、入力細胞数およびPFUの生成された数の間の直線関係を示している。重要なのは、変異頻度は、細胞の低または高の数字を用いて測定するかどうか、一貫性があります。直接（原因細胞の少なさに）テストされていないが、これはのLSKとGMPはの場合ではないと信じる理由はありません。 T &quot;&gt;この変異導入アッセイにおいて最も重要なステップは、ゲノムDNA（ステップ2）の単離である。DNA濃度は、理想的には500 ngの/μlの≥...

ここでは、LacIリトランスジェニックマウスモデルを用いて精製した造血細胞の数が少ないため、生体内突然変異誘発アッセイを説明します。 lacI遺伝子は、DNA突然変異の頻度、場所、タイプ、自然に生じまたは遺伝毒性物質への曝露後を決定するために単離することができる。

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

In recent years, it has become apparent that genomic instability is tightly related to many developmental disorders, cancers, and aging. Given that stem ...

identifying-dna-mutations-purified-hematopoietic-stemprogenitor

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

細胞（CFC）アッセイをコロニー形成は、造血前駆細胞が半固形培地でコロニーを形成しているのin...

ヒト造血細胞のためのコロニー形成細胞（CFC）アッセイ

フローサイトメトリーにおける骨髄造血前駆細胞の分布と同様に効率的に分離するために高度に精製された造血幹細胞（HSC）を分析する方法が記載されている。アイソレーション·プロシージャは、本質的には、c-Kit...

マウス造血幹細胞およびリネージュコミット前駆細胞の表現型の解析と分離

このプロトコルは、細胞選別による幹細胞の事前精製なしに造血幹細胞/前駆細胞機能を研究するための競争力のあるマウス骨髄移植実験を設定するための段階的なガイドラインを提供します。...

競争力の移植は、造血幹細胞のフィットネスを評価します

ドナー由来細胞の定量は、赤血球の溶血患者の幹細胞移植後の生着を監視する必要です。流れフローサイトメトリーを用いた細胞の選別、コロニー形成アッセイと短いタンデム繰り返しは増殖を評価するために使用可能性がありますの後の分析と赤芽球のコンパートメントの前駆細胞の分化の組み合わせ。...

赤血球の溶血症に対する造血幹細胞移植後の残留ドナー赤芽球系前駆細胞の検出

識別し、並べ替え (MAC および FACS) 蛍光と磁気の組み合わせを使ってマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の 6 のサブセットを分離する方法を示します。このプロトコルは、体外培養の試金 (セルロースまたは液体文化)、養子の転送実験生体内RNA ・...

寡能性と系列拘束されたマウスの骨髄から骨髄前駆細胞の分離と同定

我々 は遺伝子組み換えの造血細胞の悪性の可能性を評価するために造血幹細胞移植 (造血幹細胞移植) の使用について説明します。造血幹細胞移植、マウス骨髄異形成症候群 (MDS) や白血病の新規治療法を評価するための大規模コホートの生成し同様、生体内で様々...

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細胞内の体性変異パターンは、以前の変異型暴露を反映し、発達系統の関係を明らかにすることができる。ここでは、個々の造血幹細胞および前駆細胞における体細胞変異をカタログ化および分析する方法論を示す。...

ヒト血液の突然変異負荷とクローン組成の特徴付け

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

ここでは、細胞分裂の数、表面細胞の表現型、および細胞の親族関係を同時に測定できるフローサイトメトリーベースの技術を紹介します。これらのプロパティは、順列ベースのフレームワークを使用して統計的にテストできます。...

フローサイトメトリー による 造血幹細胞と前駆細胞の血縁関係、分裂数、表現型の同時評価

ここでは、CRISPR/Cas9技術とCell Counting...

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

学ぶLacIトランスジェニックマウスモデルを用いた造血幹細胞/前駆細胞のin vivo変異原性アッセイ。この手法により、自発的および変異原暴露後のDNA変異頻度、位置、タイプを特定し、遺伝的安定性と変異機構の理解を深める。

精製造血幹細胞/前駆細胞のDNAの変異を特定する

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