Name: 分取薄層クロマトグラフィーおよびMALDI-TOF質量分析によってバット外皮脂質中トリアシルグリセリドの内容をプロファイリング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶ コウモリの皮脂腺分泌物からトリアシルグリセリドを分離・同定する方法。薄層クロマトグラフィーとMALDI-TOF質量分析を用いて脂質プロファイルを解析し、化学シグナルとして機能する可能性のある脂質を特定します。

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支援は実験室的方法の開発中にスコットトリース、Katelyn Arter、ジェレミーRagsdell、トニーLaMarkジェームズ、エイミー·フィッシャー、ハンナ·ブレア、そしてシャイアンジェルドによって提供された。 TLCスキャニングデンシトメトリーの支援のために、我々はメディナ·フエルテ研究所（アーカンソー州バイオサイエンス研究所·ルイス·H·NOPO-オラサバル）に感謝したいと思います。アーカンソー州バイオサイエンス研究所アーカンソーASSETイニシアティブP3センター（EPS-0701890）：MALDI-TOF MSは、NSF EPSCoR、RIIを通して提供されたこのプロジェクトのために使用される。資金は米国漁業野生生物局/アーカンソー州野生生物グラント、国立洞窟学会、インディアナ州立大学の北米コウモリ調査と保護のためのセンターによって提供された。

注意：事前に、取り扱いの輸送、およびコウモリを格納するためのすべての必要な州および連邦許可を得る。承認はまたあなたの制度的動物管理使用委員会から、だけでなく、あなたの機関バイオセーフティ委員会から取得する必要があります。ライブコウモリ（または神経系組織）が処理される場合には、動物のハンドラが狂犬病のためにワクチンを接種する必要があります。現在の研究で使用したバットは、標準的な方法（アーカンソー州立大学の機関バイオセーフティ委員会の承認＃135349から1）28によると、2010年夏の間に、AR、オザーク聖フランシスコの国有林から採取した。 1。組織の治療と脂質の抽出<ol><li>前と異なる個体からの組織採取の間でメタノールですべての楽器をクリーニングします。 125ミリリットルの三角フラスコにハサミと場所で皮膚から毛（約1.0グラム）をトリム。クロロホルムで湿ら6コットンボール - 4で皮膚を洗浄することにより、翼面からのサンプル皮脂：メタノール溶媒（C：M 3:2 V / V）であり、別のフラスコで、これらを配置。 </li><li> C 10mlの組織を抽出する：M（2:1 v / v）の29の酸化を防止するために、0.5％のブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）を含有する。唯一のHPLC品質の溶剤を使用しています。 </li><li> 2時間後、手短に混合し、各フラスコに約0.5gの無水硫酸を追加し、濾紙で濾過することにより溶媒を集める。 </li><li>繰り返して二度1.2と1.3を繰り返します。 M.：一度と1:1のC：午前1時02分、CとMと順次プールは一緒ろ。 </li><li> 、N 2気流下でプールされたろ液を蒸発乾燥重量を決定し、3時02分、C中の脂質残留溶解：10 mg / mlの濃度まで（0.5％BHTで）男。 -20℃でのガラスバイアル中Storeサンプルこれは、サンプル採取後1カ月以内にサンプルを分析し、凍結融解サイクルを最小限にすることが最善である。 </li></ol> 2。分取薄層クロマトグラフィーによる脂質の分離<ol><li>溶剤洗浄1.5ミリリットルmicroceを事前に準備します、男をアセトンでリンスし、そして空気乾燥：3時02分、Cで充填することによりntrifugeチューブ。これは、後で質量分析を妨害し得る可塑剤を除去するために行われる。無塵容器にサンプルチューブを保存し、皮脂からの汚染を防ぐために、唯一の手袋でこれらのチューブを処理します。 </li><li> M.：最初の3時02分、Cでそれを事前に開発することによって、TLCプレートをアクティブ、1cmの深さに、TLC室に十分な溶媒を添加して（ガラス蓋と密接）チャンバー内にプレートを置き、溶媒をプレートの上部まで完全に実行できます。これは、約45分かかります。 </li><li> 120℃で少なくとも10分間オーブンに置いた後、溶媒が蒸発（約15分）まで、ドラフト内でプレートを取り外し、ドライサンプルが適用される場合の向きを維持するために、プレートの上部にある鉛筆のマークを配置。サンプルおよび標準が配置されるベースラインをマークするために、1.5センチメートルプレートの下端から、まっすぐに鉛筆のラインを配置します。 </li><li>切断したTLC室を準備2短い壁を裏打ちするのに十分な大きさと1の長い壁濾紙。チャンバー内にフィルターペーパーライナーを配置します。溶媒がチャンバに追加されたときにそれは完全にウェットであろう。 </li><li>ヘキサンである、移動相溶媒100mlを準備：ジエチルエーテル：酢酸（H：E：; 80:20:2 V / V / V）。約1cmの深さを与えるためにチャンバ内に溶媒を注ぐ。チャンバの上部縁に沿ってシリコーングリースシールを用いて、ガラス蓋で覆う。チャンバーは使用前に一晩平衡することができます。 </li><li>他のエッジから1.5 cmの1端から約1.5cmからの連続ストリークとしてキャピラリーチューブやピペットを用いて調製したプレートに手動でサンプルを適用します。それは、より均質な連勝でサンプルをロードしますので、自動化されたサンプルアプリが好ましい。 （;既成の混合物が得られる10 mg / mlの時使用）ステロール、FFAは、タグ、およびステロールエステル基準の約20μlの混合物を見つけるために、TLCプレートの外側のレーンを使用してください。 </li><li>にロードされたTLCプレートを配置ふたとの緊密な平衡化チャンバー、および溶媒は、トップエッジに実行されるまで、プレートを開発しています。これは、ここで説明した移動相を用いて約45分かかります。チャンバーからプレートを取り外し、過剰な溶媒が、約1分間ヒュームフード内のプレートから蒸発させる。 </li><li> 95％エタノール中0.05％ローダミン6Gで噴霧する。長波長紫外線ランプの下で脂質バンドを可視化。鉛筆のマークのサンプルおよび標準に分解蛍光バンドのR fは位置 。写真記録は、この時点で取り出すことができる。 </li><li>タグ規格に対応する帯域を特定し、グラシン紙の重さの大片にへらでシリカを掻き落とし、プレートから取り外します。 1.5ミリリットルの溶媒洗浄マイクロ遠心チューブにシリカを転送します。 </li><li> 3時02℃の1.0ミリリットルを追加するには：m溶剤サンプルチューブに、1分間の超音波処理は、遠心分離によりシリカをペレットしてから、新しい予め秤量したチューブに溶剤を移す。繰り返し目E前のステップでは、ろ液をプールし、そして、N 2気流下で溶媒を蒸発させる。 </li><li>追加の組織サンプルをTLCで分離されながら、4℃、暗所でのN 2の下のタグを含む乾燥した残留物を保管してください。ローダミン6Gは、試料中に存在するが、それはヘキサンに不溶性であり、直ちにMS分析の前に試料溶解の間に除去される。 </li></ol> 3。 MALDI-TOF MSによって分析TAG <ol><li> 1ml中10mgのCHCA溶媒（49.5％エタノール、49.5％アセトニトリル、および1％の水性0.1％TFA）を溶解することにより、新鮮なα-シアノ-4 - ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）マトリックス溶液を調製する。 </li><li> 10ピコモル/μLを得るために、0.1％トリフルオロ酢酸（TFA）の39.5μLとACTH（1 mg / ml）を1μLを混合することにより、測定器の分解能と感度のテストのために、adrenocarticotropicホルモン（18-39クリップ、2465.1989ダACTH）を準備ストック溶液。これは、将来の使用のために-20°Cで保存することができる。 </li><li>新しい作業のACTH solutをを準備します、10ピコモル/μLストック溶液1μLを取って9μlの0.1％のTFAと混合した後、500 fmolのを得るために、CHCAマトリックス溶液10μl（1:1）で混合することにより、イオン（1ピコモル/μL）/ μL濃度。 </li><li> 3時02分Cでは10 mg / mlのあるタグ標準を準備し、MALDI機器のキャリブレーションのためのM（ 例えばトリカプリン[470.361ダ]、トリカプリリン[554.455ダ]、[638.549ダ]をトリラウリン[722.642ダ]をトリパルミチン、[800.689ダ]をトリパルミトレイン、、[806.736ダ]をトリミリスチン[884.783ダ]、トリ-11-eicosenoin [968.877ダ]トリオレイン、そしてtrierucin [1052.971ダ]）。 </li><li>外部ロックマスキャリブタグ規格のM：3時02分Cでは10 mg / mlのでトリオレイン用意しております。 </li><li> 10 mg / mlの溶液に、ヘキサンに記憶されているタグのサンプルを溶解する。 </li><li> 0.5 M（77.06 mg/1.0 ml）を試料と標準マトリックスとして使用するために90％のメタノールで、2,5 - ジヒドロキシ安息香酸（DHB）のストック溶液を準備します。また、NaOHを1.0 M（2.0 g/50.0）溶液を準備します。アルミFOIを使用DHB溶液でチューブをカバー<html>光から保護するために、L。 </li><li>ミックス（予備洗浄チューブ内）10.0μLDHBマトリックス、10.0μlのサンプルまたは標準、および5.0μlの1.0 M NaOHで。混合し、簡単に底に混合物を持って来るために、チューブを遠心する。 </li><li>乾燥するまでデシケーター中で、MALDIステンレス製ターゲットプレートと場所の上の標準、サンプル、またはACTHの1.0μLを発見。データ収集のための機器にターゲットプレートを置きます。 </li><li>実行MALDI-TOF MSは、ポジティブリフレクトロンモードで分析する。チューン、ACTHおよびTAG標準溶液を使用して、測定器の製造業者によって記載されているように測定器を校正。 </li><li>ターゲットプレート上にスポットし、各サンプルについてのスペクトルを取得する（機器の仕様と一致して、この作業のためのパラメータは、5 Hzのレーザー発射速度、平均スペクトルを得るために、スポット当たり約100ショットであった）。 MALDIスペクトルからバックグラウンドを滑らかにし、引いた後、プロセス·イオンピーク手動でオンライン検索エンジンを有する脂質MAPS（/ツール/ MS / glycerolipids_batch &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt; www.lipidmaps.org /ツール/ MS / glycerolipids_batch）。 </li><li>前駆体イオンと強度ボックスのリストにリストスペクトルをコピーして貼り付けます。所望のアシル組成に検索を制限します。各試料のスペクトル中に存在するイオンの質量/電荷（m / z）の比でタグを識別します。脂肪酸メチルエステル（FAME）の百分率は別個のGC / MS分析からの利用可能な場合、本TAGの確率を得るためにこれらのデータを追加する。 </li></ol> INSTRUMENT：この研究で使用される質量分析計は（337nmで20 HzのN 2レーザーを備えた）ウォーターズMALDIマイクロMXである。ポジティブリフレクトロンモード能力を有する任意の製造業者のMALDI器具を使用することができる。使用される一般的な設定は、パルス電圧、2,000 Vである;リフレクト、5200 V、ソース、15,000 V（4.0 VER.）のMassLynxソフトウェアを使用してデータ収集を。これらの動作条件は、12000よりも大きな質量分解能を提供します。

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</ol>

著者らは、競合する経済的利益を宣言していません。

本論文では、脂質分子の時間のかかる誘導体化せずに、分取TLCで、哺乳動物の外皮から分離され、幅広い脂質クラスに分離し、MALDI-TOF MSによりタグプロフィールを決定するためのシンプルかつ堅牢な方法を提示します。 MALDI-TOF MSとTAGの品質スペクトルを製造する際の重要なステップは次のとおりです。最小限の汚染や酸化を有する化合物の1）が成功抽出、クロマトグラフィーによる2）十分な分離と分離、およびMALDI-TOFによって3）高分解能と質量精度をMS。 本論文では、タグのMSプロファイルを得るために、東部の赤バットのplagiopatagiumからの中性脂質画分を抽出して分離する方法を示しています。本研究は、（哺乳：翼手）コウモリの種を使用しながら、これらの方法では、任意の哺乳動物種の外皮脂質を研究するように拡張することができます。バット外皮はタグ、FFAは、squaより少ない量で、主にコレステロールであることを特徴とするナフタレン、およびステロール/ワックスエステル。 （ -ヒトでの7％が、26 - 1打席中62％）コレステロールは、より大きな割合で発生している間コウモリにおける皮脂脂質比は、そのスクアレンでヒトと異なることは、（ヒトでは最大16％とは対照的に）低量で存在している22 、31。比最大28％が東部赤いコウモリの髪で発見されている間、人間の毛は、約3％のタグが含まれている。コウモリからの脂質のサンプルの抽​​出は、他の種についても同様である。この研究において溶媒に浸した綿ボール皮脂を除去するために使用されるが、一方はまた、複数回の外皮表面上に溶剤を含有する試料バイアルまたはチューブを反転させることができる。特殊なテープ製品は、表面32脂質を抽出するための代替手段を提供する。適切な脂質抽出の重要な部分は、皮膚の油から汚染を最小にすることである。これは、簡単にすべてのサンプルと検査用手袋を身に着けている間にティッシュで食器を拭く、メタノールでスクイーズボトルを維持し、すべてのガラス器具や調理器具を噴霧することによって達成される。酸化Ofはポリ不飽和​​アシルBHTの添加によって抑制され、それは温度によらずにサンプルが格納されているのに使用されるべきである。 生体分子分析は、通常、汚染物から目的の分子を分離するためのクロマトグラフィー工程を必要とする。 TLCは、気体又は液体クロマトグラフィー用計装の必要を回避し、堅牢で再現性のある結果を達成するために、より少ない技術的な経験を必要とし、この方法で使用される。関心対象の脂質クラスに依存して、多くの異なる移動相を組み込むことができる。さらに、HPTLCプレートおよび走査デンシトメトリーを使用すると、定量的な結果を達成するために使用することができる。 TLC法のバリエーションがここにリストするには余りにも多数であるが、脂質のTLCで使用されるいくつかの一般的な移動相はクロロホルムのものがあります。非極性脂質28の分離のためのエチルエーテル：メタノール：リン脂質や糖脂質やイソオクタンを分離するための水を。他の脂質クラスからタグを分離するという点で、H、E：そうlventシステムは一貫して動作し、同等の結果を提供します。 TLCを使用する別の利点は、関心対象のバンドが急速に検体の前に誘導体化することなく、MALDI-TOF MSを用いてプロファイリングすることができることである。この研究では、シリカTLCプレートから除去し、分析物は溶離溶媒の吸着剤および蒸発を分離するための遠心分離およびその後の溶媒中での超音波処理によって、そこから溶出する。あるいは、マトリックスは、検体バンドTLCプレート上で分離し、次いで、直接MALDI-TOF MSにより分析33上に直接適用することができる。 MALDI-TOF MSによる成功プロファイリングは、十分なサンプル調製およびチューニングや測定器の校正を実行した作業者の熟練度に依存していません。器具は、目的の分子のための適切な分子量範囲をカバーする標準で毎日較正されるべきである。機器の適切な感度と分解能（ 例えば ≥万）もconfirmeする必要がありますACTHを毎日Dは哺乳動物の外皮の表面上に見られる皮脂脂質成分は、真菌/細菌性病原体によるコロニー形成において役割を果たし得る。したがって種と個体間の化学組成についての知識は、人間と野生動物の疾病の過程についての手がかりを提供することがあります。病気にかかったと健常者の間で種内の差異は、疾患の検出および診断の補助という臨床徴候を表すことができる。微生物の増殖を阻害する特定の化合物が存在する場合にはさらに、これらは、疾患の治療および予防における使用のために識別されてもよい。

哺乳類の外皮組織は、表皮、ケラチン構造（ 例えば 、髪と爪）、および外分泌腺があります。皮脂型の外分泌腺をまとめて毛嚢脂腺ユニット1と呼ばれる毛包に関連している。皮脂腺は、皮脂と呼ばれる皮膚表面に油性滲出液をリリース。皮脂はグリセロ脂質（ 例えばトリアシルグリセリ[タグ]）、遊離脂肪酸アシル（FFAは）、ステロール/ワックスエステル、およびスクアレンから概ね構成されています。皮脂の化学組成は種特異的である2。先天性免疫系の一部であると抗菌機能3を提供することに加えて、皮脂脂質は、皮膚4を介して蒸発水損失、細胞の完全性および遺伝子調節5、及び薬物吸収6を含む重要な生理的プロセスに影響を与える。皮脂の脂質組成物はまた、疾患マーカーとして役立つことができる。変更された比率と皮脂Bの量道路脂質クラスは、他の10の中で、尋常性ざ瘡7、フケ8、脂漏性皮膚炎8、皮脂欠乏9、などの疾患の臨床徴候である。表皮と髪の組織をステロールおよびその誘導体、タグ、FFAは、セラミド、リン脂質、およびその他のマイナーな脂質成分を含む変数のプロファイルが含まれています。外皮脂質は、疾患プロセスで機能することができるので、健康で病気にかかった個体間でTAGの化学組成の違いを決定することは、疾患の臨床診断に有用である可能性がある。 脂質は一般に非極性または非極性-極性置換基11のいずれかを有する水不溶性有機化合物であると定義される。脂質構造は、長い炭化水素鎖、（ワックスエステル、FFAは、アルコール、ケトン、およびアルデヒドを含む）、酸素化アルカン、又はコレステロールなど12などの複雑な環構造であってもよい。構造に基づいた脂質の8の主要なクラス（FFAは、glycerolipiがありますDS [GL]、グリセロリン脂質に応じて化学的特性の広い範囲を示す[GP]、スフィンゴ脂質[SP]、ステロール脂質[ST]、プレノール脂質[PR]、サッカロ[SL]、およびポリケチド[PK]）、クラス13。による脂質クラスの化学的性質に大きなばらつきのために、脂質分子の事前の誘導体化なしに直接プロファイリングが望まれている。脂質研究におけるOne出射方法は、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF MS）14と組み合わせた薄層クロマトグラフィー（TLC）である。 MALDI-TOF MSは、タンパク質を同定し、トリプシンにより消化されたタンパク質15から発生した高精度なペプチドイオンの質量「フィンガープリント」を、特定のアミノ酸配列にそれらを関連付けるためにプロテオミクス研究において広く使用されている。 MALDI-TOF MSはまた、16〜18のTAGなどの脂質を含む他の生体分子のクラスをプロファイリングするために使用することができる。 MALDIは、標準マトリックスの使用を必要とする芳香族および共役二重結合構造を含む有機化合物をICALLY。マトリックス分子を穏やかに、検体にレーザーのエネルギーを伝達プロトン移動を促進し、単一荷電気相イオン19-21を産生するのに役立つ。イオンは、高真空下で高電圧場に付し、続いてイオンをその質量電荷比に比例する速度の差により分離されているTOF質量分析器に加速される。たとえ非常に大きな生体分子を簡略化スペクトル分析のための単一荷電分子イオン種を生成する、小さな断片化してイオン化することができる。事前の誘導体化せずに直接脂質分子を分析する能力はlipidomic研究18において、MALDI-TOF MSの準備が導入を推進してきました。 本論文では、毛髪から外皮脂質を分離し、分析するためのルーチンの方法を提示し、皮脂の分泌物や東欧の赤バットのplagiopatagium（Lasiurus borealiS）。これは、ホワイト鼻症候群（WNS）22の疾患プロセスを解明するためにバット外皮脂質中の種間変動を決定するために使用される。 WNSは、コウモリの真菌性疾患であり、Geomycesは 23〜25を destructans新たに記載し好冷種によって引き起こされている。 WNSは500万北米の洞窟のコウモリの死を引き起こし、農業26,27に損傷を数十億ドルの潜在的な経済的影響と、脆弱なコウモリの種の絶滅を脅かしています。 Gの手順を調査するために、感染destructans、脂質は東部赤いコウモリの髪と翼組織から抽出し、MALDI-TOF MSによるその後の分析のためのTAG画分を単離するためにTLCで幅広い脂質クラスに分離した。 TAGは、短いアシル鎖を含有し、容易に小さなマトリクス干渉MALDI-TOF MSによって検出される。

<table><tbody><tr><td>ブチル化ヒドロキシトルエン</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>101162</td><td><a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">www.mpbio.com</a></td></tr><tr><td>TLC フレキシブル プレート</td><td>Whatman</td><td>4410-222</td><td><a href="http://www.whatman.com" target="_blank">www.whatman.com</a</td></tr><tr><td>>ACTH</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>A8346-5X1VL</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank">www.sigmaaldrich.com</a></td></tr><tr><td>Triolein</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>44895-U</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>TLC 脂質標準</td><td></td><td>TLC 18-1</td><td><a href="http://www.nu-chekprep.com" target="_blank">www.nu-chekprep.com</a></td></tr><tr><td>MALDI TAG Standard</td><td>Nu-Check Prep., Inc.</td><td>NIHコード53B</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>MALDI TAG スタンダード</td><td>Sigma-Aldrich Chem. Co.</td><td>17810-1AMP-S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>テフロンキャップ付きガラスバイアル</td><td>U.S. National Scientific Co.</td><td>B7800-2</td><td><a href="http://www.nationalscientific.com/" target="_blank">www.nationalscientific.com/</a></td></tr><tr><td>DHB</td><td>シグマ・アルドリッチ・ケム・コーポレーション</td><td>50862-1G-F</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CHCA</td><td>シグマ・アルドリッチ・ケム・カンパニー</td><td>C8982-10X10 mg</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>セブタペ</td><td>CuDerm</td><td>S100</td><td>&nbsp;</td></tr></tbody></table>

分取薄層クロマトグラフィーおよびmaldi-tof質量分析によってバット外皮脂質中トリアシルグリセリドの内容をプロファイリング

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

哺乳類の外皮は、皮膚表面に油状物質を分泌する皮脂腺が含まれています。皮脂産生は、病原性微生物に対する防御的で、自然免疫系の一部である。異常な皮脂生成および化学組成はまた、特定の皮膚疾患の臨床症状である。皮脂は種特異的であるトリアシルグリセリを含む脂質の複雑な混合物が含まれています。多様な脂質クラスが示す広範な化学的性質は、皮脂組成物の具体的な決定を妨げる。脂質の分析技術は、一般的に労働集約的であり、サンプル調製のコストを増加させ、化学誘導体化を必要とする。本稿では、薄層クロマトグラフィーにより哺乳動物外皮、別個の広い脂質クラスの脂質を抽出し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析法を用いてトリアシルグリセリドコンテンツをプロファイルする方法について説明します。この強力な方法は、直接判定することができる種および個体間のトリアシルグリセリドプロファイルの、そしてそれは容易に哺乳類の任意の分類群にも適用することができる。

フォルチ30によって記載された組織から全脂質を単離するための抽出方法は、ここに適合されている簡単な手順である。組織の抽出、溶媒を蒸発させた後、脂質は、多くの場合、黄色がかったフィルムとして表示されます。黄色が最も可能性の高い液 - 液抽出を行うことによって除去することができるタンパク質混入からである。分取TLCは、このような汚染物質からのTAG画分を分離するため、この追加のサンプル処理は、この手順で必要とされない。すべてのフィルタリング段階で新鮮無水硫酸ナトリウムの添加は、正確な脂質重量の決定に影響を与える水の汚染を減らすことができます。 哺乳類の外皮脂質は、Hで分取TLCで分析します。E：移動相としてAは通常、ステロール、FFAは、タグ、およびステロールエステル/ワックスエステル/スクアレン（ 図1）（原点から始まる）に対応した4つの異なるバンドを解決します。機会にanalytiを使用しているときCAL高性能（HP）、TLC、HとE：移動相、ステロールエステル、ロウ状エステル、およびスクアレンを分離し、3つの別々のバンドとして表示されます。本研究で使用した条件下では、ステロール/ワックス状エステルが分離されない。これらのバンドに関心がある場合、移動相がイソオクタンに切り替えることができる：エチルエーテル（95:5 v / v）で、およびHPTLCプレートは、デンシトメトリーを走査することによって分析することができる。その他の要因としては、分離不良を引き起こす可能性があります。これらは通常、一貫した品質TLC分離し、データを取得するために、チャンバ内に濾紙を配置蓋の上に密封するためのグリースを塗布し、一晩平衡化チャンバー、および清浄TLCチャンバを維持することによって除去される。 東部赤バットから単離されたTAGについて得られた代表的なMALDI-TOF質量スペクトルを図2および図3に示されている。非水生哺乳動物から単離さタグ用の典型的なものである910、 -これらのスペクトルは、m / z 850の間の質量範囲内のタグのイオンピークが含まれているS。 1.0 M NaOHの添加は、単独でH +イオンよりもより安定であるのNa +イオンを帯電促進する。安定性に加えて、H +及びK +イオンの不在は、スペクトル分析の容易さを増加させる。 のm / zが 850から910のイオンピークは午前16時、18時00分、18時01に対応し、18時02分のFA部分は、タグ内の支配的なアシル成分（ 表1）であること。 TAGの可能なFA部分は、最初に全イオンのm / z MALDI-TOF MSスペクトル中に存在し、そして推定される種および個体間の差によって決定することができる。アシルコンテンツの特定の比率が必要な場合は、その後、MS / MSまたはガスクロマトグラフィー（GC / MS）を使用しなければなりません。アシル比率の更なる情報は、スペクトルのジアシルグリセリド領域（ 図4）におけるピークを観察することによって推定することができる。ジアシルグリセリドは、MALDIソース内のタグの断片から生成され、そしてm / zの 590で見つけることができます- 650地域。 TAGの断片化を増加させることができる1.0 M NaOHで16の添加を省略する。東部赤バットウィング組織はのm / z 881.8（それぞれ図2および3）での支配的なピークのm / z 879.7、ヘア組織において支配的なピークによって特徴付けられる。 のm / z 907.8、879.7、および855.7でピーク（POP、pposは）は853.7幸福〜40％でピークとヘア組織であっても、強度（〜50％）で約ある。 <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="2in"> 合成 </td><td fo:width="1in"> 元素組成 </td><td fo:width="1in"> 観測質量 </td></tr><tr><td> のNa +のタグ </td><td></td><td> のNa +のタグ </td></tr><tr><td> SSO </td><td> C 57 H 108 O 6 </td><td> 911.8 </td></tr><tr><td> OOS、LSS </td><td> C 57 H 106 O 6 </td><td> 909.8 </td></tr><tr><td> OOO、LNSを、LSO </td><td> C 57 H104 O 6 </td><td> 907.8 </td></tr><tr><td> LOO、LLS </td><td> C 57 H 102 O 6 </td><td> 905.8 </td></tr><tr><td> LLO、OOLn </td><td> C 57 H 100 O 6 </td><td> 903.7 </td></tr><tr><td> LLL </td><td> C 57 H 98 O 6 </td><td> 901.7 </td></tr><tr><td> LLLn </td><td> C 57 H 96 O 6 </td><td> 899.7 </td></tr><tr><td> LLnLn </td><td> C 57 H 94 O 6 </td><td> 897.7 </td></tr><tr><td> LnLnLn </td><td> C 57 H 92 O 6 </td><td> 895.7 </td></tr><tr><td> OSP </td><td> C 55 H 104 O 6 </td><td> 883.8 </td></tr><tr><td> LSP、OOP、SOPO </td><td> C 55 H 102 O 6 </td><td> 881.8 </td></tr><tr><td> LOP、LNSP、LSPo </td><td> C 55 H 100 O 6 &lt;/ TD&gt; <td> 879.7 </td></tr><tr><td> LLP、LnOP、LOPo </td><td> C 55 H 98 O 6 </td><td> 877.7 </td></tr><tr><td> LnLP、LLPo、LnOPo </td><td> C 55 H 96 O 6 </td><td> 875.7 </td></tr><tr><td> LnLnP、LnLPo </td><td> C 55 H 94 O 6 </td><td> 873.7 </td></tr><tr><td> LnLnPo </td><td> C 55 H 92 O 6 </td><td> 871.7 </td></tr><tr><td> PPS </td><td> C 53 H 102 O 6 </td><td> 857.8 </td></tr><tr><td> POP、pposは</td><td> C 53 H 100 O 6 </td><td> 855.7 </td></tr><tr><td> OOM、PPL、PoPoS、ポポ</td><td> C 53 H 98 O 6 </td><td> 853.7 </td></tr><tr><td> PPLN、PPOL、PoPoO、明王</td><td> C 53 H 96 O 6 </td><td> 851.7 </td></tr><tr><td> LLM、LnOM </td><td> C 53 H 94 </sUB&gt; O 6 </td><td> 849.7 </td></tr><tr><td> PPP、SSLA </td><td> C 51 H 98 O 6 </td><td> 829.7 </td></tr><tr><td> PPPo、OSLA </td><td> C 51 H 96 O 6 </td><td> 827.7 </td></tr><tr><td> PPoPo、PMyO </td><td> C 51 H 94 O 6 </td><td> 825.7 </td></tr><tr><td> LnLnLa </td><td> C 51 H 86 O 6 </td><td> 817.6 </td></tr><tr><td> MMS、スラップ、PPM </td><td> C 49 H 94 O 6 </td><td> 801.7 </td></tr><tr><td> SLaPo、PPoM、PPMy </td><td> C 49 H 92 O 6 </td><td> 799.7 </td></tr><tr><td> PoPoM、OOCa </td><td> C 49 H 90 O 6 </td><td> 797.7 </td></tr><tr><td> MMP </td><td> C 47 H 90 O 6 </td><td> 773.7 </td></tr><tr><td> MMPo、OCAP </td><td> C 47 H 88 O6 </td><td> 771.7 </td></tr><tr><td> OCaPo </td><td> C 47 H 86 O 6 </td><td> 769.6 </td></tr><tr><td> MMM、PPCA、PMLA </td><td> C 45 H 86 O 6 </td><td> 745.6 </td></tr><tr><td> PoPCa、PoMLa </td><td> C 45 H 84 O 6 </td><td> 743.6 </td></tr><tr><td> PoPoCa </td><td> C 45 H 82 O 6 </td><td> 741.6 </td></tr><tr><td> LaLaP、MMLa、MCAP </td><td> C 43 H 82 O 6 </td><td> 717.6 </td></tr><tr><td> LaLaPo </td><td> C 43 H 80 O 6 </td><td> 715.6 </td></tr><tr><td> OO </td><td> C 39 H 72 O 5 </td><td> 643.5 </td></tr><tr><td> OL </td><td> C 39 H 70 O 5 </td><td> 641.5 </td></tr><tr><td> LL </td><td> C 39 H 68 O 5 </td><td> 639.5 </td></tr><tr><td> SP </td><td> C 37 H 72 O 5 </td><td> 619.5 </td></tr><tr><td> OP </td><td> C 37 H 70 O 5 </td><td> 617.5 </td></tr><tr><td> LPレコード</td><td> C 37 H 68 O 5 </td><td> 615.5 </td></tr></tbody></table> 表1。脂肪酸組成、元素組成、およびトリアシルグリセリドおよびジアシルグリセリドのナトリウム化付加物の同位体の質量。Lnは=リノレン酸（18:3）、L =リノール酸（18:2）、Oは=オレイン酸（18:1）、S =ステアリン酸（18時）、Pはパルミチン酸=（夜04時00）、Poは=パルミトレイン酸（16:1）、M =はミリスチン酸（14：00）、マイ=ミリストレイン酸（14時01分）ラ=ラウリン酸（12：00）、Caがカプリン酸（10:0）=。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig1.jpg" /> 図1。ヘキサンによる幅広い脂質クラス分離の薄層クロマトグラム：ジエチルエーテル：酢酸（80:20:2 V / V / V）を移動相として。ステロールとFFAとのバンドは、標準で識別されなかったが、脂肪族アルコールまたはワックスジエステル場合があります。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig2.jpg" /> 図2。ナトリウム付加タグ（ のm / z 700から950）のMALDI-TOF質量スペクトルの拡大Tag領域。東部の赤バット（L.のボレアリス ）翼組織から のm / z 853.7（OOM、PPL、PoPoS、POPO）とmで同定されたピーク/ Z 879.7（LOP、LNSP、LSPo）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig2large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig3.jpg" /> 図3。東部の赤バット（L.のボレアリス ）髪の組織から-ナトリウム化タグ（950 のm / z 700）のMALDI-TOF質量スペクトルの拡大Tag領域。ピークスは、m / z 905.8（LOO、LLS）とのm / z 907.8（OOO、LNSを、LSO）で特定された。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig3large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50757/50757fig4.jpg" /> 図4。ナトリウムイオン付加DAG断片た（m / z 530から730）のMALDI-TOF質量スペクトルのDAG領域。東部赤バット（L.のスズタケ ）翼組織から のm / z 643.5（OO）及びm / zは 615.5（LP）で同定ピーク。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50757/50757fig4large.jpg" target="_blank">大きな画像を見るにはここをクリックしてください</a> 。

哺乳類の外皮は、個々の種の特徴的な化学組成を提供することができ、溶媒抽出可能な脂質が含まれています。本稿では、薄層クロマトグラフィーを用いて外皮組織から単離さ広い脂質クラスを分離し、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析によりトリアシルグリセリドプロファイルを決定するためのルーチンの方法を提示する。

分取薄層クロマトグラフィーおよびMALDI-TOF質量分析によってバット外皮脂質中トリアシルグリセリドの内容をプロファイリング

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

この手順の全体的な目的は、コウモリの皮脂分泌物に含まれるトリグリセリド成分を単離し、特定することである。まず、汚染と酸化を最小限に抑える条件下で、外皮組織から表面脂質画分を抽出する。次に、薄層クロマトグラフィーにより脂質を分離し、トリグリセリド画分を得る。次に、機器ソフトを用いてスペクトルデータを処理し、オンラインの化学データベースで解析します。最終的に、分取薄層クロマトグラフィーおよびマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析を用いて、実験群と対照群の間でトリグリセリド組成プロファイルの違いを決定します。この手法は、宿主と病原体の相互作用において化学信号として機能する可能性のある分泌脂質の同定に役立てることができます。本手法は、ホワイトノーズ症候群の臨床症状を調査するために使用していますが、性的なシグナリングの検討や、乳組成における種間差の解明など、他の哺乳類系にも適用可能です。異なる個体から組織を採取する前および採取の間には、すべての器具をメタノールで洗浄してください。皮膚から約1gの被毛を刈り取り、125mLのエルレンマイヤーフラスコに入れます。翅の表面から皮脂をサンプリングします。脱脂綿をクロロホルム・メタノール溶媒で湿らせます。皮膚を擦り、これらを別々のフラスコに入れます。次に、酸化を防ぐために0.5% BHTを含むクロロホルム・メタノール10 millilitersを用いて組織を抽出し、約0.5 gramsの無水硫酸ナトリウムと共に2時間静置した後、ろ紙でろ過して溶媒を回収します。1:1および1:2のクロロホルム・メタノールを用いて順次抽出を繰り返します。その後、ろ液を合わせてプールし、窒素気流下で蒸発させます。乾燥重量を測定し、脂質残渣を10 mg/mLの濃度になるように溶解させます。後の質量分析への影響を防ぐため、可塑剤を除去して、サンプルをガラスバイアルに入れ-20 °Cで最大1か月間保存します。1.5 mLマイクロ遠心チューブにクロロホルム：メタノール（3:2）を満たします。その後、アセトンで洗浄し、風乾させます。サンプルチューブは防塵容器に保管し、皮膚の皮脂による汚染を防ぐため、これらのチューブは必ず手袋を着用して取り扱ってください。TLCプレートは、まずクロロホルム：メタノール＝3：2でプリデベロップメントを行い、活性化させます。TLCチャンバーに溶媒を1 cmの深さまで加えます。次に、プレートをチャンバーに入れ、溶媒がプレートの最上部まで完全に上昇するようにします。プレートを取り出し、ドラフトチャンバー内で溶媒が蒸発するまで乾燥させます。次に、プレートを120°Cで少なくとも10分間加熱します。次に、鉛筆でプレートの上部に印を付けます。サンプルと標準物質をスポットさせるベースラインを示すため、プレートの下端から1.5 cmの位置に鉛筆で直線を引きます。次に、TLCチャンバーの短辺2壁面と長辺1壁面を覆うのに十分な大きさのフィルターペーパーを切り出します。フィルターペーパーのライナーをチャンバー内に挿入します。調製したばかりの展開溶媒100 millilitersを、深さが約1 centimeterになるまでチャンバーに注ぎます。チャンバーの上端に沿ってシリコングリースでシールします。ガラス蓋で覆い、一晩平衡化させます。手動または自動サンプル塗布装置を用いて、連続的なストリーク状にサンプルを塗布します。TLCプレートの外側のレーンを用いて、標準物質の混合液を約20 µLスポットします。スポットしたTLCプレートを平衡化したチャンバーに入れます。蓋を閉め、溶媒が上端まで上昇するまで展開させます。約45分後、プレートを取り出し、ドラフトチャンバー内で余分な溶媒を蒸発させます。95% ethanolで調製した0.05% iodine six Gをスプレーします。その後、長波長紫外線ランプの下で脂質バンドを可視化し、鉛筆で印を付けます。サンプルおよび標準物質で分離された蛍光バンドのRf値をマークします。写真を撮影して記録します。次に、タグ標準に対応するバンドを特定します。それを大きなガラス板とホエイペーパーに転移させ、その後、溶媒で洗浄した1.5 milliliterのマイクロ遠心チューブに移します。サンプルにクロロホルム：メタノール（3:2）溶媒を1 mL加え、1分間超音波処理します。遠心分離によりシリカをペレット化し、溶媒をあらかじめ重量を測定した新しいチューブに移します。1 mLの抽出を繰り返し、ろ液を回収した後、窒素気流下で溶媒を蒸発させます。タグを含む乾燥残渣は、TLC Rho Domineを用いて追加の組織サンプルを分離させている間、窒素条件下、遮光、4 °Cで保存します。サンプル中にはSix Gが含まれていますが、これはヘキサンに不溶であるため、サンプルの溶解中に除去されます。MS分析の直前に、テキストプロトコルに従って500 fmol/µLのACTH作製溶液および10 mg/mLのタグ標準溶液を調製します。また、試料および標準物質のマトリックスとして使用するため、90%メタノールを用いて0.5 molarのDHBストック溶液を調製します。光から保護するため、チューブをアルミホイルで覆ってください。次に、10 microlitersのDHBマトリックス、10 microlitersの試料または標準物質、および5 microlitersの1 molar水酸化ナトリウム混合液を合わせ、チューブを短時間遠心分離して混合液を底面に集めます。1 µLの標準サンプルまたはA CTHをMALDIステンレス製ターゲットプレートに滴下し、デシケーターに入れて乾燥させます。その後、データ取得のためにターゲットプレートを装置にセットします。MALDI-TOF MS分析をポジティブリフレクションモードで実施します。機器メーカーの説明に従い、ACTHおよびタグ標準溶液を用いて装置のチューニングとキャリブレーションを行います。ターゲットプレート上にスポットした各サンプルのスペクトルを取得し、平滑化およびバックグラウンド除去を行います。Aldi Spectraプロセスでイオンピークを手動で処理し、オンライン検索エンジンLipid Mapsを用いて、スペクトルのリストを前駆イオンおよび強度ボックスにコピー＆ペーストします。検索範囲を目的のAAL組成に制限します。各サンプルのスペクトルに存在するイオンの質量電荷比からタグを同定します。別途GCMS分析により脂肪酸メチルエステルの割合が得られている場合は、これらのデータを加えてタグの確率を算出します。移動相にHEAを用いた分取TLCによる哺乳類の外皮脂質分析では、通常、ステロールエステル、遊離脂肪酸（FFA）、タグ、ステリルエステル、ワックスエステル（EE）、およびスクアレンに対応する4つの明確なバンドに分離されます。これらの質量スペクトルは、ヒガシアカコウモリから単離されたタグから得られたものです。非水棲哺乳類からの調製物に典型的です。スペクトルには、質量電荷比850から910の範囲にイオンピークが含まれています。脂肪酸部位が、AALの主要な構成成分およびタグとなっています。AAL比に関するさらなる情報は、タグの断片化を示すスペクトルのD AALグリセリド領域のピークを観察することで導き出すことができます。MALDIスペクトルには、主電荷比が炭素数に基づいている3つの明確なタグ領域が表示されます。アカキコウモリの翼組織は、主電荷比 8 53 0.7 8、79 0.7、および 907.8 のこれら3つの領域において支配的なピークを示すことが特徴です。生きたコウモリまたは安楽死させたコウモリを扱う際は、これらの動物の取り扱い、保管、および輸送に必要なすべての許可を得なければならないことに留意してください。また、所属機関の動物実験委員会およびバイオセーフティ委員会の承認を得る必要があります。生きたコウモリまたはコウモリの神経組織を取り扱う場合は、すべての作業者が狂犬病のワクチン接種を受けていなければならないことに注意してください。また、geo MiSiS antなどの特定のコウモリ病原体を扱う場合は、バイオセーフティーレベル2の研究室が必要です。

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マトリックス支援レーザー脱離/イオン化質量分析イメージングを用いた ショウジョウバエ 脳における迅速な脂質分析のためのサンプル調製

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このプロトコルは、フェノールレッドスレッドと液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS/MS)ベースのワークフローを用いてヒト涙液サンプルを採取し、涙液のリピドームプロファイルを発見するための独自の臨床プロトコルを説明しています。単純なメチルテル-ブチルエーテル(MTBE)/メタノール二相分離法により、涙のバイオマーカー発見に高い回収率で迅速な涙脂質抽出が可能となります。...

バイオマーカー発見における非標的涙液リピドミクスのためのフェノールレッドスレッドを用いたサンプリング手法

学ぶ コウモリの皮脂腺分泌物からトリアシルグリセリドを分離・同定する方法。薄層クロマトグラフィーとMALDI-TOF質量分析を用いて脂質プロファイルを解析し、化学シグナルとして機能する可能性のある脂質を特定します。

分取薄層クロマトグラフィーおよびMALDI-TOF質量分析によってバット外皮脂質中トリアシルグリセリドの内容をプロファイリング

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