Name: 虚血性細胞死経路を研究するための性層別ニューロン培養 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-09T19:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学ぶ性層別海馬ニューロン培養法。胚18日齢の雌雄を分離し、虚血性細胞死における性差シグナル伝達を研究。神経科学とジェンダー研究の両分野で重要な知見を提供する革新的な手法です。

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著者らは開示するものは何もない。

雄と雌の海馬を別々に解剖、解離、培養する性層別一次解離海馬ニューロン培養は、ニューロン細胞死における性特異的細胞シグナル伝達を調査するための有用なツールを提供します。神経科学者は一般的に初代ニューロン培養を使用しますが、プロトコルは特定の実験目的と関心に応じてラボによって異なります。多くの研究者は、混合培養で、または事前に確立された星状細胞層に吊り下げられたガラスカバースリップにニューロンをプレーティングすることによって、ニューロンとグリアを共培養することを選択します。アストロサイトは、培養中のニューロンの生存に有益な成長ホルモンを分泌すると考えられています。ただし、実験システムを簡素化するために、この研究で説明されているプロトコルは、グリアの影響を実質的に持たないニューロン培養をもたらします (グリア汚染が 10% 未満)。
プロトコルは、海馬が採取される胚の年齢に関しても研究室によって異なり、さらに言えば、プロトコルは脳のどの領域が採取されるかに関しても異なります。このプロトコルは、解剖に E18 胚を使用します。その他の一般的な年齢には、E15〜16が含まれます。E18胚は、...

哺乳類は性的に二形性で、オスとメスは異なる形質と特徴を示します。性差は脳にまで及び、損傷や病気に対するニューロンの感受性で明らかです(1-5でレビュー)。例えば、男性の脳は、脳卒中や心停止とそれに続く蘇生による虚血性ニューロン損傷にかかりやすい((6)の文献でレビュー)。パーキンソン病(7でレビュー)と統合失調症(8でレビュー)は、女性よりも人間の男性に多く見られますが、女性の人間の脳はアルツハイマー病(9でレビュー)やうつ病などの気分障害(10でレビュー)にかかりやすいようです。神経細胞の損傷や疾患に対する感受性には男女間で観察可能な違いがあるにもかかわらず、現在のほとんどの治療パラダイムは性別を考慮しておらず、男性と女性の両方で類似しています。性差が考慮され、理解されれば、より大きな成功が達成されるかもしれません。
イン・ビボの動物モデルは、ニューロンの損傷と疾患の性的な二型性を示しており、性差とそれらの違いがニューロンの生存と機能にどのように寄与するかについての理解を深めるために重要です。例えば、雄のげっ歯類は雌よりも虚血性神経細胞損傷にかかりやすいという証拠が示されています11-15。この違いは、テストステロン、主要な男性性ステロイドホルモン、およびエストロゲン、主要な女性性ステロイドホルモンの分子シグナル伝達に少なくとも部分的に依存していると考えられています。性腺切除された雄と雌のげっ歯類を用いた研究では、テストステロンとテストステロン代謝物であるジヒドロテストステロン(DHT)が悪化し、エストロゲンが脳虚血後の神経損傷を減少させることが明らかになっています12-14,16-18。しかし、脳虚血の性差は、新生児と成体の両方の動物に存在します19,20。新生児は、発育中に子宮内でエストロゲンやテストステロンが急増するが、出生後から思春期までのホルモンレベルは比較的低い((21)の文献でレビュー)。したがって、一次性ホルモンの有無は、性に影響されるニューロンの損傷に対する感受性の唯一の決定要因ではありません。実際、発生中に性的二型が確立され、ホルモンレベルが低い場合でも細胞シグナル伝達と虚血に対する応答に違いが生じる可能性があります。
性差が性ステロイドホルモンの存在によるものか、発生中に確立された二型によるものかに関わらず、さらなる研究により、脳内の男性と女性の間で細胞シグナル伝達に違いがあることが明らかになりつつあります。コロラド大学医学部のHerson研究室では、そのような違いを1つ特定しました。カルシウム、ナトリウム、カリウムの透過性イオンチャネルであるTRPM2(22,23でレビュー)は、in vivoでの虚血性傷害後のニューロン細胞死を雄では誘導するが、雌マウスでは誘導しないことを発見した24。TRPM2の薬理学的阻害または遺伝的ノックダウンは、脳卒中24のin vivo中頸動脈閉塞(MCAO)モデルにおいて、雄では保護的であるが、雌マウスでは保護されないことを実証します。
その有用性にもかかわらず、虚血性ニューロン損傷のin vivo動物モデルは、研究のためにニューロンを特異的に標的にすることが困難または不可能であるため、ニューロン死の分子研究に限定されることがあります。このため、私たちの研究室では、in vitroでの主要な解離皮質ニューロンまたは海馬ニューロンを使用して、in vivoの研究を補完しています。初代解離ニューロン培養は、ニューロンの損傷や疾患に関与する細胞シグナル伝達経路を調査するための有用なツールを提供します。培養中のニューロンは、グリア入力の有無にかかわらず、厳密に制御された環境で維持できます。グリアがない場合、培養で観察される応答はすべてニューロンです。薬理学的薬剤は、血液脳関門を越える吸収を心配することなく培養に投与することができ、特定のシグナル伝達経路の特定の成分の阻害または活性化を可能にします。分子生物学は、関心のあるさまざまなタンパク質を過剰発現またはノックダウンするために使用でき、個々の細胞に対して電気生理学的測定を行うことができますが、これはin vivoモデルシステムでは不可能なことです。
Herson Labは、最初に培養物の準備に使用された胚を性別化することにより、一次解離ニューロン培養の有用性を拡大します。男性と女性の性層別ニューロン培養は、男性のニューロンが女性のニューロンよりも酸素とグルコースの欠乏によるニューロン細胞死に対してより敏感であることを明確に示しています25。酸素とグルコースの欠乏は、虚血が脳への酸素とグルコースの利用可能性を減少させるため、ニューロン虚血の in vitro モデルとして受け入れられています。さらに、我々は、解離した性層別ニューロンにおける電気生理学的実験により、TRPM2が男性ニューロンでは活性化されるが、女性ニューロンでは活性化されないことを実証した24,26。現在、TRPM2活性の分子性特異的制御因子を調べています24,26。ここでは、性層別初代胚性解離海馬ニューロン培養を確立するためのプロトコルを共有し、この方法を使用して、DNA修復酵素であるPARP-1がTRPM2と同様に性特異的な方法で虚血性細胞死に寄与することを示唆する代表的なデータを提示します。PARP-1は、酸化ストレスによるDNA切断によって活性化されます(27,28でレビュー)。DNA損傷が最小限の場合、PARP-1活性は細胞の生存率を高めますが、損傷が過剰の場合、PARP-1活性の増加は細胞死を悪化させます。PARP-1は、TRPM2チャネル28-31の既知の活性化因子であるポリ-(ADP)リボースを産生し、いくつかの証拠は、PARP-1が酸化ストレスに応答して男性の脳で優先的に活性化されるが、女性の脳では活性化されないことを示唆している32,33。したがって、PARP-1は男性ではTRPM2を活性化するが、女性では活性化せず、酸素とグルコースの欠乏に応答してニューロン細胞死を誘導するという仮説を立てています。

<table><tbody><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Borax</td><td>Sigma</td><td>71997</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>シグマ</td><td>B6768</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Σ</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>HBSS、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>MEM、グルタミン、フェノールレッド</td><td>Invitrogen</td><td>51200-038</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎、グルタミン、フェノールレッド</td><td>Invitrogen</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン、MW 70,000-150,000</td><td>シグマ</td><td>P0899</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー 0.4%</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5/45 角度付き鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #7 &ndash;細かい湾曲した鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11274-20</td><td></td></tr><tr><td>鋸歯状(ロンドン)鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11080-02</td><td></td></tr><tr><td>エクストラファイングレーフ鉗子1 x 2歯</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11153-10</td><td></td></tr>モ<tr><td>リアスプリングはさみ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>中手術用ハサミ</td>ロ<td>ボズサージカル</td><td>RS-6812</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Microdisecting Scissors</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5880</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td>Fisher</td><td>87721</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer, 40 & micro;Mナイロンメッシュ</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>352340</td><td></td></tr></tbody></table>

虚血性細胞死経路を研究するための性層別ニューロン培養

Sex Stratified Neuronal Cultures to Study Ischemic Cell Death Pathways

虚血性損傷や神経変性疾患に対するニューロンの感受性における性差は長い間観察されてきましたが、それらの違いの原因となるシグナル伝達メカニズムは不明のままです。初代解離胚性ニューロン培養は、虚血または疾患の結果としての細胞死に関与するニューロン細胞シグナル伝達を調査するための簡略化された実験モデルを提供します。しかし、今日の研究で使われている神経細胞の培養物のほとんどは、男女混合です。研究者は、ニューロンの損傷や疾患のモデルで、男女混合のニューロン培養における性ステロイド治療の効果をテストすることができ、実際にテストしていますが、蓄積された証拠は、女性の脳が男性の脳とは異なる方法でアンドロゲン、エストロゲン、およびプロゲステロンに反応することを示唆しています。さらに、新生児のオスとメスのげっ歯類は虚血性損傷に対して異なる反応を示し、脳虚血後の損傷はメスよりもオスの方が大きくなります。したがって、男女混合のニューロン培養は、実験結果を不明瞭にし、混乱させる可能性があります。重要な情報が見落とされる可能性があります。このため、コロラド大学医学部のHerson研究室では、海馬と皮質の両方から性層別化された一次解離胚性ニューロン培養を定期的に準備しています。胚は脳組織の採取前に性別が決定され、男性と女性の組織は別々に解離され、別々に播種され、別々に維持されます。この方法を用いて、Herson研究室は、虚血性細胞死におけるイオンチャネルTRPM2の男性特異的な役割を実証しました。この原稿では、胚性マウスの性別決定と、性層別海馬の一次解離ニューロン培養の準備に関するプロトコルを共有し、議論します。この方法は、性層別皮質培養物を調製するために適応させることができ、胚性化の方法は、性が結果の重要な決定要因であると考えられる任意の研究のための他のプロトコルと組み合わせて使用することができる。

胚マウスの正確な性別判定は、性別層別化された一次神経細胞培養の準備における重要なステップです。正しく性別判定された仔マウスから、雄および雌の海馬を個別に培養することを確実にするため、胚を性別ごとに分け、皮質および海馬を採取しました。各胚の採取した組織から、性別を分けて管理することに注意しながら、標準的な手順に従ってゲノムDNAを単離しました。雄特異的遺伝子であるSRYおよび共通マーカーであるmyogenin (Myog) のプライマーを用いて、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) を行いました (Figure 1)。SRY（Y染色体上の性決定領域）は精巣形成に関与しており、一般的に性別マーカーとして使用されます。検証したすべての雄および雌の脳組織にMyogが存在し、SRY遺伝子は性別判定で「雄」と特定された胚組織にのみ存在し、「雌」と特定された組織には存在しないことが確認されました。
PJ34によるPARP1の薬理学的阻害は、雄の胚由来の一次海馬ニューロン培養における酸素・グルコース剥奪（OGD）に対して神経保護的に作用しますが、雌の胚から調製された培...

Primary disassociated embryonic 海馬ニューロン培養は、ニューロン死に関与するシグナル伝達メカニズムを調査するのに役立ちます。海馬の単離と解離の前に胚の性別を決定することで、男性と女性の別々の培養物を調製することができ、研究者は性別特異的な細胞シグナル伝達を同定し、調査することができます。

Sex differences in neuronal susceptibility to ischemic injury and neurodegenerative disease have long been observed, but the signaling mechanisms ...

本手順の全般的目的は、性別を分層化した海馬一次解離ニューロン培養系を調製することです。まず、胚齢18日の胚の性別判定と解剖を行い、性別を分層化した一次ニューロン培養用サンプルを得ます。次に、得られた神経組織から解離ニューロンを調製します。最終ステップは、ニューロンを適切な密度で播種し、実験に向けて培養することです。最終的に、本手法を他のプロトコルと併用することで、性が結果の重要な決定要因であると考えられるあらゆる研究に適用できます。本手法は、オスとメスのげっ歯類で神経虚血への反応に差があるかなど、ジェンダー研究分野における重要な疑問への回答に役立ちます。必要となるいくつかの準備の中で、組織培養プレートなど、再確認しておくべき項目がいくつかありました。まず、ポリD-リジンを0.1 mg/mLに希釈して準備します。次に、ラミナーフロー式組織培養フード内で、処理済みの滅菌マルチウェル組織培養プレートの各ウェルの底面を、希釈したポリD-リジンで十分に覆います。これらのプレートを37 °Cで一晩インキュベートします。次に、解剖エリア、カウンター、および顕微鏡を70%エタノールで十分に拭き上げてください。3番目に、大きな平皿に氷を入れ、オスとメスの頭部、脳、および海馬を分けて保持できるよう、十分な数の60 mm皿に冷たい解剖用溶液を満たします。また、2枚のより大きな100 mm培養皿に冷たい解剖用バッファーを満たします。4番目に、15 mLの滅菌チューブを2本準備します。チューブにオスとメスのラベルをそれぞれ貼り、適切な量の解剖用バッファーを加えます。E 18胚を回収する際は、子宮角および胚嚢から各胎仔を慎重に取り出すことが重要です。胎仔は非常に脆弱であるため、胚嚢を露出させるには、各胚の間の子宮組織を丁寧に切断してください。次に、小さく幅の狭い鋏の刃を用いて、表面の嚢を非常に注意深く切開します。その後、胚を傷つけないように、胚液と胚を切り口からそっと押し出します。仔マウスを解剖する際は、カーブピンセットを用いて掃引動作を繰り返し、腸と肝臓を非常に穏やかに頭側へ押しやってください。これにより、徐々に腎臓の膀胱、そして最も重要な内部生殖器が露出します。胎児の性を判定する際は、非常に脆弱な内部生殖器を傷つけないよう、慎重に解剖することが極めて重要です。オスの子ラットは、腎臓の直下に線条状の精巣があることで識別されます。精巣は腎臓の約3分の1から2分の1の大きさで、時折、膀胱のすぐ上にまで下がっていることがあります。雌は、精巣がないことで最も簡単に識別できます。また、膀胱の上にある小さな子宮と、腎臓に向かって伸びる卵管によっても識別可能です。高倍率で観察すると、卵巣は輸卵管の末端にある小さな暗色の器官として確認でき、脳を採取する際に腎臓の直下または時に腎臓の下側に位置していま

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

虚血性細胞死滅経路の研究のための性別に基づいたニューロン培養

このビデオは、鼻皮質-海馬の器官型スライスにおけるニューロン死を評価する手法を示しています。ニューロン死は、in...

ex vivoてんかんモデルにおける細胞死を評価するためのニューロン死アッセイ

このビデオは、細胞傷害性CD8+ T細胞を介して脳細胞死を誘発するex vivo技術を示しています。脳スライスを取得すると、活性化されたオリゴデンドロサイト指向性CD8+...

オリゴデンドロサイト特異的CD8+ T細胞を介して神経細胞死を誘導するex vivo技術

全身性低血圧と相まって、二国間の頸動脈閉塞は再現重症度と海馬への損傷、その結果、ラットの全脳虚血を生成します。動物の被験者は脳損傷の予測可能なパターンで損なわれて、彼らは便宜上回復し、死亡率は比較的低いです。...

2血管閉塞/低血圧：グローバル脳虚血のラットモデル

我々は、興奮毒性媒介性脳損傷に関与する分子メカニズムを調べるために使用できる脳切片モデルを開発した。この技術は、生存可能な成熟した脳組織を生成し、部分的に無傷の神経回路、細胞間相互作用、およびシナプス後区画を維持しながら、実験に必要な動物の数を減少させる。...

脳Microslicesの興奮毒性刺激<em&gt;インビトロ</em&gt;脳卒中のモデル

この研究は、WT新生児マウスからのニューロンの単離のための技術を提示する。新生仔マウスから脊髄を注意深く切開し、続いて脊髄組織からニューロンを機械的および酵素的に切断することが必要である。...

新生児マウスからの脊髄ニューロンの単離と培養

このプロトコルを記述する簡易分離し培養 6 7 日古い子犬、CGNs の損失のための効率的な伝達と機能の研究、益からプライマリ マウス脳顆粒ニューロン (CGNs) と nmda 刺激による神経毒性、モデリング法低カリウムによって誘導される細胞死、DNA...

神経細胞死とマウス プライマリ小脳顆粒ニューロンの変性をモデリング

成人の人間の脳から自由に浮遊するスライス培養を準備するプロトコルが提示される。このプロトコルは、膜挿入物を用いた広く用いられているスライス培養法のバリエーションである。これは、シンプルで費用対効果が高く、年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨されます。...

成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

オルガノイトスライス培養は、神経発達または変性/再生プロセスを研究するための強力なツールです。ここでは、マウス小脳スライス培養におけるプルキンエ細胞の神経発達死をモデル化するプロトコルについて説明する。この方法は、神経保護創薬の研究に役立つ可能性があります。.

オルガ鼻記小脳スライス培養におけるプルキンジェ細胞生存

ここでは、高収率と再現性を持つ、胚性皮質由来のニューロンおよびアストロサイトエンリッチ培養、またはニューロングリア培養を確立できる特定の培養培地を用いた簡単なアプローチを提示する。...

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

皮質における臨界​​状態のダイナミクスを示す神経雪崩、すなわちスケール不変時空間アクティビティのバーストを、勉強するための確実な方法。雪崩は、正確に制御された条件下で平面統合マルチ電極アレイ（MEA）との活動の長期的な測定を可能にする培養皮質の浅層の開発に自発的に出現する。...

器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

学ぶ性層別海馬ニューロン培養法。胚18日齢の雌雄を分離し、虚血性細胞死における性差シグナル伝達を研究。神経科学とジェンダー研究の両分野で重要な知見を提供する革新的な手法です。

虚血性細胞死経路を研究するための性層別ニューロン培養

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