離とナイーブCD4 Tリンパ球のTh17分化

この手順の全体的な目標は、TH 17 細胞をナイーブな CD 4 陽性 T リンパ球から分化することです。これは、最初に成体のC 57ブラックシックスマウスからリンパ節と脾臓を採取することによって達成されます。第2のステップでは、組織を粉砕して単一細胞懸濁液を得る。

次いで、CDの4つの陽性CD25陰性T細胞を単離し、TH17誘導または活性化制御条件下で培養する。最終的には、Q-P-C-R-E-I-S-Aおよびフローサイトメトリーを使用してIL 17 Aの発現を評価できます。したがって、この方法は、C 57ブラックシックスマウスにおけるCD4Tリンパ球のT8 17細胞への分化に関する洞察を提供することができます。

また、他のマウスモデルにも適用できます。リンパ節は非常に小さく、解剖手順が困難であるため、この方法のデモンストレーションは重要です。この方法を直接視覚化することなく、細胞を追加する少なくとも4時間前に、滅菌PBSで希釈された30マイクロリットルの抗CD3で新しい96ウェルUBOマイクロテスト組織培養プレートのウェルをコーティングし、プレートの側面をタップしてウェルの均一なカバレッジを確保し、4時間後にプレートを摂氏37度でインキュベートします。 セルを追加する時が来るまでプレートを冷蔵します。

頸部脱臼による死亡を確認した後、成体C 57ブラックシックスマウスの切開部を70%エタノールで滅菌します。次に、尿道口の前方の皮膚をつかみ、腹側正中線からあごの部分まで、腹膜を乱さないように注意しながら切り込みます。次に、皮膚をピンで固定して、リンパ節と脾臓にアクセスできるようにします。

次に、胸筋の後ろのマウスの腋窩近くにある腋窩リンパ節を切除し、組織を5ミリリットルのAutoMaxランニングバッファーを含むシャーレに入れます。次に、各腋窩の近くの結合組織にある上腕リンパ節を切除します。次に、動物の首にある気管に隣接する表在性頸部リンパ節を切除し、次に3つの血管の接合部にある股関節領域にある鼠径リンパ節を切除します。

腸間膜リンパ節にアクセスするには、まず腹膜内層を通る腹側正中線を切り取ります。腸間膜リンパ節は、マウスの腸間膜の奥深くに位置し、通常は真珠の首飾りのように見える可能性のある4〜8個の節の列にあります。脾臓を引っ張って膵臓から取り外します。

次に、リンパ節のあるペトリ皿に入れて臓器を挽きます。1つの顕微鏡スライドのつや消し面にリンパ節を配置し、次に2つ目のスライドのつや消し面で組織をこすります。粉砕された臓器を単一細胞懸濁液にろ過するには、まず、約3インチ×3インチの40ミクロンのナイロン材料を数回折り、15ミリリットルの遠心分離チューブの上部に置きます。

21ゲージの針を備えた5ミリリットルの注射器を使用して細胞とバッファーを吸引し、折りたたまれたナイロンに細胞溶液をゆっくりと分注します。針で材料に穴を開けないように注意してください。単一細胞懸濁液が達成されると、溶液は目に見える固体組織片がなく、一貫して見えるはずです。

この溶液を氷の上に置きます。AutoMax分離により細胞をソーティングした後、少なくとも80%CDの4つの陽性CD25の細胞純度にしてください。トライアンブルーの排除によって細胞をカウントし、細胞懸濁液を細胞培養培地中の1ミリリットルあたり6細胞の10倍に希釈します。

次に、アンチCDのすべてのウェルを200マイクロリットルのPBSで3コーティングプレートをすすぎます。それぞれが洗浄液を廃棄物容器に捨てます。次に、100マイクロリットルのTH17誘導カクテルまたは活性化制御ミックスを適切なウェルに三重に加えます。

最後に、各ウェルに100マイクロリットルの細胞を添加し、細胞を少なくとも72時間または最大5日間インキュベートして、Eli SAおよびQPCRのTH17細胞分化を達成します。インキュベーション期間後、各サンプルを個々のアイノアチューブにプールします。細胞をスピンダウンした後、上清を別々のeinor tubeに移し、摂氏マイナス20度で保存して、後でELIによるIL 17 A産生を測定します。

A.To 上清を取り除いた後、QPCRの準備をします 再懸濁液、175マイクロリットルの残りのペレット、即時RNA抽出のためのRNA溶解バッファー、またはインキュベーション期間後の手順を開始する準備ができるまで摂氏マイナス80度で保存します。IL 17に先立つ細胞活性化の準備として、誘導または活性化制御細胞であるTH 17の各細胞内染色プールを24ウェル細胞培養プレートの個々のウェルにトリプリケートします。各ウェルに400マイクロリットルの細胞培養培地を加えます。

総容量を1ミリリットルにするには、PMAイオンマイシンとフェルデンAを各ウェルに添加し、細胞を摂氏37度で4時間インキュベートして、細胞内染色とフローサイトメトリーによりIL 17 Aの存在を検出します。まず、24ウェルプレートの各ウェルから細胞を別々のアイノアチューブに移します。次に、チューブをスピンダウンします。

上清を取り除き、細胞ペレットを200マイクロリットルのファックスバッファーに再懸濁します。再懸濁した細胞を96ウェルフローサイトメトリープレートに移し、ペレットを200マイクロリットルのファックスバッファーで洗浄した後、細胞を再度スピンダウンし、細胞を100マイクロリットルのファックスバッファーに再懸濁し、100マイクロリットルの細胞外抗体染色混合物を添加します。光を避けて室温で15分間インキュベートします。

細胞を2回洗浄した後、ペレットを100マイクロリットルのBD細胞でインキュベートします。サイトパーマバッファーをホイルで覆い、室温で20分間固定します。次に、1 X BDパーマ洗浄バッファー100マイクロリットルで細胞を2回洗浄し、ホイルで覆われた細胞内抗体混合物50マイクロリットルで室温で15分間細胞をインキュベー

細胞を再び蘇生して洗浄した後、細胞を200マイクロリットルのBD染色緩衝液に懸濁し、次に細胞を200マイクロリットルの染色緩衝液を含むフローサイトメトリーチューブに移します。チューブは、生細胞集団の最初のゲートであるサンプルのフローサイトメトリー分析のために読み取る準備ができるまで、摂氏4度で保管します。次に、生細胞集団を使用して、CD 4陽性CD8陰性集団をゲートします。

最後に、IL 17 A 陽性集団上の CD 4 陽性 CD 8 陰性集団歩行から TH 17 細胞を分化するために、未分画のプールされたリンパ節および脾臓細胞は、CD 4 陽性 CD 25 陰性 T 細胞集団のために濃縮されなければなりません。この図では、抗CD 4および抗CD25で染色した未分画のプールリンパ節細胞、SP細胞およびAutoMax分離TT細胞画分が示されています。この最初の散布図は、未分画のプールされたリンパ節および脾臓細胞に存在するCD 4陽性、CD 25陽性、およびCD 4陽性のCD 25陰性リンパ球の割合の代表的なプロファイルを示しています。

単離手順では、追加の実験で使用できる濃縮されたCD 4陽性CD 25陽性treg集団も提供されます。この最終的な散布図では、84%CD 4陽性CD25陰性T細胞である集団での所望の細胞濃縮が示されています。この濃縮されたCD4陽性CD25陰性T細胞集団は、この図に示すように、TH17の分化をより成功させるのに役立ちます。

一方、CD4陽性CD25陰性Tリンパ球と抗CD3および抗CD28との5日間のインキュベーションは、TH17誘導条件下でのCD25陽性Tリンパ球のインキュベーションにより、IL17の一部をもたらし、CDを産生する4つの陽性CD25陽性リンパ球を産生する。TH 17の分化状態は、定量的PCRおよびElis Aによってさらに評価することができ、ここでは、制御下でインキュベートされた濃縮CD4陽性CD25陰性Tリンパ球からのデータ、またはTH17誘導条件がCD4陽性であることが示されています。TH 17条件下でインキュベートされたCD 25陰性Tリンパ球は、IL 17 Aをアップレギュレートし、これはQPCRおよびELI SAによって確認することができます。TH 17特異的転写因子ROARガンマTは、QPCRで測定できるように、TH 17誘導条件下でインキュベートされたCD4個の陽性CD25陰性T細胞によってもアップレギュレーションされます。

この手順に参加している間、TH 17誘導条件下で細胞をインキュベートする前に、少なくとも80%CDの4つの陽性CD25の陰性の細胞純度を達成することを覚えておくことが重要です。このビデオを見た後、C 57ブラックシックスマウスからリンパ節と脾臓を解剖する方法、T eight 17または活性化制御条件下で細胞をインキュベートする方法、およびナイーブCD 4 Tリンパ球のT eight 17細胞Southへの分化を評価する方法についてよく理解できるはずです。