Name: 携帯誘電分光法による特発性側弯症の予後予測のための細胞ベースのアッセイプロトコール (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-16T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
Description: 学ぶ 携帯誘電分光法による細胞ベースアッセイで、末梢血単核球を用いて特発性側弯症の予後を予測する方法。GPCR刺激応答による機能的分類で、早期診断と治療介入の基盤を提供します。

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この作品は（ドクター·モロー）はラ·財団イヴCotrelドゥフランス学士院、パリ、フランスからの補助金によって支えられて、健康の研究のカナダの協会は（ドクター·モローにPP2-99466を付与）し、四次元脊椎LLCから米国ニューヨーク州（ドクター·モローの研究助成金）。

全体の手順は、無菌の生物学的フードの下で行われ、細胞と接触するすべてのソリューションや設備は無菌でなければならない。 1。エッセンシャルの溶液の調製<ol><li> 表1に記載の溶液を調製する。 </li><li>使用時まで4℃、室温およびすべての他の溶液で平衡塩類溶液（BSS）を保つ。 </li><li>使用する前に、数分間水浴中で37℃まで暖かく寒いメディア。 </li></ol> 2。 PBMCの調製および保存<ol><li>各5mlのアリコートを用いてPBMCのつのアリコートを調製するためにEDTAで処理した採血管で全血を10mlを集める。 </li><li> 50mlチューブにEDTA処理した採取チューブからの転送の全血を5ml。 </li><li> BSS、等量のを追加し、上下に穏やかにピペッティングすることにより、サンプルを混ぜる。 </li><li> 2 15ミリリットルファルコンチューブ内のFicollの3ミリリットルを配置します。 </li><li>慎重に4.5ミリリットルをレイヤーそれぞれのチューブ内のFicollの上に血の混合物を希釈した。 </li><li>チューブが血とフィコールの明確な分離を支持するために、最大5分間休憩しましょう​​。 </li><li>ブレーキなしで室温で30分間400×gでチューブを遠心分離する。 </li><li>レイヤーを乱さないように、慎重に遠心分離器からチューブを取り外します。 PBMCを、BSS /フィコール界面で表示されます。 </li><li>ピペットを用いて、両方の管の界面でのPBMCの曇り層を収穫して、新しい50mlチューブに移します。 </li><li>完全培地20ミリリットルを追加します。 </li><li>室温で7分間288×gでチューブを遠心分離する。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>補足メディア500μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>メディアを凍結し、等量のを追加します。 </li><li>クライオバイアルに細胞懸濁液を転送します。 </li><li>イソプロパノールでcryofreezing容器にクライオバイアルを置きます。 </li><li> -80℃で一晩冷凍コンテナを保管してください。 </li><li> TR長期保存のために液体窒素に凍結したPBMCのアリコートansfer。 </li></ol> 3。機能分析 1。 1日目<ol><li>分または解凍するまで37℃の水浴中の液体窒素から一定分量を配置します。 </li><li>滅菌ピペットを用いて50mlチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>完全培地15ミリリットルを加え、室温で5分間200×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>穏やかPHA培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>同じメディアで20ミリリットルにボリュームを完了します。 </li><li>空気が入ることができるように緩くチューブにキャップ。 </li><li>静止リンパ球が急速に増殖しているリンパ芽球に変形できるようにするために、CO 2インキュベーター内で37℃で一晩チューブを残す。 </li></ol> 2。 2日目<ol><li>インキュベーターからチューブを取り、完全にスクリューキャップ、5分間200×gで細胞をスピンダウン室温で加えた。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>穏やかに完全培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>同じメディアで20ミリリットルにボリュームを完了します。 </li><li>空気が入ることができるように緩くチューブにキャップ。 </li><li>細胞数を拡大して、CO 2インキュベーター内で37℃で一晩チューブを残す。 </li></ol> 3。 3日目<ol><li>インキュベーターからチューブを取得、完全にスクリューキャップし、室温で5分間200×gで細胞をスピンダウン。 </li><li>吸引により上清を除去します。 </li><li>室温で5分間、200×gでの遠心分離によってRPMI-1640 10mlで細胞を2回洗浄する。 </li><li>優しくRPMI-1640600μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>自動細胞計数および生存率分析器を用いて、細胞濃度及び生存率を測定する。 </li><li> 1.5×10 5 cells/20μLの細胞濃度に調整したRPMI-1640の適切な量を追加します。 </lI&gt; <li>エッペンドルフチュー​​ブ1.5mLに組換えOPN（rOPN）または媒体（PBS）で細胞を処理。 <ol><li> 2無菌1.5ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに細胞懸濁液100μlを移す。 </li><li> 0.5μgの/ mlの最終濃度になるように一本のチューブにrOPNを追加する。 </li><li>第二の管における等量のPBSを追加します。 </li><li>優しくピペッティング回100μLの滅菌ピペットのセットを使用して各条件を混在させる。 </li></ol></li><li>少量のサンプルを96ウェルマイクロプレートを準備します。 <ol><li>各ウェルにRPMI-1640の5μlを加える。 </li><li>気泡を除去するために3分間200×gでプレートを遠心分離する。 </li></ol></li><li>未処理の細胞だけでなく、rOPNまたはPBSで処理した細胞を播種。 <ol><li>マイクロプレート、チューブから細胞を転送する前に、穏やかに細胞の均一な懸濁を確実にするために一回上下にピペッティングし。 </li><li>未処理の細胞のための四重にウェルあたりの細胞懸濁液40μl加え、二重にrOPNまたはPBSのための細胞を処理した。リ設計については、図1を FER。このデザインは、12人の患者が同じマイクロプレート上でテストすることができます。 </li><li>細胞が培養器に入れる前に休ませ、井戸の底に均等に落ち着くことができるように5分間無菌フード下のセルプレートのままにしておきます。 </li></ol></li><li> OPNの効果を最適化するために、CO 2インキュベーター内で37℃で18時間静置します。 </li></ol> 4。 4日目<ol><li>化合物を用いて、プレートを実行します。 <ol><li>インキュベーターからプレートを取り出し、周囲の室温で30分間そのままにしておきます。 </li><li> RPMI-1640の990μlのストック溶液10μl（10 mm）を追加することで、RPMI-1640でのソマトスタチンおよびイソプロテレノールの100μMに1ミリリットルを用意します。 </li><li> 図2に示すように、適切なウェル中に20μlを分配することによって、化合物プレートを埋める。 </li><li>前に蒸発による化合物濃度の変化を避けるためにプレカット貫通可能シールを化合物プレートをカバーまたはCDSベースのシステムでのインキュベーション中。 </li><li>ロードセルプレート、ピペットチップ、およびCDベースのシステムへの化合物プレート。 </li><li> CDSベースの測定器ソフトウェアでプレートに名前を付けます。 </li><li>適切なプロトコルを選択します。 PBMCと分類のために編集されたプロトコルは、「アゴニスト非接着細胞小サンプルプレートをRTで15分」と呼ばれています。 [プロトコル]ボックスに移動して、プロトコルのリストにこのプロトコルを選択する</li><li> 「スタート」をクリックして、プロトコルを開始。 </li><li>統合された流体システムは、同時に全量50μlに10μMの最終濃度を達成するためにウェルあたり5μLを注入することによって、全てのウェルに化合物が追加されます。 </li><li> CDSベースのシステムが自動的に化合物添加後15分間のデータを収集します。 </li></ol></li><li>データ解析<ol><li>非のための抽出された値を計算する際に使用する周波数の高低の範囲を選択接着細胞。 </li><li>時間をかけてベースラインのインピーダンス測定値の線形変化を補正するドリフト補正を選択します。 </li><li>による電子雑音および化合物の添加に運動応答測定のばらつきを低減するために、データフィルタリングを選択する。 </li><li>完全な分析時間を最大 - 最小方法を選択します。 </li><li>プレートフォーマットオプションの下でExcelにデータをエクスポートします。 </li><li>以下の式を使用してGsの刺激（RMGS）に対する応答の大きさの平均値からGiの刺激（RMGI）に対する応答の大きさの平均値を減算することによりデルタG（ΔG）を計算する。 ΔG= RMGI - RMGS </li><li> （PBSの存在下で刺激Giに応答の大きさの平均がOPN（RmGiOPN）の存在下でGiの刺激に対する応答の大きさの平均値で割ることによってGiを媒介性応答に対するOPNの効果倍の鉄（Fe）の割合を計算するRmGiPBS）次の式を使用して： FE = 100×（RmGiOPN / RmGiPBS） </li><li> Tを参照してください。患者を分類することができ2。 </li></ol></li></ol>

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<li>Verdonk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dielectric+spectroscopy%3A+a+label-free+comprehensive+platform+for+functional+evaluation+of+endogenous+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Cellular dielectric spectroscopy: a label-free comprehensive platform for functional evaluation of endogenous receptors.</a> Assay Drug Dev. Technol. 4 (5), 609-6019 (2006).</li>
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<li>Peters, M. F., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+cellular+impedance+assays+for+detection+of+GPCR+pleiotropic+signaling+and+functional+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Evaluating cellular impedance assays for detection of GPCR pleiotropic signaling and functional selectivity.</a> J. Biomol. Screen. 14 (3), 246-255 (2009).</li>
<li>Peters, M. F., Vaillancourt, F., Heroux, M., Valiquette, M., Scott, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparing+label-free+biosensors+for+pharmacological+screening+with+cell-based+functional+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev.+Technol%22%5BJournal%5D)">Comparing label-free biosensors for pharmacological screening with cell-based functional assays.</a> Assay Drug Dev. Technol. 8 (2), 219-227 (2010).</li>
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</ol>

この作品は、サントジュスティーヌ大学病院で保持し、他の多くは、いくつかの国で保留されているいくつかの特許につながった。四次元脊椎LLCはサントジュスティーヌ大学病院の専用実施権である。

我々は、末梢血単核細胞にも適用可能である特発性脊柱側弯症（PBMC）を、新たに単離された、または液体窒素中で最長1年間凍結保存されたための細胞ベースの予後試験の詳細な手順を記載している。多数の個人をテストする際に、新たに単離したPBMCを使用することは面倒ですので、手順が臨床の場でより実用的な代替手段を提供する凍結したPBMCと発表されました。凍結したPBMCを最初にアッセイ間変動することが時々リードする、使用されたときが、解凍時の細胞凝集に問題が発生しました。アッセイの再現性を最大化するために、我々は、凍結融解サイクルを回避し、一度だけ凍結したサンプルを使用することをお勧めします。手順は、短時間で欠陥のある王タンパク質機能の正確な検出を可能にし、非常に簡単です。この手順を使用して、無症候性脊柱側の子供が簡単に、より自分の健康のために危険なしに臨床転帰を予測するために分類することができます。ホー健常者12に対して王刺激に対する最大反応の程度に応じて分類を行う、対照被験者のためのいくつかの要件を満たさなければならwever、。実際、適切な比較コホートを持つために、対照被験者は、薬のどのような種類でも、このような過去の家族/個々の病歴などの個人情報を提供しない、一致した年齢と性別でなければなりません。これらの要件は、対照被験者の動員のための重要な障害を構成することができる。したがって、同一個体における王とGsタンパク質刺激に対する応答との間の不均衡の程度を調べることにより分類を行うことにより、制御対象を使用する必要性を排除することが理想的である。 この予後テストを実行するには、CDSベースのシステムを使用すると、同時に同じアッセイで王とのGs媒介細胞応答を提供するという点で重要である。多くの患者は無AMで分類することができますが本報告書の結果によって示されるように、このアッセイのために固定されたダイナミックレンジを用いて、あいまいさは、少数の患者は、範囲の境界線での値を示すことになる。これらの個人を識別するために、我々は、OPNは、3つの官能基間のGiを媒介細胞応答に異なる効果を誘導することを実証することによって、Giの刺激に対する応答にOPNの効果の評価を導入している。実際に、我々は、OPN、FG1内のGiの刺激増大に応答して、の存在下では、FG2内のより高い程度まで、FG2及びFG3に減少することを見出した。 OPNの高いコストにもかかわらず、このケモカインの使用は、あいまいな場合を区別するため、我々の分類アッセイの精度を向上させることが不可欠である。しかし、このアッセイは、ウェル当たり1.5×10 5個の細胞の最小は、我々の実験条件下でCDSベースのシステムで細胞応答を観察するために必要とされるという欠点を有する。特定の患者サンプルは、十分な数を持っていません試験されるべき細胞。この場合には、医療や研究室スタッフ、家族やイライラするために気になることができる追加の採血のために患者をリコールする必要がある。前向き研究は、この問題に対処するために我々の研究室で予定されています。 それにもかかわらず、現在のプロトコルは、テストが細胞の応答をモニターするために検証済みラベルフリーシステム13,14を使用して自動化している間の細胞を調製するために、簡単で実証された方法に依存している。他の疾患の予後のための利用可能な遺伝的プラットフォームと比較した場合、テストプラットフォームは、比較的安価である。また、採血管を含む全ての使い捨て材料利用のコストは、特別な電極マイクロプレート、円錐、エッペンドルフ管は、非常に高価ではなく、約1000人の患者の試験を完了するために、以下で3000ドルと見積もられている。この推定値は、サンプルの調製のための人件費​​が含まれていませんが及び試験を行う、このテストはかなり手頃な次世代シークエンシングプラットフォームよりも残る。注目すべきは、遺伝的なプラットフォームへのコスト比較だけではありませんが、より具体的には、AISの分野に関連し、核医学診断に関連するコストである。今日では、米国内の1万人の子どもたちとカナダでは約100,000の子どもよりも、特発性側弯症と診断されており、X線照射による脊柱側の子どもの診断およびモニタリングの総費用は、北米で毎年25億ドル以上である。したがって、我々の細胞ベースのアッセイ手順は、健康上のリスクがなく、低コストで特発性脊柱側弯症児の日常的なスクリーニングおよびモニタリングに適していると予想される。

特発性脊柱側弯症は、一般的に、椎回転1を伴って10度以上横曲率と定義され、原因不明の脊柱変形である。条件は、小児集団の4％に影響を与え、最も一般的には9〜13歳の年齢2,3,4の間に診断される。診断は主に排除され、唯一のそのような椎骨の奇形、神経筋または症候性障害などの脊柱変形の他の原因を除外した後に行われている。伝統的に、trunkal非対称性はアダムス前進曲げ試験により明らかにし、身体検査中に5 scoliometerで測定する。診断は、次いで放射線曲線の観察およびコブ方法6を用いて角度測定により確認することができる。 診断されたら、脊柱側の子を管理する上で、医師のための主な関心事は、カーブが進行するかどうかである。確かに、カーブの進行は、多くの場合、予測不可能であり、より頻繁に男児7よりも女の子の間で観察されている。未治療の場合、曲線はかなりの物理的な変形、さらには心肺問題を作成、劇的に進行することができます。曲線は70°8,9を超えた場合に、これらの症状は、生命を脅かすになる。カーブの進行を防ぐか、または停止する現在の治療の選択肢は、ブレーシングや手術を含む。手術は曲線よりも大きい45°またはブレースに反応しないために予約されている間、一般的に、ブレーシングは、25〜40°の間のカーブをお勧めします。 およそ、特発性側弯症と診断された子供の10％は矯正手術10を必要とするカーブの進行を持っている。現在、実証済みの方法や患者のこのカテゴリを識別するために利用できるテストは存在しない。その結果、すべての診断された子供は、彼らが、骨格成熟に達するまでは、通常、数年にわたって複数のX線写真を受ける。これは、脊柱側弯症と、典型的な患者が持っていると推定されている3年間で11以上の約22放射線検査。そのため、複数のX線撮影検査の潜在的なリスクのため、電離放射線に子供をさらすことなく、特発性側弯症の予後を実施する可能性があり、代替のアプローチが強く望まれている。この必要性を満たすことを意図して、我々は、以前より早く特発性脊柱側弯症を発症するリスクが無症候性子供を識別するための予後試験として、細胞ベースのスクリーニングアッセイを開発した。試験はGiのタンパク質の機能状態を調べ、CDSによって測定されるのGiタンパク質刺激12に対する最大応答の程度に応じて3つの官能基（FG1、FG2及びFG3）中に子供を分類することによって、両方の無症候性および影響を受けた小児の臨床転帰を予測するベースのシステム。このシステムは、主に様々な細胞型13,14,15,16におけるGタンパク質を介してシグナル伝達を評価するために使用される。なおに関する情報を得る細胞表面受容体の活性化後のインピーダンスの変化を測定することにより、外部刺激に対する細胞の全積分応答。細胞をウェルの底に電極を含み、システムが細胞外および細胞間に電流を誘導する小さな電圧を印加することは、マイクロプレートに播種する。ウェルへの化合物の注射後、細胞表面受容体を刺激し、シグナル伝達事象が発生し、細胞外および細胞間の電流の流れに影響を与える細胞変化をもたらすことにより、測定された大きさに影響を与えている。健常対照被験者と比較した場合に、このアプローチでは、脊柱側弯症を発症する危険性のある脊柱側弯症の患者および子供以上がGiのタンパ​​ク質刺激にあまり反応であり、分類は、対照群と還元の相対的な程度の割合に基づいている。分類範囲はFG3、40及びFG2 60％、および60と12 FG1 90％、10〜40％の間で固定されている。 <p claSS = &quot;jove_content&quot;&gt;最近では、我々は3つの官能基は明らかに王およびGS刺激に対する応答との間の不均衡のプロファイルに応じて区別することができることを実証することで、このアプローチを変更しました。実際に、我々は、明らかな不均衡がFG2において観察されなかったGiの刺激に対する応答は、FG3で優勢であることを見出した。対照的に、FG1は、Gsを刺激に応答するための優位性を示した。加えて、我々はFG2に属する患者は手術を必要とする17の点に進行するリスクがより多くあるという証拠を提供した。この分類試験の精度をさらに官能基のうちGiの刺激に対する応答にオステオポンチン（OPN）の異なる効果を実証することによって改善されている。 ここでは、現在我々の研究室で行われ、この機能試験の実験や分析法の詳細な手順を文書化する。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Wisent, Inc</td><td>350-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Therno Scientific Hyclone</td><td>SH3007103</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17144003</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>Phytohemagglutinin</td><td>Invitrogen (Gibco)</td><td>10576-015</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトオステオポンチン</td><td>R&D Systems, Inc</td><td>1433-OP/CF</td><td></td></tr><tr><td>ソマトスタチン</td><td>Tocris</td><td>1157</td><td></td></tr><tr><td>イソプロテレノール</td><td>Tocris</td><td>1743</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wisent, Inc</td><td>311-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ピペットチップ</td><td>Axygen Scientific</td><td>301-06-451</td><td></td></tr><tr><td>滅菌エッペンドルフチューブ</td><td>Ultident</td><td>24-MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 円錐形チューブ</td><td>VWR インターナショナル</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>セルキー 小サンプル 96W マイクロプレート</td><td>分子デバイス</td><td>1026496</td><td></td></tr><tr><td>セルキーチップ</td><td>サイビオ</td><td>OL3800-25-559N</td><td></td></tr><tr><td>プレカット ピアスシール</td><td>エクセルサイエンティフィック社</td><td>XP-100</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Vicell XR</td><td>ベックマンコールター</td><td>731050</td><td>自動セルカウンター</td></tr><tr><td>細胞培養フード</td><td>Forma Scientific</td><td>1284</td><td>Class II</td></tr><tr><td>液体窒素貯蔵</td><td>Thermo Scientific</td><td>CY5093570</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR International</td><td>89032-204</td><td></td></tr><tr><td>標準光学顕微鏡</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>DMIL LED</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>51019557</td><td>37°Cで5%CO2;C</td></tr><tr><td>低速遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004364</td><td></td></tr><tr><td>Cellkey system</td><td>Molecular Devices</td><td>1019185</td><td>CDSベースの装置</td></tr></tbody></table>

携帯誘電分光法による特発性側弯症の予後予測のための細胞ベースのアッセイプロトコール

Cell-based Assay Protocol for the Prognostic Prediction of Idiopathic Scoliosis Using Cellular Dielectric Spectroscopy

このプロトコルは、無症候性および影響を受けた小児の特発性側弯症の予後を予測するための機能テストとして、我々の研究室で開発された細胞ベースのアッセイのための実験や分析手順を詳しく説明します。アッセイは、自動化されたCDSベースの器具を用いて、細胞誘電分光法（CDS）による末梢血単核細胞（PBMC）中の王とGsタンパク質の機能的状態の評価から構成され、3つの官能基への子供の分類（FG1王およびGSタンパク質刺激に対する反応の程度との間の不均衡のプロフィールに関しては、FG2、FG3）。分類は、さらに、グループ間のGiの刺激に対する応答にオステオポンチン（OPN）の差動効果により確認されると、疾患の重症進行は、FG2によって参照される。およそ、10mlの血液の体積は、フィコール勾配および細胞のPBMCを抽出するために必要とされるその後液体窒素中に保存されている。 Pの適切な数BMCは、アッセイを行うためには、細胞培養の2日後に得られる。本質的に、細胞を最初にphytohemmaglutinin（PHA）と共にインキュベートする。 24時間のインキュベーション後、培地を細胞播種およびOPN処理の前にさらに24時間、PHAを含まない培地によって置き換えられる。次いで、細胞をそれぞれ分光それらの同族受容体を介して王とGsタンパク質を活性化ソマトスタチンおよびイソプロテレノールに対する応答についてスクリーニングする。ソマトスタチンおよびイソプロテレノールの両方を同時に統合された流体システムを注射し、細胞の回答を15分間モニターされる。アッセイは、新鮮または凍結したPBMCを用いて実施することができ、手順は4日以内に完了する。

細胞生存率は86〜96％の範囲で一致する値を有するすべてのサンプル間で同等であった。対照的に、高い変形が試料（ 表3）のうち、細胞数に認められた。使用される32のサンプルのうち、2セルの数が不足していたと分類されていない。王とGsシグナル伝達との間の不均衡の程度に従って機能分類の結果の例を図3に示している。この図の縦軸は、FG2のための10と-10の間、FG3のために&gt; 10として設立され、ダイナミックレンジを有する官能基の輪郭を描く3つのセクションに分かれており、最終的には&lt;-10 FG1用です。 5人の患者、特に345、353、370、371、および382は、範囲の境界線であったが。30の中では、ここでテストされた患者、14、6、および5人の患者が明確に、それぞれ、FG3、FG2、およびFG1に分類した王刺激に応答に対するOPNの効果の評価は、OPNはPAで応答を増加させたことを明らかにしていた353と371をtients。対照的に、応答はrOPN治療後に患者370の患者345および382で50％以上かつ50％未満に減少した。だから、私たちの分類基準（ 表2）によると、我々はFG1の患者353および371を分類することができました、患者345とFG2 382、およびFG3患者370。並行して、すべての患者は、Giのタンパ​​ク質の刺激に対する応答についてスクリーニングし、対照被験者と比較した。予想されたように、すべての患者は対照被験者よりも少ない応答性のようで、私たちの新しい手順で同じ官能基に分類された患者は、最大応答（ 図5）の同様のレベルを示した。また、各官能基の患者間格差が私たちの新しい手順を検証し、分類12の私達の古典的な範囲と一致した。定期サントジュスティーヌ病院で私達の特別なクリニックが従って、脊柱側弯症患者の大規模コホートの分類は3ことを明らかにしたFG2は、疾患の重症進行するリスクがよりこの官能基に分類された患者を特定し、この分類試験には有用であり得ることを示す、重症例のうち（ 図6）優勢であった、一方の官能基は、同様に、適度なケースの間で分配した特発性側弯症の予後。 <table border="1"><tbody><tr><td rowspan="5">溶液A </td><td>無水D-グルコース</td><td> 0.1％ </td></tr><tr><td>のCaCl 2 2H 2 O </td><td> 0.05 mMの</td></tr><tr><td> 塩化マグネシウム</td><td> 0.98 mMの</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td> 5.4 mMの</td></tr><tr><td>トリス</td><td> 145 mMの</td></tr><tr><td> B液</td><td> NaClを</td><td> 140 mMの</td></tr><tr><td rowspan="2">平衡塩類溶液（BSS） </td><td>溶液A </td><td> 1ボリューム</td></tr><tr><td> B液</td><td> 9ボリューム</td></tr><tr><tdROWSPAN = &quot;3&quot;&gt;完全メディア</td><td> RPMI-1640 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td rowspan="3">補足メディア</td><td> RPMI-1640 </td><td> 50ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40％ </td></tr><tr><td rowspan="4">凍結培地</td><td> RPMI-1640 </td><td> 50ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 40％ </td></tr><tr><td> DMSO </td><td> 20％ </td></tr><tr><td rowspan="4"> PHAメディア</td><td> RPMI-1640 </td><td> 500ミリリットル</td></tr><tr><td>抗生物質 - 抗真菌</td><td> 1％ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td>フィトヘマグルチニン</td><td> 1％ </td></tr></tbody></table> 表1。必須ソリューションを提供しています。 <table border="1"><tbody><tr><td> ΔGとダイナミックレンジ </td><td> 官能基 </td><td> 鉄とダイナミックレンジ </td></tr><tr><td> ΔG&lt;-10 </td><td> FG1 </td><td> FE&gt; 100％ </td></tr><tr><td> -10 &lt;ΔG&lt;10 </td><td> FG2 </td><td> FE &lt;50％ </td></tr><tr><td> ΔG&gt; 10 </td><td> FG3 </td><td> 50％&lt;鉄&lt;95％ </td></tr></tbody></table> ΔGとFeとの間で確立ダイナミックレンジに応じて官能基の表2。分類。 <table border="1"><tbody><tr><td> 患者 </td><td> 生存率（％） </td><td> 細胞濃度（×10 6個 / ml） </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> 343 </td><td> 88.7 </td><td> 11.64 </td><td></td></tr><tr><td> 344 </td><td> 90.5</td><td> 13.6 </td><td></td></tr><tr><td> 345 </td><td> 94.4 </td><td> 8.54 </td><td></td></tr><tr><td> 346 </td><td> 94.3 </td><td> 25.79 </td><td></td></tr><tr><td> 347 </td><td> 94.2 </td><td> 27.36 </td><td></td></tr><tr><td> 348 </td><td> 94.6 </td><td> 8.52 </td><td></td></tr><tr><td> 349 </td><td> 91.2 </td><td> 0.82 </td><td>細胞の数が不足</td></tr><tr><td> 350 </td><td> 90.3 </td><td> 8.92 </td><td></td></tr><tr><td> 352 </td><td> 92.6 </td><td> 8.28 </td><td></td></tr><tr><td> 353 </td><td> 91.3 </td><td> 12.75 </td><td></td></tr><tr><td> 354 </td><td> 86.9 </td><td> 7.62 </td><td></td></tr><tr><td> 355 </td><td> 91.2 </td><td> 7.51 </td><td></td></tr><tr><td> 356 </td><td> 90.3 </td><td> 9.36 </td><td></td></tr><tr><td> 358 </td><td> 95.1 </td><td> 16.94 </td><td></TD&gt; </tr><tr><td> 359 </td><td> 92.3 </td><td> 13.89 </td><td></td></tr><tr><td> 360 </td><td> 89.4 </td><td> 7.67 </td><td></td></tr><tr><td> 361 </td><td> 93.5 </td><td> 7.84 </td><td></td></tr><tr><td> 365 </td><td> 86.5 </td><td> 2.2 </td><td>細胞の数が不足</td></tr><tr><td> 368 </td><td> 92.6 </td><td> 15.69 </td><td></td></tr><tr><td> 369 </td><td> 93.4 </td><td> 10.9 </td><td></td></tr><tr><td> 370 </td><td> 92.5 </td><td> 19.93 </td><td></td></tr><tr><td> 371 </td><td> 88.8 </td><td> 10.68 </td><td></td></tr><tr><td> 374 </td><td> 93.9 </td><td> 16.86 </td><td></td></tr><tr><td> 376 </td><td> 92.9 </td><td> 15.67 </td><td></td></tr><tr><td> 377 </td><td> 93.1 </td><td> 9.99 </td><td></td></tr><tr><td> 378 </td><td> 93.6 </td><td> 13.57 </td><td></td></tr><tr><td> 379 &lt;/ TD&gt; <td> 92.6 </td><td> 19.86 </td><td></td></tr><tr><td> 380 </td><td> 91.1 </td><td> 8.46 </td><td></td></tr><tr><td> 381 </td><td> 93.9 </td><td> 14.82 </td><td></td></tr><tr><td> 382 </td><td> 92.1 </td><td> 23.06 </td><td></td></tr><tr><td> 383 </td><td> 92.9 </td><td> 11.82 </td><td></td></tr><tr><td> 384 </td><td> 89.1 </td><td> 7.73 </td><td></td></tr></tbody></table> 表3。パーセント生存率および細胞濃度自動細胞計数および生存率分析器を用いて測定した。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig1.jpg" /> 図1。細胞播種のためのデザイン 。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig2.jpg" /> 図2。化合物を分配するためのデザイン 。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig3.jpg" /> 図3。CDSベースのシステムを使用した機能的な分類のダイナミックレンジ 。グラフは、特発性側弯症の患者からのPBMCで得られた王およびGS刺激に対する応答の間の不均衡の程度の値を示している。値は、ソマトスタチンおよびイソプロテレノールの10μMのに反応して、CDSベースのシステムで測定した。各ポイントは、重複しての両方の反応のΔGを表しています。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig4.jpg" /> 図4。PBMC中の王刺激に対する応答にrOPNの影響 。細胞を、0.5μg/ mlのrOPNの存在下又は非存在下で18時間血清飢餓状態にし、次いで10で刺激<html> 56;ソマトスタチンのMは王媒介細胞応答を開始する。グラフ内のデータは、最大最小インピーダンスから生成され、重複した応答の平均値に対応した。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig5.jpg" /> 図5。制御とscoliostic被験者からのPBMC中のGiタンパク質の機能状態 。対照被験者と脊柱側弯症患者由来のPBMCを、内因性ソマトスタチン受容体を介してのGiタンパク質を刺激するために、ソマトスタチンの漸増濃度に曝露した。手順の項に記載のように細胞性応答はCDSベースのシステムで測定した。曲線は最大最小インピーダンスから生成した。各曲線は、非線形回帰を表しています。データは、対照被験者からの細胞では最大応答に対して標準化し、各点は、重複での応答の平均値に対応しています。/ 50768/50768fig5large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;大きな画像を見るにはここをクリックしてください。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/50768/50768fig6.jpg" /> 図6脊柱側弯症の異なるフェーズ間での官能基の分布 。定期サントジュスティーヌ病院で続い794中等度（10から44°の間の曲率）と162（45°以上の曲率）重篤な症例で、脊柱側弯症患者の大規模コホートは、王とのGに対する応答の間の不均衡の程度に応じて分類された刺激。応答は、ソマトスタチンおよびイソプロテレノールの10μMのに反応して、CDSベースのシステムで測定した。

構造化されたプロトコルは、細胞誘電分光法（CDS）を用いて、特発性脊柱側弯症の予後を予測するための機能テストのような細胞ベースのアッセイのために提示される。アッセイは、新鮮または凍結末梢血単核細胞（PBMC）を用いて行うことができ、手順は4日以内に完了する。

This protocol details the experimental and analytical procedure for a cell-based assay developed in our laboratory as a functional test to predict the ...

本実験の全般的な目的は、細胞誘電分光法を用いてGPCR R活性化に対するPBM C'Sの応答をスクリーニングし、患者を機能的にグループ分けすることで、特発性側弯症の予後を予測することです。これは、細胞数を増やすためにフィトヘマグルチニン（PHA）存在下でpbmcを培養することによって達成されます。細胞の増幅は、チューブを傾斜させた状態で保持して行います。第2ステップとして、細胞をOSTEOPONTIN（またはOPN）で処理し、Giタンパク質の活性を上昇または低下させます。処理後の患者の状態に応じて、細胞懸濁液をマイクロプレートに転移させます。次に、GiまたはGs GPCRアゴニストで細胞を刺激し、それによって生じるインピーダンスの変化を測定します。結果としてすべてのウェルの速度論的応答が得られ、その後、インピーダンスの変化に基づいて統合応答が定量化されます。この技術がもたらす意義は、単なる診断にとどまりません。これにより、側弯症を発症するリスクのある有症状の患者を早期に検出することが初めて可能となり、誰が側弯症を発症するか、あるいはどの段階にあるかを把握することで、適切な新しい治療法を提供できるようになります。X線照射などの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、Covidを測定する必要がなく、健康上のリスクもない状態で、骨病性側弯症の予後を予測できることです。最新の手順として、リサーチアシスタントのNita Francoが、37 °Cの恒温水槽で末梢血単核細胞の凍結保存アリコートを融解させます。滅菌ピペットを用いて、細胞懸濁液を15 mLの完全培地を含む50 mLチューブに移し、遠心分離を行います。細胞の上清を吸引します。次に、細胞ペレットを1 mLのPHA培地で緩やかに懸濁させ、同培地を用いて20 mLまで定量を合わせ、空気が入るようにチューブの蓋を軽く閉めます。静止期のリンパ球が急速に増殖するリンパ芽球へと形質転換するように、二酸化炭素インキュベーター内で37 °Cで一晩培養します。キャップを完全に締め、遠心分離によって細胞をペレット化します。上清を吸引して除去します。細胞ペレットを1 mLの完全培地で緩やかに懸濁させます。同一の培地を用いて全量を20 millilitersにし、チューブのキャップを緩く閉めて、細胞数を増やすため一晩培養します。10 millilitersのRPMI 1640で2回洗浄した後、細胞ペレットを600 microlitersのRPMI 1640で穏やかに再懸濁します。自動細胞計数装置および生存率分析装置を用いて、細胞濃度と生存率を測定します。次に、RPMI 1640を適切な量加え、細胞濃度を20 µLあたり1.5 × 10⁵個に調整します。この懸濁液を100 µLずつ、2本の滅菌済み1.5 mLエッペンドルフチューブに分注します。そのうち1本のチューブにリコンビナントオステオポンチンを加え、最終濃度を0.5 µg/mLに調整します。2本目のチューブに同量のPBSを加えます。100 µLに設定した滅菌ピペットを用いて2回ピペッティングし、各条件を穏やかに混合します。次に、96ウェルプレートの各ウェルに5 µLのRPMI 1640を加え、プレートを200 ×gで3分間遠心して気泡を除去し、チューブからマイクロプレートへ細胞を移します。細胞を均一に懸濁させるため、ピペットでゆっくりと1回吸い上げ、吐出します。未処理細胞については4ウェルに、ROPNまたはPBS処理細胞については2ウェルに、1ウェルあたり40 µLの細胞懸濁液を播種します。細胞を静止させ、ウェルの底に均一に沈降させるため、細胞プレートを滅菌フード内に5分間放置します。OPN培養の効果を最適化するため、細胞を二酸化炭素インキュベーター内にて37°Cで18時間培養し、その後、室温で約30分間静置して培養液を平衡化させます。その間に、100 µMのソマスタチンおよびイソプロテレノールをRPMI 1640で調製し、各1 mLずつ用意します。化合物プレートの適切なウェルに20 µLずつ分注します。コンパウンドプレートを硬化性シールで密閉します。プレート、ピペットチップ、およびコンパウンドプレートをCDSベースのシステムにロードします。CDSベースの装置ソフトウェアでプレートに名前を付けます。プロトコルリストに移動し、適切なプロトコルを選択して開始します。「Start」をクリックしてください。統合流体システムにより、すべてのウェルに化合物が同時に添加されます。CDSベースのシステムにより、化合物添加後15分間データが自動的に収集されました。細胞生存率はすべてのサンプル間で同等であり、86から96%の範囲で一貫した値を示しました。対照的に、細胞数には大きなばらつきが認められました。使用した32サンプル中、2サンプルは細胞数が不十分であったため、分類から除外されました。この例は、GIとGIシグナリングの不均衡の程度に基づいた機能的分類を示しています。GI刺激に対するOPNの効果を評価した結果、患者353および371ではOPNによって反応が増強したことが明らかになりました。対照的に、ROPN投与後の反応は、患者345および382では50%以上減少し、患者370では50%未満減少しました。したがって、当社の分類基準に基づき、患者353および371をFG 1に、患者345および382をFG 2に、そして患者370をFG 3に分類することができました。並行して、すべての患者を対象にGIタンパク質刺激に対する反応性をスクリーニングし、対照群と比較した。予想通り、すべての患者は対照群よりも反応性が低かった。同一の機能群に分類された患者は、最大反応において同様のレベルを示した。サン・ジュスティーヌ病院の専門クリニックで定期的にフォローアップされているSC患者の大規模コホートを分類した結果、3つの機能的グループが同様に分布していることが明らかになりました。中等症例の中ではFG 1が、重症例の中ではFG 2が支配的でした。このビデオを視聴することで、細胞誘電分光法を用いて患者を2つまたは3つの機能的グループに分類する方法について十分に理解できるはずです。

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