携帯誘電分光法による特発性側弯症の予後予測のための細胞ベースのアッセイプロトコール

次の実験の全体的な目標は、細胞誘電分光法を使用してGPCR R活性化に対するPBM C'S応答をスクリーニングすることにより、患者の機能的グループに従って特発性脊柱側弯症の予後を予測することです。これは、フィトヘマグルチニンまたはPHAの存在下でpbmcを培養し、細胞数を拡大することによって達成されます。細胞増殖はチューブ内で完了し、傾斜した位置に維持されます。

第2のステップとして、細胞をオステオポンチンまたはOPNで処理し、GIタンパク質の活性を増加または減少させます。治療後の患者に応じて、細胞懸濁液はマイクロプレートに移されます。次に、細胞をGIまたはGS GPCRアゴニストで刺激して、結果として生じるインピーダンス変化を決定します。

その結果、すべてのウェルの運動学的応答が得られ、インピーダンスの変化に基づいて統合応答が定量化されます。この手法の意味するところは、単なる診断をはるかに超えています。そのため、脊柱側弯症を発症するリスクのある症状のある患者を早期に発見することができ、今では誰が脊柱側弯症を発症するのか、またその患者がどの段階にあるのかを知ることで、彼らを治療するための新しい治療法を提供することができます。

この技術がX線被曝のような既存の方法よりも優れている点は、この技術により、コビドを測定する必要がなく、健康上のリスクもなく、予後オステオパス脊柱側弯症を予測できることです。最新のものは、技術が今、私たちの研究助手ニタフランコ、37°Cの水浴で末梢血単核細胞の凍結アリコートの解凍になります。滅菌ピペットを使用して、細胞懸濁液を15ミリリットルの完全な培地を含む50ミリリットルのチューブに移し、遠心分離します。

細胞は上清を吸引します。次に、細胞ペレットを1ミリリットルのPHA培地に静かに懸濁し、同じ培地でチューブを緩くキャップして空気が入るように20ミリリットルまで容量を完成させます。チューブを二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で一晩インキュベートし、静止性リンパ球が急速に増殖するリンパ芽球に変化するようにします。

キャップを完全に締め、遠心分離により細胞をペレット化します。吸引によって上清を取り除きます。細胞ペレットを1ミリリットルの完全培地に静かに懸濁します。

同じ培地で容量を20ミリリットルまで完成させ、チューブを一晩緩くキャップして培養し、細胞数を拡大します。10ミリリットルのRPMI 1640で2回洗浄した後、細胞ペレットを600マイクロリットルのRPMI 1640に穏やかに再懸濁します。自動セルカウンターと生存率アナライザーを使用して、細胞の濃度と生存率を測定します。

次に、適切な量のRPMI 1640を添加して、20マイクロリットルあたり5番目の細胞の1.5×10の細胞濃度に調整します。懸濁液の100マイクロリットルを2本の滅菌1.5ミリリットルのエンドオルフチューブに移します。組換えオステオポンチンを1本のチューブに添加し、最終濃度を0.5マイクログラム/ミリリットルにします。

2本目のチューブに同量のPBSを加えます。100マイクロリットルにセットした滅菌ピペットを使用して2回ピペッティングすることにより、各条件を穏やかに混合します。次に、96ウェルプレートの各ウェルに5マイクロリットルのRPMI 1640を加え、プレートを200GSで3分間遠心分離して気泡を取り除き、細胞をチューブからマイクロプレートに移します。

細胞の懸濁液が均一になるように、一度ピペットでゆっくりと上下させます。ウェルあたり40マイクロリットルの細胞懸濁液を、未処理の細胞の場合はクワッドデュプリケートで、ROPNまたはPBS処理された細胞の場合はデュプリケーションで播種します。細胞プレートを滅菌フードの下に5分間放置して、細胞を休ませ、ウェルの底に均一に沈殿させます。

OPN培養の効果を最適化するために、二酸化炭素インキュベーター内で細胞を摂氏37度で18時間、室温で約30分間平衡化します。その間、RPMI 1640で100マイクロモルのソマトスタチンとイソプロテレノールの1ミリリットルを準備します。適切なウェルに20マイクロリットルを分注して、コンパウンドプレートを充填します。

コンパウンドプレートを硬化性シールで覆います。プレートピペットチップとコンパウンドプレートをCDSベースのシステムにロードします。CDSベースの装置ソフトウェアでプレートに名前を付けます。

プロトコルリストに移動し、適切なプロトコルを選択してプロトコルを開始します。[開始] をクリックします。統合された流体システムは、すべてのウェルに同時に化合物を追加します。

CDSベースのシステムは、化合物版の細胞生存率がすべてのサンプル間で比較可能であり、値が86〜96%の範囲で一致した後、15分間のデータを自動的に収集します。使用した32個のサンプルのうち、2個は細胞数が不十分で分類されていませんでした。この例では、GI シグナル伝達と GI シグナル伝達の不均衡の程度に応じた機能分類を示しています。

消化管刺激に応答したOPN効果の評価により、OPNが患者353および371の反応を増加させることが明らかになりました。対照的に、ROPN治療後の応答は、患者345および382で50%以上減少し、患者370で50%未満減少しました。.したがって、分類基準に従って、FG 1の患者353と371、FG 2の45と382の患者300、FG 3の患者370を分類することができました。

並行して、すべての患者が消化管タンパク質刺激に対する反応についてスクリーニングされ、対照被験者と比較されました。予想通り、すべての患者は対照被験者よりも反応が低かった。同じ機能群に分類された患者は、最大反応の同レベルを示しました。

サンジャスティン病院の専門クリニックで定期的に追跡されたSC患者の大規模なコホートの分類により、3つの機能グループが同様に分布していることが明らかになりました。中等症では、FG2が重症例で優勢であった。このビデオをお読みいただければ、細胞誘電分光法を使用して患者を2つまたは3つの機能グループに分類する方法を十分に理解できるはずです。