Name: 熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: 学ぶ熱誘導抗原賦活化法でマウス海馬組織の前駆細胞型を可視化し、成体神経新生における神経幹細胞の分化段階を明らかにする手法。この技術は神経科学および細胞生物学研究に有用です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この方法論はもともと、ジョンズ・ホプキンス大学医学部神経内科細胞工学研究所のHongjun Song博士の研究室で開発されました。この研究は、NIMH(R00MH090115)、NARSAD、Fraternal Order of Eagles' Mayo Cancer Research Fund、M.H.J.に授与されたメイヨー財団からのスタートアップパッケージ、およびA3014385韓国国立研究財団(NRF)を通じての基礎科学研究プログラムによって資金提供されました。

1. 免疫組織化学前:灌流と組織学
<ol>
	<li>マウスに適合した一般的な心筋プロトコルに従ってマウスを灌流し、脳を4%パラホルムアルデヒド(PFA)9に抽出します。</li>
	<li>脳をPFAに4°Cで一晩放置します(例:PFAで満たされた10 mLの円錐管)。PFAに少なくとも12〜24時間、完全に固定するには36時間以内で保管してください。一晩固定した後、円錐管からPFAを空にしますが、脳は内部に残します。30%のスクロースをチューブに注ぎ、脳を5秒間短時間洗浄して、残留PFAを除去します。最後に、脳を含むチューブに再び30%のスクロースを入れます。脳がチューブの底に沈むまで、脳を4°Cのショ糖に保ちます。</li>
	<li>ミクロトーム上で40μmの脳切片を切断します。マウスの脳アトラスを参照して、歯状回の始まりから終わりまでのセクションの収集を開始します。切片を不凍液(簡単なレシピは、スクロース300 gを500 mLの0.1 M PBSおよび300 mLのエチレングリコールに溶かします)で免疫組織化学の準備ができるまで保存します。</li>
	<li>切断した組織を、組織に強く接着するように特別に設計された顕微鏡スライドに取り付けます。これらのスライドは、沸騰段階で組織を強力に保持します。ティッシュを取り付けた後、スライドを10分間、または完全に乾かすまで乾かしてください。スライドを下端にペーパータオルで置いた垂直面にスライドを置くと、乾燥を早めることができます。複数のスライドが取り付けられている場合、次のステップに進む準備ができるまで、その時間(1〜2時間で問題ありません)は他のスライドを乾燥させておくことができます。</li>
	<li>スライドが乾いたら、PBSで5分間ずつ3回洗浄し、再度乾燥させます(PBSバッファー= 0.137 M NaCl、0.0027 M KCl、0.0119 M Na2PO4)。これにより、以前の化学物質(凍結防止剤のグリセロールなど)が十分に除去され、スライドへの組織の接着が損なわれることはありません。</li>
</ol>
2. 試薬とマイナー機器の準備
<ol>
	<li>組織切片を煮沸する溶液A(0.1 Mまたは19.21 g / lクエン酸)と溶液B(0.1 Mまたは24.9 g / lクエン酸トリスナトリウム)を調製します。</li>
	<li>メスシリンダーで、9 mlの溶液Aと41 mlの溶液Bを混合し、この混合物に450 mlのddH2Oを加えます。.</li>
	<li>この混合物を、電子レンジで安全な空の容器(空のピペットチップボックスなど)に注ぎます。</li>
</ol>
3. 熱による抗原賦活化
<ol>
	<li>ステップ2で作った溶液を標準設定で5分間、標準電子レンジで沸騰させます。溶液は100°C以上で沸騰し始めます。</li>
	<li>沸騰が完了したら、容器を電子レンジから慎重に取り出し、乾燥したスライドを入れて、海馬部分のあるスライド面が下を向いて液体に完全にさらされていることを確認します。可能であれば、スライドをボックスの壁に対して斜めに置き、その周りに他のスライドを積み重ねます。ボックス内の「フィット感」がしっかりと固定されているため、スライドが互いに重なって移動する余地がないようにします。</li>
	<li>この混合物をスライドで電子レンジの標準設定で7分間沸騰させます。この間、溶液は100°C以上で沸騰します。</li>
	<li>この沸騰段階で、2つの氷バケツを半分氷で満たします。</li>
	<li>ステップ3.3の沸騰が完了したら、容器を電子レンジから取り出し、氷のバケツの1つに入れます。もう一方のバケツから残りの氷を容器全体に注ぎ、完全に覆います。1時間放置します。</li>
</ol>
4. 一次抗体と二次抗体の染色
<ol>
	<li>1時間の待機期間が終了したら、スライドを容器から取り出し、TBS-Tバッファーで3回、それぞれ5分間洗浄します。これらの基本的な洗浄を行うために、任意の装置を使用してもよい。(バッファーTBS = 50 mM Tris HCl、150 mM NaCl、TBS-T = 0.05% Triton X-100 TBSバッファー、TBS-TT = 4% ロバ血清TBS-Tバッファー)。</li>
	<li>洗浄後、スライドを暗い場所(ベンチの引き出しの中など)で5〜10分間、またはスライドが完全に乾くまでスライドを傾けて乾かします。この期間中、一次抗体を一晩染色するためのチャンバーを調製します。単純な染色チャンバは、ddH2Oで満たされた大きな表面積を有する容器と、容器内のステージを含んでもよく、その上にスライドをddH2Oの上に置いてもよい。</li>
	<li>スライドが乾いたら、撥水ペンを使用してティッシュ部分の周りに輪郭を描きます。ステップ4.5では、このアウトラインが抗体混合物が流れ込むのを防ぐバリアとして機能します。</li>
	<li>TBS-TTで一次抗体混合物を調製します。例えば、抗体ストックが1:500の濃度にある場合は、TBS-TTの500μlに特定の抗体を1μl加えます。試薬表に記載されている一次抗体を利用します。</li>
	<li>乾燥させたスライドをステージ上部の染色チャンバーに置きます。一次抗体500μlをゆっくりと加え、表面全体を覆います。装置全体を覆い、アルミホイルで包んで外光を遮断します。室温で一晩放置します。</li>
	<li>翌日、スライドをTBS-Tバッファーで3回、5分間ずつ洗浄します。手順4.2で説明したように、暗い場所で乾かします。</li>
	<li>ステップ4.4と同様に二次抗体混合物を調製します。二次抗体については、試薬表を参照してください。</li>
	<li>ステップ4.2および4.5で説明したように、乾燥させたスライドを染色チャンバーに入れます。二次抗体500μlをゆっくりと加え、表面全体を覆います。染色チャンバーをアルミホイルで包み、外光から保護します。蓋をして外光から保護し、室温で少なくとも2時間</li>放置します。
	<li>二次染色終了後、スライドをTBS-Tバッファーで各5分間、3回洗浄します。暗い場所でスライドを乾かします。乾燥後、埋込液を投入し、気泡の入らないようにスライドをカバースリップで覆います。スライドを暗い場所に少なくとも2時間置いてから、次の分析を行います。</li>
	<li>染色された組織に対してタイムラプス解析または共焦点解析を実行します。</li>
</ol>

<ol><li>Ming, G. L., Song, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+neurogenesis+in+the+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult neurogenesis in the mammalian central nervous system.</a> Annual Reviews of Neuroscience. 28, 223-250 (2005).</li>
<li>Santarelli, L., Saxe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+hippocampal+neurogenesis+for+the+behavioral+effects+of+antidepressants%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement of hippocampal neurogenesis for the behavioral effects of antidepressants.</a> Science. 301 (5634), 805-809 (2003).</li>
<li>Sahay, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+adult+hippocampal+neurogenesis+is+sufficient+to+improve+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation.</a> Nature. 472 (7344), 466-4670 (2011).</li>
<li>Clelland, C. D., Choi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+role+for+adult+hippocampal+neurogenesis+in+spatial+pattern+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation.</a> Science. 325 (5937), 210-213 (2009).</li>
<li>Wang, J. W., David, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+fluoxetine+stimulates+maturation+and+synaptic+plasticity+of+adult-born+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chronic fluoxetine stimulates maturation and synaptic plasticity of adult-born hippocampal granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 28 (6), 1374-1384 (2008).</li>
<li>D'Amico, F., Skarmoutsou, E., Stivala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State+of+the+art+in+antigen+retrieval+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">State of the art in antigen retrieval for immunohistochemistry.</a> Journal of Immunological Methods. 341 (1-2), 1-18 (2009).</li>
<li>Daneshtalab, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+tissue+specificity+and+antibody+selection%3A+Procedures+in+immunohistochemical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting tissue specificity and antibody selection: Procedures in immunohistochemical studies.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 61 (2), 127-135 (2010).</li>
<li>Jang, M. H., Bonaguidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+frizzled-related+protein+3+regulates+activity-dependent+adult+hippocampal+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted frizzled-related protein 3 regulates activity-dependent adult hippocampal neurogenesis.</a> Cell Stem Cell. 12 (2), 215-223 (2013).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> J. Vis. Exp. (65), e3564(2012).</li>
<li>Porcelli, M., Cacciapuoti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-thermal+effects+of+microwaves+on+proteins%3A+Thermophilic+enzymes+as+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Non-thermal effects of microwaves on proteins: Thermophilic enzymes as model system.</a> FEBS Letters. 402 (2-3), 102-106 (1997).</li>
<li>Stone, J. R., Walker, S. A., Povlishock, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+visualization+of+a+new+class+of+traumatically+injured+axons+through+the+use+of+a+modified+method+of+microwave+antigen+retrieval%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">The visualization of a new class of traumatically injured axons through the use of a modified method of microwave antigen retrieval.</a> Acta Neuropathologica. 97 (4), 335-346 (1999).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

抗原回収と前駆細胞型の染色を成功させるための最も重要なステップは、1)最適な冠状膜の厚さの十分に灌流され固定された組織を利用することです。2)抗原回収中の沸騰とその後の冷却に十分な時間を確保する。3)固定冠状切片を取り付け、その際の損傷を防ぐ手先の器用さ。
IHC では、十分な固定を受けたが過剰固定ではない灌流組織を使用することが重要です。主な問題は、抗原が抗体にアクセスできないことです。私たちの方法は、アクセシビリティを向上させるように設計されています。最初のステップとして、手術中およびその後の固定中に動物に正しく灌流することが不可欠です。私たちのプロトコルでは、脳を抽出する前に、4%PFAを少なくとも5分間動物を通して灌流させます。その後、抽出した脳を4%PFAで少なくとも12時間、最大24〜36時間放置することが重要であると考えています。これはPFAの最適な期間であり、期間が長いと組織が過剰に固定され、より多くのタンパク質架橋が導入される可能性があります。PFA 固定後、脳は組織の生存率に影響を与えることなく、無期限にスクロース中に放置される可能性があります。組織学的分析の準...

神経新生は、神経幹細胞から新しいニューロンを生成するもので、現在では脳の2つの特殊な領域で成人期まで常に発生することが知られています。これらには、嗅球の脳室下ゾーン(SVZ)と海馬の歯状回の顆粒下ゾーン(SGZ)が含まれます。過去10年間で、成体海馬の神経新生の分野は重要な研究が見られました。この領域は、SGZの新生ニューロンが特定の脳機能を維持できる神経可塑性の増強に寄与するため、大きな関心を集めています1-5。 成体海馬のニューロン新生は、気分の調節、再生、学習と記憶に重要な役割を果たすことが示唆されています。したがって、この豊かな神経原性ニッチにおけるニューロンの発達と調節を理解するための協調的な努力がなされてきました。
成体の海馬ニューロン新生を研究する上で避けられない重要な側面は、活性化された神経幹細胞が完全に機能するニューロンになる過程で通過する別々の段階を特定することです。このプロセスでは、静止神経幹細胞が活性化され、一連の初期活性および後期活性前駆細胞タイプを通過します(図1)。これらの神経前駆細胞の異なる集団は、形態と、RGLのそれぞれの前駆細胞タイプへの変換を導くMCM2、ネスチン、Tbr2、ダブルコルチン(DCX)、NeuNなどの分子マーカーの発現によって同定できます。ネスチンは、放射状グリア様細胞と一部の初期前駆細胞タイプに発現する中間フィラメントタンパク質です。別のマーカーは、増幅前駆細胞に特異的に発現するTbr2です。Tbr2導入遺伝子の発現は、最初にタイプ1細胞(橈骨グリア様)でオフになり、タイプ2a、タイプ2ab、およびタイプ2bの前駆細胞全体でオンになり、より分化したタイプ3および未成熟ニューロンの間でスイッチオフされます(図1)。DCXは、Type-2ab、Type-2b、およびType-3神経前駆細胞に発現するニューロン移動マーカーです。この3つのマーカーの組み合わせを使用して、神経前駆細胞の異なるサブタイプをラベル付けできます。これらには、タイプ1(MCM2 + nestin + Tbr2-)、タイプ2a(MCM2 + nestin + Tbr2 +)、タイプ2ab(一部MCM2 + nestin-Tbr2 +および部分MCM2 + Tbr2 + DCX-)、タイプ2b(MCM2 + Tbr2 + DCX +)およびタイプ3(MCM2 + Tbr2-DCX+)が含まれます。 未成熟ニューロンや機能統合ニューロンなどの有糸分裂後細胞は、DCXと成熟ニューロンマーカーであるNeuNを利用することで同定できます。
従来のIHCの方法は、遺伝子発現に基づいて特定の細胞タイプの抗原を特定するために抗体を利用します。その後、共焦点顕微鏡などの高解像度イメージング技術による可視化を、それらの同定に利用することができます。しかし、現在、これらの方法には、放射状グリア様細胞や初期の前駆細胞タイプを効率的に同定できない問題があります。これらの特定の細胞タイプを特定することは困難ですが、これは、適用された抗体がネスチンタンパク質に浸透して効率的に結合することができないためです。ネスチンは、放射状グリア様細胞によって産生される放射状突起を構成する中間フィラメントタンパク質です。抗体の抗原への非効率的な結合は、固定時間、温度、および利用される技術を含む多くの要因の結果であり得る6-7。 そこで、私たちは抗原賦活化法、すなわち「煮沸」法を開発しました。ネスチン以外にも、この抗原賦活化法は、Ki67、BrdU、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、Tbr2、MCM2などの他のマーカーの染色も改善します。私たちの方法は、化学的アプローチと物理的アプローチを組み合わせたものです。これには、パラホルムアルデヒドへの組織の化学的固定と、それに続く変性剤およびカオトロピック処理の緩衝液中の薄い冠状海馬切片の高温沸騰が含まれます。これにより、抗原の抗体へのアクセシビリティが向上し、抗体特異性が向上し、前駆細胞タイプの同定が向上します。私たちのアプローチは使いやすく、ほとんどの場合、研究室ですでに利用可能なツールと試薬が必要です。私たちは、神経幹細胞の発生と、内因性遺伝的または外因性環境因子8を介した神経幹細胞の制御を研究するために広く利用してきました。

<table><tbody><tr><td>SuperFrost Plus スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td>沸騰時に海馬組織に強く付着します</td></tr><tr><td>PVA/DABCO 封入剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10981-100 ml</td><td> </td></tr><tr><td>ネスティン (鶏肉) </td><td>アベスラボ</td><td>NES</td><td>神経幹細胞マーカー</td></tr><tr><td>GFAP (ウサギ)</td><td>Dako North America</td><td>Z033401-2</td><td>アストロサイトおよび神経幹細胞マーカー</td></tr><tr><td>MCM2 (マウス)</td><td>BD Transduction Laboratory</td><td>610701</td><td>増殖マーカー</td></tr><tr><td>DCX (ヤギ)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC8066</td><td>未熟ニューロンマーカー</td></tr><tr><td>Tbr2 (ウサギ)</td><td>Abcam</td><td>Ab23345</td><td>増幅前駆細胞マーカー</td></tr><tr><td>NeuN (マウス)</td><td>ミリポア</td><td>MAB377</td><td>成熟ニューロンマーカー</td></tr><tr><td>Cy2 (抗ウサギ)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-226-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy2(抗チキン)</td><td>ジャクソン・イムノリサーチ</td><td>303-165-006</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5(抗マウス)</td><td>ジャクソン・イムノリサーチ</td><td>315-175-047</td><td> </td></tr><tr><td>Cy5(抗ヤギ)</td><td>ジャクソン・イムノリサーチ</td><td>305-165-047</td><td> </td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ライフテクノロジーズコーポレーション</td><td>D1306</td><td> </td></tr><tr><td>ダコペン</td><td>S2002</td> ダ<td>コ</td><td>撥水ペン</td></tr></tbody></table>

熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

組織固定後の免疫組織化学(IHC)の伝統的な方法により、さまざまな細胞タイプの可視化が可能になります。これらは通常、抗原に結合するための抗体の適用を進め、固有の生物学と発生の機能である特性を持つ細胞を同定します。成体海馬の神経新生は、静止状態の神経幹細胞が活性化され、増殖、分化、成熟、機能統合の段階を経て進行する連続的なプロセスです。各フェーズは、遺伝子の特徴的な形態とアップレギュレーションによって区別されます。これらの段階の特定は、作用している調節メカニズムと、衰弱性疾患の病態生理学の根底にあるこのプロセスの変化を理解するために重要です。当社の熱誘起抗原賦活化アプローチは、検出されるシグナルの強度を向上させ、前駆細胞の種類を正しく同定することを可能にします。この論文で説明したように、特に、特定の前駆細胞タイプの検出における現在の問題を回避することができます。

成体海馬の神経新生は連続的なプロセスであり、各段階における代表的な前駆細胞型は、複数のマーカーを組み合わせることで特定できます。適切な化学固定と抗原賦活化を行うことで、通常では検出が困難なマーカーの有効性とアクセシビリティを向上させることができます。その一つがnestinであり、これは放射状グリア様神経幹細胞および一部の初期活性前駆細胞型で発現しています。幹細胞や前駆細胞がその後に成熟したニューロンへと分化するとnestinの発現は消失するため、nestinは初期前駆細胞型を特定するための重要なタンパク質となり得ます。
SGZで起こる成体海馬神経新生の連続的なプロセスの模式図をFigure 1Aに示す。このプロセスは、有糸分裂ステージとポストミトティックステージに分けられる。同定を可能にする遺伝子マーカーを、その発現スペクトラムに沿って示している。放射状グリア様神経幹細胞は、GFAPおよび放射状突起を構成する中間フィラメントタンパク質であるnestinの発現によって同定できる。静止期および活発に分裂している放射状グリア様細胞は、有糸分裂前駆細胞タイ...

成体の海馬神経新生では、静止状態の神経幹細胞が順次進行し、回路内で機能的に統合されたニューロンに発達するときに、異なる遺伝マーカーのセットが発現します。熱誘起抗原賦活化により、他の方法では検出が困難な前駆細胞の種類を同定し、より効果的に同定します。

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

この手順の全体的な目的は、海馬の脳組織に対して抗原賦活化を行い、新生ニューロンとなる前駆細胞タイプをより明確に可視化することです。まず、灌流後のマウス脳を採取して薄い冠状断切片を作成し、これらの切片を組織への強力な接着用に設計されたガラススライドにマウントします。次に、組織が載ったスライドを抗原賦活化処理剤とともに煮沸し、その後十分に冷却させます。次に、一次抗体を用いて組織を一晩染色します。最終ステップとして、翌日に組織を少なくとも2時間、二次抗体で染色します。最終的に、タイムラプス顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて、海馬組織の成体神経発生における様々な発達段階における各種プロジェンダー細胞（pro gender cell）を可視化します。こんにちは。私はポストドクターのHun Joです。Dr.Ian Johnの研究室およびメイヨークリニックに所属しています。John研究室での主な研究焦点は、神経学的および精神医学的疾患における神経新生のプロセスを調査することです。私たちの最終的な目標は、そのような知見を治療への応用にうまく変換することであり、本動画では、私たちの研究室のQuam Huiとhi Johnと共に、抗原リトリーバーの手順を実演します。本手法の既存の免疫組織化学的手法に対する主な利点は、成体海馬の神経発生における異なる細胞種を効果的に可視化できる点にあります。通常は検出が困難な前駆神経幹細胞を含むこれらの細胞種を、本手法の抗原賦活化法を用いることで効率的に標識し、可視化することが可能です。この手法は、成体海馬の神経発生における新生ニューロンの発達と制御に関する知見を提供します。精神疾患の研究および薬理学的治療に関心がある方にとって、本抗原賦活化法は、これらの疾患における神経発達の役割を調査する際に有用です。発症機序について。灌流後のマウス脳を4%para formaldehydeを含む10 milliliterコニカルチューブに入れ、4 °Cで一晩、または完全な固定のために少なくとも12～24時間（ただし36時間を超えない範囲で）静置し、手順を開始してください。一晩の固定後、PFAを除去し、脳をコニカルチューブ内に保持します。次に、脳を30%sucroseでリンスして残留PFAを除去し、sucroseを廃棄します。その後、チューブに再び30%sucroseを満たし、脳がチューブの底に沈むまで4°Cで保持します。その後、ミクロトームを用いて海馬を40 µmの脳切片に作成します。免疫組織化学染色を行うまで、切片を抗凍結溶液中に保存します。その後、組織への密着性が高い専用の顕微鏡スライドガラスに切片を貼付します。組織を貼付した後、スライドガラスを約10分間乾燥させます。スライドをペーパータオルの上で垂直な面に立てかけておくことで、以前に使用した化学物質を完全に除去し、乾燥を早めることができます。スライドが乾いたら、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。その後、再び乾燥させてください。この手順では、付属の原稿に記載されている通りに組織煮沸用の溶液を調製します。次に、標準的な電子レンジを標準設定で用い、溶液を5分間加熱して沸騰させます。沸騰が完了したら、容器を電子レンジから慎重に取り出します。その後、乾燥させたスライドを溶液に移します。海馬切片がある面が完全に溶液に浸かっていることを確認してください。可能であれば、スライドを容器の壁に沿って傾けて配置し、その周囲に他のスライドを積み重ねます。次に、スライドを入れた混合液を標準設定の電子レンジで7分間加熱し、沸騰させます。その間に、2つのアイスバケットに氷を半分まで満たしておきます。沸騰が終わったら、容器を電子レンジから取り出し、アイスバケットの1つに入れます。別のバケツに残っている氷を容器の周囲に注ぎ、完全に覆います。その後、1時間そのままにしておきます。容器からスライドを取り出します。TBST緩衝液で5分間ずつ3回洗浄します。次に、スライドを暗所で5〜10分間、または完全に乾くまで乾燥させます。その間に、一次抗体で一晩染色するためのDDH₂Oを入れたチャンバーを準備します。スライドが乾燥したら、撥水性のペンを使用して組織切片の周囲にアウトラインを描きます。このアウトラインは、抗体混合液が流れ出すのを防ぐバリアとして機能します。次に、T-B-S-T-Tで一次抗体混合液を調製します。乾燥させたスライドを染色槽内のステージに配置します。一次抗体500 µLを、表面全体を覆うようにゆっくりと加えます。その後、染色槽に蓋をして外光を遮断し、室温で一晩保持します。翌日、TBSTバッファーを用いて、5分間×3回の洗浄をスライドに行います。その後、暗所で乾燥させます。次に、T-B-S-T-Tで二次抗体混合液を調製します。その後、乾燥させたスライドを染色チャンバーに入れます。二次抗体を500 µL添加します。染色チャンバーをゆっくりと蓋し、二次染色の完了後、室温で少なくとも2時間、外光を遮断して保持します。その後、TBSTバッファーを用いて、5分間ずつ3回スライドを洗浄します。暗所でスライドを乾燥させた後、封入剤をスライドに添加します。気泡が混入しないよう、注意深くカバーガラスを被せます。その後、後続の解析や、染色した組織のタイムラプス解析または共焦点解析を行うまで、スライドを少なくとも2時間暗所で保管してください。成体海馬の神経新生は、歯状回の顆粒細胞下層に沿って描出されます。活性化された放射状グリア様タイプ1幹細胞は、分化、成熟し、複雑な形態を伴って神経回路へと機能的に組み込まれるまで、いくつかの異なる段階を経ます。各段階およびそれぞれの細胞型は、組み合わせたマーカーの発現に基づいて識別できます。MCM2はすべての有糸分裂前駆細胞型で発現している増殖マーカーであり、Nesは放射状および非放射状グリア様幹細胞で発現しています。タイプ2 A前駆細胞が分化する際、まずnestinの発現が消失します。ポストミトティック前駆細胞ではTBR2の発現が増加し、MCM2の発現が失われる一方で、DCXおよびNEUNの発現が機能的なニューロンへの移行と成熟を制御します。これは、紫色のMCM2、緑色のnestin、および赤色のDAPI染色の代表的な共焦点画像です。枠内の拡大画像は、nestin、MCM2、およびdpiを発現する放射状GL様前駆細胞を示しています。ここでは、MCM2（青）、TBR2（赤）、DCX（緑）、およびdpi（灰色）の代表的な共焦点画像を示します。MCM2、TBR2、DCX、およびdpiを発現するタイプ2B前駆細胞の特性を示す染色結果が、枠内の拡大画像に示されています。この手順を行う際は、3つの重要な点に留意してください。1つ目は、適切に灌流・固定され、適切な冠状断の厚さを持つ組織を使用することです。2つ目は、組織をスライド上に平らにマウントし、その際に組織に損傷を与えないようにすることです。そして最後に、3番目として、抗原賦活化の際の煮沸およびその後の冷却に十分な時間を設けます。この手順の後、共焦点組織再構築や行動実験などの他の手法を行うことで、新生ニューロンがどのように海馬回路に組み込まれ、認知機能に寄与するかという追加の疑問を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、海馬の神経発生過程で新しいニューロンを生じさせる代表的な細胞型をより効果的に可視化するために、海馬組織に抗原賦活化を行う方法について十分に理解できたはずです。

heat-induced-antigen-retrieval-an-effective-method-to-detect-identify

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

熱誘導抗原回復：成体の海馬神経新生中の前駆細胞タイプを検出・同定するための効果的な方法

このビデオは、成体海馬の神経新生を調べるために使用される免疫蛍光染色法を示しています。最初に、マウスの脳切片は、ニューロン前駆細胞のニューロン新生に関連するマーカータンパク質に向けられた一次抗体による治療を受けます。次に、蛍光色素でタグ付けされた二次抗体で標識します。次に、脳切片を共焦点顕微鏡で観察し、マーカータンパク質の異なる組み合わせの発現パターンに基づいて、前駆細胞のさまざまなサブタイプを区別します。...

成体海馬神経新生を検出するための免疫蛍光染色法

このビデオでは、EdU取り込みを使用して脳組織切片で新たに増殖した神経幹細胞を染色し、続いて免疫蛍光法で特定のタンパク質を可視化する手順を示し、細胞の動態と増殖の理解を深めます。...

マウス脳切片における増殖神経幹細胞の可視化のための免疫蛍光染色

このビデオ記事は、同じ組織切片内の成体海馬ニューロン新生のすべての段階を検出し定量化するための包括的なプロトコルを示しています。私たちは、異なる宿主種からの適切な抗体が利用できない場合に生じる間接的な多重免疫蛍光の限界を克服する方法を詳しく説明しました。...

大人の海馬神経新生を研究するために、同じホスト種由来の抗体による免疫組織化学および複数のラベル

我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。...

神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。...

成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節

この論文では、ラットの成体神経新生を測定するためにBrdU陽性細胞を視覚化するための最も一般的な4つの技術を紹介します。この作業には、試薬調製、チミジンアナログ投与、経心灌流、組織調製、ペルオキシダーゼ免疫組織化学反応、免疫蛍光、シグナル増幅、対比染色、顕微鏡イメージング、および細胞分析の指示が含まれます。...

チミジン類似体BrdUを用いたラットの細胞増殖と神経新生を解析するための免疫組織化学技術

自己免疫性脳炎は、中枢神経系の抗体媒介性疾患の新しいカテゴリーです。海馬ニューロンは、これらの抗体を発見し、特徴付けるために使用することができる。この記事では、患者の血清および脳脊髄液中の自己抗体を決定するための初代細胞培養および免疫染色のプロトコルを提供します。...

自己免疫性脳炎に関与する新しい病原性抗体を検出および研究するための海馬神経培養

ニューロンプログラミングによって生成されたヒト多能性幹細胞由来のGABA作動性ニューロンの移植は、神経発達障害の潜在的な治療アプローチとなる可能性があります。このプロトコルは、ヒト幹細胞由来のGABA作動性ニューロン前駆体の生成と新生児マウスの脳への移植を記述しており、移植されたニューロンの長期的な調査とその治療可能性の評価を可能にします。...

ヒト幹細胞由来GABA作動性ニューロンの生後早期マウス海馬への移植による神経発達障害緩和

ここでは、マウス歯状回から単離された単一の核を配列決定する方法を紹介し、蛍光活性化核(FAN)ソーティングによってほとんどのニューロンを除外します。このアプローチは、高品質の発現プロファイルを生成し、神経幹細胞などの希少な集団を含む、ニッチに代表される他のほとんどの細胞タイプの研究を容易にします。...

海馬神経原性ニッチを研究するための単一核RNAシーケンシングと組み合わせたニューロンの蛍光活性化核ネガティブソーティング

学ぶ熱誘導抗原賦活化法でマウス海馬組織の前駆細胞型を可視化し、成体神経新生における神経幹細胞の分化段階を明らかにする手法。この技術は神経科学および細胞生物学研究に有用です。

熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法

さらに動画を探す