熱誘導抗原賦活化:成体海馬神経新生における前駆細胞型の検出および同定に有効な方法

この手順の全体的な目的は、海馬の脳組織に対して抗原賦活化を行い、新生ニューロンとなる前駆細胞タイプをより明確に可視化することです。まず、灌流後のマウス脳を採取して薄い冠状断切片を作成し、これらの切片を組織への強力な接着用に設計されたガラススライドにマウントします。次に、組織が載ったスライドを抗原賦活化処理剤とともに煮沸し、その後十分に冷却させます。

次に、一次抗体を用いて組織を一晩染色します。最終ステップとして、翌日に組織を少なくとも2時間、二次抗体で染色します。最終的に、タイムラプス顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いて、海馬組織の成体神経発生における様々な発達段階における各種プロジェンダー細胞（pro gender cell）を可視化します。

こんにちは。私はポストドクターのHun Joです。Dr.Ian Johnの研究室およびメイヨークリニックに所属しています。John研究室での主な研究焦点は、神経学的および精神医学的疾患における神経新生のプロセスを調査することです。私たちの最終的な目標は、そのような知見を治療への応用にうまく変換することであり、本動画では、私たちの研究室のQuam Huiとhi Johnと共に、抗原リトリーバーの手順を実演します。

本手法の既存の免疫組織化学的手法に対する主な利点は、成体海馬の神経発生における異なる細胞種を効果的に可視化できる点にあります。通常は検出が困難な前駆神経幹細胞を含むこれらの細胞種を、本手法の抗原賦活化法を用いることで効率的に標識し、可視化することが可能です。この手法は、成体海馬の神経発生における新生ニューロンの発達と制御に関する知見を提供します。

精神疾患の研究および薬理学的治療に関心がある方にとって、本抗原賦活化法は、これらの疾患における神経発達の役割を調査する際に有用です。発症機序について。灌流後のマウス脳を4%para formaldehydeを含む10 milliliterコニカルチューブに入れ、4 °Cで一晩、または完全な固定のために少なくとも12～24時間（ただし36時間を超えない範囲で）静置し、手順を開始してください。一晩の固定後、PFAを除去し、脳をコニカルチューブ内に保持します。

次に、脳を30%sucroseでリンスして残留PFAを除去し、sucroseを廃棄します。その後、チューブに再び30%sucroseを満たし、脳がチューブの底に沈むまで4°Cで保持します。その後、ミクロトームを用いて海馬を40 µmの脳切片に作成します。

免疫組織化学染色を行うまで、切片を抗凍結溶液中に保存します。その後、組織への密着性が高い専用の顕微鏡スライドガラスに切片を貼付します。組織を貼付した後、スライドガラスを約10分間乾燥させます。

スライドをペーパータオルの上で垂直な面に立てかけておくことで、以前に使用した化学物質を完全に除去し、乾燥を早めることができます。スライドが乾いたら、PBSで5分間ずつ3回洗浄します。その後、再び乾燥させてください。

この手順では、付属の原稿に記載されている通りに組織煮沸用の溶液を調製します。次に、標準的な電子レンジを標準設定で用い、溶液を5分間加熱して沸騰させます。沸騰が完了したら、容器を電子レンジから慎重に取り出します。

その後、乾燥させたスライドを溶液に移します。海馬切片がある面が完全に溶液に浸かっていることを確認してください。可能であれば、スライドを容器の壁に沿って傾けて配置し、その周囲に他のスライドを積み重ねます。

次に、スライドを入れた混合液を標準設定の電子レンジで7分間加熱し、沸騰させます。その間に、2つのアイスバケットに氷を半分まで満たしておきます。沸騰が終わったら、容器を電子レンジから取り出し、アイスバケットの1つに入れます。

別のバケツに残っている氷を容器の周囲に注ぎ、完全に覆います。その後、1時間そのままにしておきます。容器からスライドを取り出します。

TBST緩衝液で5分間ずつ3回洗浄します。次に、スライドを暗所で5〜10分間、または完全に乾くまで乾燥させます。その間に、一次抗体で一晩染色するためのDDH₂Oを入れたチャンバーを準備します。

スライドが乾燥したら、撥水性のペンを使用して組織切片の周囲にアウトラインを描きます。このアウトラインは、抗体混合液が流れ出すのを防ぐバリアとして機能します。次に、T-B-S-T-Tで一次抗体混合液を調製します。

乾燥させたスライドを染色槽内のステージに配置します。一次抗体500 µLを、表面全体を覆うようにゆっくりと加えます。その後、染色槽に蓋をして外光を遮断し、室温で一晩保持します。翌日、TBSTバッファーを用いて、5分間×3回の洗浄をスライドに行います。

その後、暗所で乾燥させます。次に、T-B-S-T-Tで二次抗体混合液を調製します。その後、乾燥させたスライドを染色チャンバーに入れます。

二次抗体を500 µL添加します。染色チャンバーをゆっくりと蓋し、二次染色の完了後、室温で少なくとも2時間、外光を遮断して保持します。その後、TBSTバッファーを用いて、5分間ずつ3回スライドを洗浄します。暗所でスライドを乾燥させた後、封入剤をスライドに添加します。

気泡が混入しないよう、注意深くカバーガラスを被せます。その後、後続の解析や、染色した組織のタイムラプス解析または共焦点解析を行うまで、スライドを少なくとも2時間暗所で保管してください。成体海馬の神経新生は、歯状回の顆粒細胞下層に沿って描出されます。

活性化された放射状グリア様タイプ1幹細胞は、分化、成熟し、複雑な形態を伴って神経回路へと機能的に組み込まれるまで、いくつかの異なる段階を経ます。各段階およびそれぞれの細胞型は、組み合わせたマーカーの発現に基づいて識別できます。MCM2はすべての有糸分裂前駆細胞型で発現している増殖マーカーであり、Nesは放射状および非放射状グリア様幹細胞で発現しています。

タイプ2 A前駆細胞が分化する際、まずnestinの発現が消失します。ポストミトティック前駆細胞ではTBR2の発現が増加し、MCM2の発現が失われる一方で、DCXおよびNEUNの発現が機能的なニューロンへの移行と成熟を制御します。これは、紫色のMCM2、緑色のnestin、および赤色のDAPI染色の代表的な共焦点画像です。

枠内の拡大画像は、nestin、MCM2、およびdpiを発現する放射状GL様前駆細胞を示しています。ここでは、MCM2（青）、TBR2（赤）、DCX（緑）、およびdpi（灰色）の代表的な共焦点画像を示します。MCM2、TBR2、DCX、およびdpiを発現するタイプ2B前駆細胞の特性を示す染色結果が、枠内の拡大画像に示されています。

この手順を行う際は、3つの重要な点に留意してください。1つ目は、適切に灌流・固定され、適切な冠状断の厚さを持つ組織を使用することです。2つ目は、組織をスライド上に平らにマウントし、その際に組織に損傷を与えないようにすることです。

そして最後に、3番目として、抗原賦活化の際の煮沸およびその後の冷却に十分な時間を設けます。この手順の後、共焦点組織再構築や行動実験などの他の手法を行うことで、新生ニューロンがどのように海馬回路に組み込まれ、認知機能に寄与するかという追加の疑問を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、海馬の神経発生過程で新しいニューロンを生じさせる代表的な細胞型をより効果的に可視化するために、海馬組織に抗原賦活化を行う方法について十分に理解できたはずです。