C.エレガンスゲノムへの高透過率の染色体外アレイを組み込むための迅速なプロトコール

本手順の全体的な目的は、紫外線照射を用いて、トランスジェニックな染色体外アレイをC. elegansのゲノムに組み込むことです。まず、伝達率が可能な限り高い、理想的には80%以上のトランスジェニック系統を選択します。次に、選択したトランスジェニックなL4幼虫に紫外線照射を行い、選択した各F1プレートから蛍光を発するトランスジェニックなF2個体を4匹ずつ選別します。その後、F2プレートをスクリーニングして、100%蛍光を発するトランスジェニック個体を確認します。

F3世代の個体を交配させます。最終的にF3世代の蛍光個体を選択することで、トランスジーンの100%の遺伝を確認できます。この実験的アプローチは、余剰染色体アレイを高率で伝達するトランスジェニック系統に適しています。

手順のデモンストレーションを行うのは、当研究室の技術者であるStephanie Belmanです。線虫増殖用培地を入れた大型ペトリ皿500枚を用意します。各プレートに、飽和濃度のisia coliを0.3 millilitersずつ播種してください。

OP 50培養。組み込み予定の各トランスジェニック系統について、伝播率を評価します。蛍光ステレオ顕微鏡下で、蛍光を発している成体10匹をそれぞれ別の10枚の培養プレートにピックアップします。

動物を、遺伝的背景の繁殖が可能な温度に設定した線虫インキュベーターに入れます。毎日子孫を観察し、共注射マーカーがどの発生段階で発現し、蛍光顕微鏡を用いて最適に観察できるかを評価します。蛍光を発する子孫の割合を算出することで、子孫への伝達率を評価します。

導入遺伝子の組み込みには、伝達率が最も高い形質転換系統を選択します。L4幼虫期に同期させた形質転換動物の集団を準備します。組み込みのため、蛍光を発するGRA成虫30匹を5枚の培養プレートにピックアップします。

線虫を15 °Cで3〜4時間産卵させた後、1プレートあたり少なくとも30個の卵が存在することを確認し、プレートから成虫を除去します。その後、子世代がL4幼虫期に達するまで線虫インキュベーターで培養します。蛍光トランスジェニックL4動物を15〜20匹含む各プレートの蓋を取り外し、UVクロスリンカーに設置して、線虫に放射照射を行い、回復させます。放射照射した線虫を15 °Cで一晩インキュベートします。

生存している個体数を確認します。効率的な放射線照射には、生存率が80～90%程度になるように調整します。共注入マーカーの発現が観察可能な発生段階まで、照射した個体を15～25 °Cで飼育します。

単一の蛍光を発するF1個体を、それぞれ別々の培養プレートに移します。使用した共マーカーに応じて、子世代が蛍光F2個体の観察に適した段階に達するまで、これらのF1プレートを15〜25°Cで保持します。本ケースでは、成虫となってから線虫を観察しました。F1個体が不妊であったか死亡したことを示す「子世代が1匹またはいない」プレート、あるいはF1個体が期待される率でトランスジーンを伝達しなかったことを示す「蛍光F2個体がいない、またはごく少数である」プレートはすべて廃棄しました。

選択した各F1プレートから、蛍光トランスジェニックF2個体を4匹ずつ選別します。蛍光トランスジェンを使用する場合、統合アレイのホモ接合体である可能性が高いため、蛍光強度の高いF2個体を選んでください。F2個体を選別する際、次のステップでの偽陰性を避けるため、卵や幼虫を一緒に持ち込まないことが極めて重要であることに注意してください。

F2個体を育成した後、F2プレートをスクリーニングして、100%蛍光を発するトランスジェニックなF3ワームを確認します。非蛍光のワームが1匹でも存在すればそのプレートは廃棄するため、スクリーニングは非常に迅速に行えます。選択したプレートから蛍光を発するF3個体を8匹個別に分離し、トランスジェーンが100%継承されていることを確認します。可能であれば、独立した複数の統合トランスジェニック系統を維持してください。

2つの異なる系統において、ほぼ同じ頻度で染色体外アレイを伝達するトランスジェンの組み込みを行いました。標準プロトコルと改良プロトコルを用いて比較したところ、組み込み系統あたりに必要な時間およびプレート数が、改良プロトコルにおいて最適化されました。次に、非組み込み系統におけるトランスジェンの伝達率が高いほど、ゲノムへのトランスジェンの組み込みが容易になるという仮説を検証しました。

特定のトランスジェンを、改善されたプロトコルを用いて、異なる伝達率を持つ系統に組み込み、最も伝達率の高い系統を抽出しました。選択したF1個体わずか90匹から3つの組み込み系統が得られた一方で、伝達率が50〜60%のトランスジェニック系統では、選択したF1個体110匹から1つの組み込み系統が得られました。この手順に続き、遺伝子発現、発現パターンおよび調節の決定、タンパク質の局在化および過剰発現、あるいはサブセルラーマーカーの開発など、追加の疑問を解決するためにさまざまな手法を実施することが可能です。