C.エレガンスゲノムへの高透過率の染色体外アレイを組み込むための迅速なプロトコール

この手順の全体的な目標は、紫外線照射を使用してトランスジェニックな余分な染色体アレイを鋸歯状遺伝子に組み込むことです。まず、可能な限り高い透過率、理想的には80%より大きいトランスジェニック系統を選択し、次に、選択されたトランスジェニックLの4匹の幼虫をUV照射し、選択された各F1プレートから蛍光トランスジェニックF 2匹の動物のうちの4匹を選び出す。次の画面は、100%蛍光トランスジェニック用のF2プレートです。

F3つのワーム。最終的にF 3世代の蛍光動物を選ぶと、導入遺伝子の100%の遺伝を示すことができます。この実験的アプローチは、余分な染色体アレイを高速で伝達するトランスジェニック系統に適しています。

手順を実演するのは、私たちの研究室の技術者であるステファニー・ベルマンです。線虫の成長が入った500枚の大きなシャーレから始めます。ミディアム 各プレートに0.3ミリリットルの飽和大腸菌を植えます。

OP 50の文化。各トランスジェニックラインについて、統合するトランスジェニックラインの伝送速度を評価します。10匹の蛍光重力成体を、蛍光立体視鏡培養下で10個の別々の培養プレートに選んでください。

ワームインキュベーター内の動物は、遺伝的背景の繁殖に許容される温度に設定します。子孫を毎日モニタリングして、共注入マーカーが発現し、蛍光透視法を使用して最もよく観察できる発達段階を評価します。蛍光子孫の割合を決定することにより、子孫の透過率を評価します。

導入遺伝子の統合には、伝達速度が最も高いトランスジェニック系統を選択します。L 4幼虫期に同期したトランスジェニック動物の集団を取得します。統合には、30匹の蛍光GRA成体を5つの培養プレートに選んでください。

ワームが摂氏15度で3〜4時間卵を産んだ後、プレートごとに少なくとも30個の卵の存在を確認し、その後、プレートから成虫を排除し、子孫がL 4幼虫期に達するまでワームインキュベーターで動物を培養します。15〜20匹の蛍光トランスジェニックL 4匹を含む各プレートを、蓋を外した状態でUV架橋剤に入れ、回復のために線虫に照射します。照射した線虫を15°Cで一晩インキュベートします。

私たちの手の中で生きている動物の数を確認してください。80〜90%程度の生存率が効率的な照射に適しています。照射した動物を15°Cから25°Cで成長させ、子孫が発生段階に達するまで育てることで、共注入マーカーの発現を観察することができます。

蛍光F1の単一動物を別々の培養プレートに移します。これらのF1プレートは、使用するCOマーカーに応じて、子孫が蛍光F2動物の観察に適した段階に達するまで、摂氏15〜25度に保ちます。この特定のケースでは、成虫としての線虫が、F1動物が不妊または死亡したことを示す子孫が1つまたはまったくない、または少数の蛍光F 2動物を示すすべてのF1プレートを廃棄するのを観察しました。これは、F1動物が期待された速度で導入遺伝子を伝達しなかったことを示しています。

選択した各F1プレートから4匹の蛍光トランスジェニックF、2匹の動物を選び出します。蛍光導入遺伝子を使用する場合は、高レベルの蛍光を持つ2種類の線虫をF種選択してください。これは、これらの動物が統合アレイに対してホモ接合体であることを示している可能性があるためです。F 2匹を選ぶときは、次のステップで偽陰性を避けるために、卵や幼虫を運ばないことが重要であることに注意してください。

F two動物を成長させた後、100%蛍光トランスジェニックF threeワームのF twoプレートをスクリーニングします。1匹の非蛍光線虫の存在は、プレートを捨てるべきであることを示しているため、スクリーニングは非常に迅速で、選択したプレートから8匹の蛍光F3匹を選び出し、導入遺伝子の100%の遺伝を確認します。可能であれば、いくつかの独立した統合トランスジェニック株を保管してください。

導入遺伝子を2つの異なる系統に統合し、ほぼ同じ頻度で追加の染色体アレイを伝達しました。標準プロトコルと改良されたプロトコルを使用して、統合されたラインごとに必要なプレートの時間と数が、改良されたプロトコルで最適化されます。次に、非統合系統での導入遺伝子の伝達率が高いほど、導入遺伝子のゲノムへの統合が容易になるという仮説を検証しました。

1つの特定の導入遺伝子を、最も透過率の高いラインの改良されたプロトコルを使用して、異なる速度で送信するラインに統合されました。選択されたF1動物90頭からのみ3つの統合系統が回収されましたが、50〜60%で送信するトランスジェニック系統については、110頭の選択されたF1動物から1つの統合系統が回収されました。この手順に続いて、遺伝子発現の決定、パターンと調節、タンパク質の局在化とタンパク質の過剰発現、細胞内マーカーの開発などの追加の質問に答えるために、さまざまな方法を実行できます。