Name: ????????V???????????????????I????????????????PCR??????????? (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶ multiplex PCR法によるMRSAのSCCmec型I-V迅速スクリーニングとタイピング。加熱による簡易DNA抽出とゲル電気泳動を用い、従来法より効率的に薬剤耐性菌の疫学追跡を支援する。

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この研究で使用したいくつかの参照株の親切な贈り物に対して、T. Ito、K. Hiramatsu、R. Daum、H. de Lencastre、およびD. Colemanに感謝します。この研究は、アルバータ州カルガリー/カルガリー研究所サービス/カルガリー大学の抗菌薬耐性センター(CAR)によって部分的に財政的に支援されました。

?????????????????????????2????????????????????????????????????????????????????? 1?????<ol><li> MRSA???????????????????? PCR???????????????????????MRSA?????????????????????(TSA)???????????????????????????????????????????????? 37?????????????</li><li> 1.5 ml?????????????????75

<ol><li>IWG-SCC. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classification+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+%28SCCmec%29%3A+guidelines+for+reporting+novel+SCCmec+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).</li>
<li>Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+Reporting+Novel+mecA+Gene+Homologues%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).</li>
<li>Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissemination+of+new+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+clones+in+the+community%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community.</a> Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).</li>
<li>Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+multiplex+PCRs+for+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+assignment%3A+rapid+identification+system+for+mec%2C+ccr%2C+and+major+differences+in+junkyard+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).</li>
<li>Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+rapid+identification+of+structural+types+and+variants+of+the+mec+element+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+to+the+multiplex+PCR+strategy+for+assignment+of+mec+element+types+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).</li>
<li>Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+strategy+for+subtyping+the+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+IV+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%3A+%27SCCmec+IV+multiplex%27%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Antimicrobial+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'.</a> Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+multiplex+PCR+assay+for+characterization+and+concomitant+subtyping+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+multiplex+PCR+assay+for+typing+of+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+types+I+to+V+in+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).</li>
<li>de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one-step+microbial+DNA+extraction+method+using+%22Chelex+100%22+suitable+for+gene+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Research+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification.</a> Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+PCR+assay+to+facilitate+identification+of+the+recently+described+Staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type+VIII%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Probes%22%5BJournal%5D)">Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII.</a> Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).</li>
<li>Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+staphylococcal+cassette+chromosome+mec+type%2C+tentatively+designated+type+VIII%2C+harboring+class+A+mec+and+type+4+ccr+gene+complexes+in+a+Canadian+epidemic+strain+of+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).</li>
</ol>

利益相反は宣言されていません。

ここで説明するマルチプレックスPCRアッセイは、ブドウ球菌におけるSCCmec I-V のタイプと主要なサブタイプを分類するための簡単で信頼性の高い方法を提供し、同時にMRSAとMSSAを区別します。このアッセイは堅牢で、1回のPCR反応で便利に行われ、結果は簡単に解釈できます。このアッセイには、各SCCmec タイプ内の個々の遺伝子座を標的とするという点で制限がありますが、包括的な ccr および mec 複合体タイピングを提供しないため、ゴールドスタンダードとは見なされません。いずれにせよ、プロトコルの広範な検証により、MRSA に関する科学的および疫学的研究にとって貴重な分子ツールであることが証明されています。
アッセイの高度な性質と反応中に存在する多数のプライマーにより、このアッセイを個々のラボに適応させる際に困難が生じる可能性があります。各ラボには、プライマーの濃度や純度、サーマルサイクラーやPCR成分の変動など、アッセイの結果に影響を与える可能性のある独自の条件や要因があります。そのため、このアッセ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/50779/multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec">Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus</a>.&#160; There was a&#160;typo&#160;in Table 1.

Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

?????????????? (MRSA)???????21??67-kb?????????????????????????(mecA??? )??????????????????1???????????????MEC(SCC MEC)?????? SCC MEC??????????????????2???????????(MEC?????????CCR??????)???J-??(?1)??????????????? CCR?????????SCC MEC?????????????(CCR / ccrAB)???????????????MEC????????431mec mecA??? ??????????mecR1?mecI?????????????IS???????????????1????2????MEC?????(mecB </em&gt;??MECC)?mecA??????2?????????????????????????? SCC MEC??????????MEC?CCR?????????????????????????????J??(J1?J2????J3)?????????????????MEC??????(????B?C?D???E)???CCR????????(????1-8??)????????????????????????????????????SCC MEC????????????????????(IWG-SCC)?????????????????????SCC MEC?????????????????SCC MEC???MEC???CCR?????????????????????????????????J 1 DNA?????????????? MRSA????????????????????????(ST)???/ ??????????????????( ?? )?????( ??? ST8???(???/???)???????????????????????????????SCC MEC??????????????????????????-T008-MRSA-IVa)????????SCC MEC?????????????????????????MRSA(CA-MRSA)????????MRSA????????????????????????????????????? ???PCR????????????MEC?CCR????????????????????SCC MEC???????(20?30)????????????????????PCR??????????????????? ?????21????????SCC MEC I-IVb?3????????????????PCR??????????? subsequently CCR?MEC???J-?????????????????????????????????????????????????PCR???4?????????? SCC MEC???????????????????????PCR(M-PCR)???????????????PCR????????????????????Lencastre??SCC MEC I-IV???????????????M-PCR???????SCC MEC IV???????5,6,7????????????M-PCR??SCC MEC IV??????????????????????????????????????2???SCC MEC IV??????????????????????????????????????? SCC MEC???????????????????????SCC MEC?????????????????????????????PCR???????????????????I V 8????????????????B???????ecame 9??????????????????????SCC MEC???????????????????????(SCOPUS??337?2013?1?30???)????????????????????????????MRSA SCC MEC?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? MRSA SCC MEC???????????????????????????? SCC MEC?????M-PCR???????????????????????????????????????????????????

<table><tbody><tr><td>トリプシン大豆寒天</td><td>培地 Fisher (BD)</td><td>CA90002-700 (236920)</td><td></td></tr><tr><td>滅菌蒸留水</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Taq: 10x PCR buffer and 50 mM MgCl2</td><td>Life Technologies</td><td>10966-034</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP</td><td>Life Technologies</td><td>10297-018</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>ホウ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B7901</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ライフ</td><td>テクノロジー15576-028</td><td></td></tr><tr><td>アガロース</td><td>ライフサイエンス</td><td>テクノロジーズ16500-500</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>ライフサイエンス</td><td>テクノロジーズ15514-011</td><td></td></tr>ブロ<tr><td>モフェノールブルー</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>B8026</td><td></td></tr><tr><td>1Kb+ DNAラダー</td><td>ライフテクノロジー</td><td>10787-026</td><td></td></tr><tr><td>臭化エチジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7637</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 微量遠心チューブ </td><td>VWR (Axygen Scientific)</td><td>10011-700</td><td></td></tr><tr><td>カルチャースティック</td><td>VWR</td><td>CA10805-018</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブ</td><td>Diamed</td><td>AD0210-FCN (new #: DIATEC420-1250)</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>エッペンドルフ</td><td>5417c</td><td></td></tr><tr><td>ヒートブロック</td><td>VWR</td><td>13259-030 / 13259-286</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td>Applied Biosystems (2720)</td><td>4359659</td><td></td></tr><tr><td>ゲル型付き水平、水中ゲル電気泳動チャンバー</td><td>BioRad</td><td>170-4469</td><td></td></tr><tr><td>電源</td><td>BioRad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>ロッカーシェーカー</td><td>VWR</td><td>40000-300</td><td></td></tr><tr><td>分子イメージャーゲルドックシステム</td><td>BioRad</td><td>1708170</td><td></td></tr></tbody></table>

????????v???????????????????i????????????????pcr????<em&gt;???????</em

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

????????????MEC(SCC MEC) ?????????????????????????MRSA(CA-MRSA)?????????????????????? (MRSA)????????????????????????????????????????PCR????????????MEC?CCR????????????????????SCC MEC?????????????????????????PCR?????????????????????????SCC MEC??V???????I?????????????????????????????PCR???????????????????????????????????????????????????????????????SCC MEC?????????????????????????????????????NAT????????????????????????????????????????????????URE?????????????? MRSA SCC MEC??????????????????????????????????????PCR?????????????????????????????????????????????????????

この更新されたM-PCRでは、SCCmecタイプI-V、およびSCCmec IVの主要なサブタイプを決定（分類）することが可能です。本アッセイは、mecA遺伝子の検出と併せて、SCCmec I、II、III、IVa、IVb、IVc、IVd、IVEおよびVの固有かつ特異的な遺伝子座を標的としています。SCCmec VIおよびVIIIの暫定的な同定も可能ですが、確定にはさらなる検査が必要です。図3に、代表的なSCCmec I-VIおよびVIIIと、各エレメント内における標的部位の位置を示します。
タイプI特異的プライマー（赤）は、SCCmec IのJ1領域にあるorf E008（菌株NCTC10442; AB033763）を標的とし、タイプIIプライマー（濃緑）は、これまでに報告されているすべてのSCCmec IIおよびSCCmec VIIIのJ2に存在するorf NO43（菌株N315; D...

私たちは、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対するブドウ球菌カセット染色体メック(SCCmec)I-V型の迅速なスクリーニングとタイピングのためのシンプルなマルチプレックスPCRアッセイを実演し、このアッセイを個々の研究室に適応させるための重要なステップと手順のニュアンスを提供します。

????????V???????????????????I????????????????PCR????<em&gt;???????</em

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

この手順の全般的な目的は、マルチプレックスPCRアッセイを用いて、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）分離株のSCCmec型を決定することです。まず、細菌細胞を水中で加熱するという迅速かつ簡便な抽出法を用いて、菌株からDNAを単離します。次に、各SCCmec型に特異的なターゲットを増幅させるために、マルチプレックスPCRアッセイを実施します。次に、PCR産物をAROSゲル電気泳動で分離します。最終ステップは、DNAを可視化してデータ解析を行うためのゲルの染色です。最終的に、このマルチプレックスPCRアッセイで得られた特異的なPCR産物の独自の組み合わせを用いて、MRS A分離株のSE cmec型を判定します。個々のCCRおよびMEC遺伝子複合体を標的とし、複数の個別のPCRチューブを必要とする従来のS CECタイピング法などの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、ワークロードを大幅に簡素化でき、単一のPCRチューブで完結できる点にあります。これらの手順は、認定されたバイオセーフティレベル2の実験室で実施してください。PCRを実施する前日から、常に適切な個人用保護具を着用してください。滅菌済みのカルチャースティックを用いて、新鮮なオーバーナイトプレートからMRSAの単一コロニーを選択し、トリプチカソイ寒天プレート上に細菌を濃いストリークで塗布して準備します。複数のサンプルを1枚のプレートにストリークし、37°Cで一晩インキュベートできます。1.5 mLマイクロ遠心チューブに75 µLの滅菌蒸留水を加えます。滅菌済みのカルチャースティックを使用してください。オーバーナイトで濃厚に塗抹した菌画から少量の細菌をピックアップします。滅菌水の中で細菌を懸濁させ、濁った溶液を調製します。この操作をすべてのサンプルに対して繰り返します。細菌を溶菌させDNAを放出させるため、チューブを95 °Cに設定したドライヒートブロックで10分間インキュベートします。サンプルをヒートブロックから取り出し、室温で5分間放置します。サンプルを13,000 RPMで1分間遠心分離します。得られたサンプルは、細胞破片のペレットと、DNAを含む透明な上澄み液で構成されています。PCRの準備として、10 XPCR buffer、50 millimolar magnesium chloride、DTPs、プライマーを含むPCR試薬を-20 °Cのフリーザーから取り出し、細菌やDNAの混入が禁止されている清潔なPCRベンチ上で室温にて融解させます。この間に、0.2 milliliter PCRチューブの準備とラベリングを行うことができます。解凍後、ボルテックスで短時間撹拌してすべての試薬を混合し、テキストプロトコルの表に従って組み合わせます。反応の成否に影響することが判明しているため、Platinum Taq DNA polymeraseを使用することが重要です。マスターミックスを各PCRチューブに分注し、ボルテックスした後、すべてのPCRチューブを閉じて一般的なワークベンチへ移動します。あらかじめ調製した細菌サンプルの透明な上清を2 µLピペッティングし、PCRチューブにテンプレートを加えます。専用の増幅エリアに移動し、チューブをサーマルサイクラーにセットして、テキストプロトコルに記載された条件で反応を行います。専用のゲル電気泳動エリアにて、ガラス製エルレンマイヤーフラスコを用いて、0.5 XTBEバッファー100 mLに対しアガロース2.5 gの割合で調製します。フラスコをラップで覆い、溶液が完全に溶解するまで電子レンジで加熱します。2.5%ゲルはすぐに沸騰して溢れ出すため、定期的に電子レンジを停止させ、溶液を円を描くように混ぜてください。冷水に当ててかき混ぜるか、ベンチ上に5分間静置して、アグロを触れる温度まで冷却します。PCRサーマルサイクラーからチューブを取り出し、アグロをキャスティングトレイに注ぎます。各サンプルに6 XDNAローディングダイを2 µL添加し、サンプルを調製します。ゲルの各ウェルに5〜10 µLのサンプルをロードします。予想されるバンドサイズに応じて、1 KB plusまたは100 bpのDNAラダーが適切です。ゲルの注入前に臭化エチジウムを添加するか、あるいは可視化の前に臭化エチジウム浴でゲルを染色します。完成したゲルを0.5 µg/mLのatherium bromideと蒸留水の溶液に入れ、シェーカーで10分間緩やかに混合します。ゲルを清潔な容器に移し、さらに10分間蒸留水に浸漬します。ここに、SEC MECタイプ1から6および8のすべての代表株、ならびにSEC MEK 4サブタイプAからFの期待されるPCR産物を示す代表的なゲルを示します。典型的なSEC MEK 1株では、2本のバンドが検出されることが予想されます。613 bpのタイプ1特異的バンド、および147 bpのコントロールバンドであるmecが確認されます。代表的なSEC MEK 2株が3株示されており、これにはプロトタイプであるタイプ2のN315株、および出現頻度の低いタイプ2Aとタイプ2Bが含まれます。株をSEC MEK 2と分類するには、128 bpのタイプ2遺伝子座ターゲットとMecaコントロールを含む2つのバンドが存在する必要があります。ゲル上には代表的なSEC MEK 3株が2株示されており、これにはプロトタイプであるSEC MEK 3の852082株と、タイプ3AのJCSC290株が含まれます。SEC MEK 3は、257 bpのタイプ3特異的ターゲットとMecaコントロールターゲットを含む2つのPCR産物の存在に基づいて同定されます。優勢なSEC MEC 3は、隣接するSECエレメント上に保持されており、より稀なSEC MEC 3A 5と区別する指標となる280 base pairsの水銀ターゲットに対しても陽性を示します。タイプ4A、4B、4C、4D、4E、および4Fを含む、代表的なSEC MEC 4エレメントを示します。SC MEK 1から3とは異なり、SCC MEK 4のサブタイプ間では、meck Aを除いて、すべてに共通する単一のターゲットは存在しません。代表的なSCC MEK 4E株は、タイプ4Eバンドの存在に加え、隣接するアクセサリーエレメント上に存在するCCR AB 4産物、およびSEC MEK 4EがSEC mk 4Cと同じJ 1領域を共有しているために出現するタイプ4C産物に基づいて同定されます。SCC MEK 4Fは、SEC MEK 4Eと同じJ 3領域を共有している点でSEC MEK 4Eに類似しており、その結果、4Eターゲットに対して陽性であり、また隣接するアクセサリーエレメントによりCCR AB 4ターゲットに対しても陽性となります。しかしながら、S Cmk 4Fはタイプ4Cターゲットを欠いているため、S CMK 4Eと区別することが可能です。典型的なSE CMK 5では、ゲル上に2つのPCR産物が認められます。一つは325 bpのタイプ5特異的バンドであり、もう一つは147 bpのMEコントロールです。最後に、本アッセイの目的はSE CMK 6または8の確定的な同定を提供することではありませんでしたが、特定のPCRパターンがこれらの型の存在を示唆する根拠となるため、両方の代表的な株を解析に含めました。Meck Aターゲットに加えて、代表的なSEC MEK 6は、その主要なCCR複合体型であるため、106 bpのポジティブなCR AB 4産生することが期待されます。また、代表的なSEC MEC 8も、147 bpでMEC Aに、106 bpでC-C-R-A-B 4に陽性を示しますが、SEC MEK 2と同じJ 2領域を持つことに起因するタイプ2特異的産物の陽性に基づいて、SEC MEK 6と区別されます。この手順を行う際は、アッセイの性質が複雑であることや、反応系に多数のプライマーが存在するため、困難が生じる可能性があることに留意することが重要です。これを個々の研究室に適応させる際、DNAテンプレートの調製やPCR試薬のブランドなど、いくつかの重要な点に細心の注意を払うことで、この目的を大幅に促進できます。

multiplex-pcr-assay-for-typing-staphylococcal-cassette-chromosome-mec

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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