Name: 発現イオンチャネルの研究のための特定の感覚ニューロン集団の同定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 学ぶ、逆行性蛍光色素標識とパッチクランプ電気生理学を用いて、求心性感覚ニューロンを同定しイオンチャネルの発現パターンと機能特性を解析する方法。この非侵襲的手法により神経生理学研究が可能となる。

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この研究は、National Institutes of Health Grant AR059397 (KSE) によって資金提供されました。

注:すべての動物の作業は、施設および動物の世話のガイドラインに従って行われなければなりません。
1. 動物の準備と表示
<ol>
	<li>ラットに麻酔をかける:ケタミン(50 mg / kg体重)、キシラジン(5 mg / kg)、アセプロマジン(1 mg / kg)の混合物の腹腔内注射を使用して、ラット(通常は150〜400 g)に麻酔をかけます。.足をつまんで反射神経を確認し、反応がなくなるまで待ちます。麻酔反応は動物によって異なるため、疼痛反射をテストして麻酔薬の効果を判断するのが最善です。</li>
	<li>DiI溶液:DiI粉末を秤量し、滅菌100%DMSOに溶解して1.5%溶液(15 mg / ml)にします。溶液は、使用するまで乾燥した雰囲気で室温で保存してください。</li>
	<li>DiI注射:電気カミソリを使用して、麻酔をかけたラットの両足のふくらはぎ部分の毛を剃ります。
	<ol>
		<li>1 mLの滅菌シリンジ(11/4 in 27 G針)に200 μlの1.5% DiI溶液を入れます。各腓腹筋の長軸に平行に針をゆっくりと挿入し、針を筋肉からゆっくりと引き出さずに(~10秒)筋肉から引き抜きながら、100μlのDiIを筋肉に注入します。</li>
		<li>針を筋肉から引き抜く前に、シリンジプランジャーを引き戻して染料が先端から流れなくなったことを確認し、10秒待ってから針を筋肉から引き抜きます。このステップにより、針から皮膚へのDiIの漏れを防ぎ、皮膚求心性神経をラベル化する可能性があります。</li>
		<li>他の脚についても繰り返します。</li>
		<li>DiIが筋肉からDRGに輸送されるまで4〜5日かかります。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 解剖と神経細胞の分離
<ol>
	<li>ソリューション：
	<ol>
		<li>製造元の指示に従って、ハンクスバランスソルトソリューション(HBSS)とアールズバランスソルトソリューション(EBSS)を調製し、ろ過滅菌して4°Cで保存します。</li>
		<li>培地(MEM Plus):89 mLのミニマルエッセンシャル培地(MEM)、10 mlのウシ胎児血清(FBS)、1 mlのペニシリン-ストレプトマイシン溶液を混合し、ろ過滅菌し、4°Cで保存します。</li>
		<li>ポリリジン溶液:ポリ-L-リジン臭化水素酸塩粉末(10 mg / 100 ml)を0.1 Mホウ酸ナトリウム溶液(pH 8.4)に溶解し、アリコートを-20°Cで滅菌および保存します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>コーティングカバースリップ
	<ol>
		<li>ガラスカバースリップ(丸12 mm)を70%エタノールで3〜4時間清掃し、滅菌培養フードで風乾します。</li>
		<li>乾燥させたカバーガラスをポリリジン溶液O / Nに入れます。</li>
		<li>ポリリジン溶液から取り出し、滅菌蒸留水で2回、それぞれ5分間洗浄して、余分なポリリジンを取り除きます。</li>
		<li>カバースリップを分離し、培養フードで乾燥させ、4°Cで保管します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖のためのセットアップ
	<ol>
		<li>10 mlのHBSS、35 mmのシャーレ、100 mmのシャーレを入れたビーカーを氷の上に置きます。</li>
		<li>酵素を秤量します:コラゲナーゼ7 mg、DNAse1 mg、トリプシン10 mg。</li>
		<li>振とう水浴を37°Cに予熱し、10mlのEBSSを含む15mlの遠心分離管を浴に入れて温めます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>解剖：
	<ol>
		<li>IACUCが承認したプロトコルに従ってラットを犠牲にしました。C二酸化アルボンは、ラットを安楽死させるために使用されました。</li>
		<li>背中の皮膚を切り開いて背中をすばやく取り除き、脊柱に沿った結合組織と筋肉組織を取り除き、露出を良くし、脊柱の腰部(胸部から腸骨の端;図1)。</li>
		<li>分離した脊柱を100mmのシャーレに入れ、滅菌パスツールピペットを使用して冷やしたHBSS溶液を塗布し、調製物を湿らせて冷たく保</li>ちます。
		<li>脊柱の側面から筋肉を切り取ります。ロンジャーまたはハサミを使用して背側椎弓切除術を行い、DRGを含むくぼみを囲む骨をそっと取り除きます。</li>
		<li>この手順では、氷のように冷たいHBSS(~1 ml)を繰り返し塗布します。</li>
		<li>末梢神経と中枢神経を切断してDRGを分離します(神経節の取り扱いを容易にするために1〜2 mmの神経を残します)</li>
		<li>分離されたDRGを、氷冷HBSSバッファーを含む35mmペトリ皿に入れます。</li>
		<li>すべての L-4 と L-5 DRG が分離されるまで繰り返します。胸部DRGは、DiIラベリングのネガティブコントロールとして分離および個別に処理できます。</li>
		<li>分離されたDRGを入れた皿を解剖顕微鏡の下に置き、マイクロハサミと鉗子を使用して余分な神経と血管を取り除きます。</li>
		<li>酵素への曝露を改善するためにDRGを切り開きますが、DRGを脱皮しないでください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>DRGニューロン解離:
	<ol>
		<li>温かいEBSS培地(ウォーターバスに保管)に酵素を加えます。短時間振とうして溶解し、ろ過滅菌します。</li>
		<li>滅菌パスツールピペットを使用して、すべてのDRGを酵素溶液に入れます。DRGと添加するHBSSの量は最小限に抑えます。HBSSは酵素混合物を希釈します。フラスコに95%のO2と5%のCO2を60秒間入れてから、フラスコにしっかりと蓋をします。</li>
		<li>フラスコを37°Cに設定した振とう水浴で60分間、240rpmでインキュベー</li>トします。
		<li>インキュベーションの終わりに、フラスコ50xを激しく振ってDRG5を解離します。</li>
		<li>無菌条件下で、5 mlのMEM Plusをフラスコに加えて酵素を停止します。.</li>
		<li>フラスコの内容物を滅菌済みの15 mL遠心チューブに移し、16 x gで6分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を取り出して廃棄し、サンプルに5 mlのMEM Plusを加えます。ピペットでやさしく三つ折りにして、ペレットを砕きます。</li>
		<li>遠心分離ステップを繰り返し、上清を取り除いて廃棄し、500 μlのMEM Plusを加えます。1 mLのピペットチップをピペットに載せて静かに粉砕し、細胞懸濁液を作製します。</li>
		<li>ポリリジンコーティングされたガラスカバーガラスカバーガラスを空の滅菌35mm皿に入れます。細胞懸濁液を1滴(~50 μl)カバーガラスの中央に加えます。</li>
		<li>細胞溶液がなくなるまで繰り返します。</li>
		<li>35 mmのディッシュを37°Cおよび5%CO2インキュベーターに1時間入れ、ニューロンがカバースリップに付着します。</li>
		<li>各皿にさらに2mlの培地を加え、インキュベーターに戻します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. パッチクランプ録音
<ol>
	<li>記録用ソリューション:これらのソリューションは、NaV電流を記録するためのものです。組成が異なる溶液の例は、これらの参考文献5〜7に記載されています。
	<ol>
		<li>外部溶液:(mM)45 NaCl、100 N-メチル-d-グルカミン(NMG)•Cl、4 MnCl2、10 Na•HEPESおよび10グルコース、pH = 7.4、浸透圧= 320 mOsm。</li>
		<li>内部溶液:(mM)104 NMG•Cl、14クレアチン•PO4、6 MgCl2、10 NMG•HEPES、5 Tris•ATP、10 NMG2•EGTA、および0.3 Tris2•GTP、pH 7.4、浸透圧= 300 mOsm。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>イオン電流の測定:
	<ol>
		<li>ガラスキャピラリーから電極プーラーで記録電極を引っ張り、マイクロフォージで先端をヒートポリッシュします。電極の抵抗は通常2〜3MΩです</li>
		<li>落射蛍光顕微鏡とTRITCキューブを使用して、DiI標識DRGニューロンを同定します。DiIの励起波長は550nm、発光波長は570nmです。</li>
		<li>ガラス電極に内部溶液(電極先端のファイリング~1cmのみ)を充填し、軽くたたいて閉じ込められた気泡を取り除きます。電極ホルダーに入れ、マイクロマニピュレータで細胞上に移動します。</li>
		<li>電極が細胞に触れたら、吸引チューブを介して、密閉性が形成されるまで穏やかに吸引します(電極抵抗の増加によって決定されます)。</li>
		<li>メンブレン電圧を目的の保持電位(通常は-60〜-120mV)でクランプします。</li>
		<li>電極の先端にあるメンブレンパッチを除去するために、より強い吸引力を加えることにより、全細胞パッチクランプ構成を取得します。全細胞構成への移行は、容量性電流8-10の増加として電気的に観察される。</li>
		<li>パッチクランプアンプの補償回路を使用して直列抵抗を補償します(少なくとも80%の補償を使用してください)8,10。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 免疫細胞化学
<ol>
	<li>カバーガラス上のニューロンを4%パラホルムアルデヒドで1時間固定し、次にリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中の2%Tween 20で10分間透過処理します。</li>
	<li>固定細胞O/Nをブロッキング溶液(正常血清またはウシ血清アルブミン)と、目的の特定の抗原に結合するように開発された抗体である一次抗体でインキュベー</li>トします。
	<li>ニューロンO/Nのコントロールセットを、一次抗体を欠くブロッキング溶液でインキュベートします。</li>
	<li>カバースリップをPBSバッファーで5分間3回洗浄した後、1% Tween 20で5分間を2回洗浄して、結合していない一次抗体を除去します。</li>
	<li>適切な蛍光タグ付き二次抗体でカバースリップをインキュベートし、コントロールします。これにより、一次抗体に結合して可視化できます。</li>
	<li>カバーガラスをPBS 3xで5分間洗浄し、余分な二次抗体を除去します。</li>
	<li>封入材を使用して、カバースリップをきれいなスライドガラスに取り付けます。</li>
	<li>カバーガラスの端に透明なマニキュアを塗って所定の位置に固定します。乾いたら、ニューロンを視覚化し、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアを使用して画像をキャプチャします. 
	注:この研究では、ニコンの顕微鏡とNIS-elements BR 3.2ソフトウェアを使用しました。露光時間は最適化され、コントロールスライドとテストスライドで同じに保たれました。</li>
	<li>ImageJ(rsbweb.nih.gov/ij/index.html)などのイメージングソフトウェアを使用して、個々のニューロンからの蛍光強度と細胞サイズを測定します。</li>
</ol>

<ol><li>Hu, P., McLachlan, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+reactions+of+cutaneous+and+muscle+afferent+neurons+to+peripheral+nerve+transection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats.</a> J. Neurosci. 23, 10559-10567 (2003).</li>
<li>Wang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+reactive+oxygen+species+modulates+voltage-gated+sodium+channels+in+dorsal+root+ganglia+of+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Endogenous reactive oxygen species modulates voltage-gated sodium channels in dorsal root ganglia of rats.</a> J. Appl. Physiol. 110, 1439-1447 (2011).</li>
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<li>Matsubayashi, Y., Iwai, L., Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+double-labeling+with+carbocyanine+neuronal+tracing+and+immunohistochemistry+using+a+cholesterol-specific+detergent+digitonin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorescent double-labeling with carbocyanine neuronal tracing and immunohistochemistry using a cholesterol-specific detergent digitonin.</a> J. Neurosci. Methods. 174, 71-81 (2008).</li>
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<li>Marty, A. aN., Erwin, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMarty%2C+AaN+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. Sakmann, B., Neher, E. rwin 2, Plenum Press. 31-52 (1995).</li>
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<li>Margas, W., Mahmoud, S., Ruiz-Velasco, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Modulation+of+Mu+%28%7Bmicro%7D%29+Opioid+Receptors+in+Adult+Rat+Sphenopalatine+Ganglion+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Muscarinic Acetylcholine Receptor Modulation of Mu ({micro}) Opioid Receptors in Adult Rat Sphenopalatine Ganglion Neurons.</a> J. Neurophysiol. 103, 172-182 (2010).</li>
</ol>

著者は利益相反を宣言しません。

上腕三頭筋に由来する筋求心性神経 (例: 腓腹筋) は、運動昇圧反射 (EPR) を調査するために複数の研究で使用されています 13。EPRを媒介する感覚ニューロンの研究に関心があることから、腓腹筋が色素注入のために選択されました。DiIは、その親油性の性質と、無傷の原形質膜を通る拡散によってニューロンから失われないため、選択されました3,14。この方法をガイドとして使用すると、関心のある標的臓器に色素を注入して、神経支配する求心性ニューロンを特定できます。文献検索により、最適な注射部位と分離するDRGを見つけるために必要な情報が得られます 13、15、16。
DiIの注入は、目的の組織のみを注入するように注意する必要があります。染料が組織内に十分に分散していることを確認することも重要です。筋肉の縦軸に沿って注入することで、筋肉内の色素分布を最適化しました。筋肉に針を挿入し、筋肉に沿って針を引き抜きながら注射を行います。針を筋肉から外す前にシリンジプランジャーをそっと引き戻すことで漏れを防ぎ、染料が...

背根神経節(DRG)は、体のさまざまな部分を神経支配する求心性ニューロンの体細胞で構成されており、異なる神経支配標的を持つ感覚ニューロンを研究することから重要な洞察を得ることができます1。求心性ニューロンを単離し同定するために、例えば、フルオロゴールド1のようなマーカーを神経に注入する、外科的方法2によって筋肉に染料を注入するなど、さまざまな間接的または侵襲的な方法が使用されます。ニューロンや神経管の標識に成功したさまざまな色素のうち、DiIのような蛍光色素は、ニューロン末端による急速な取り込み、ニューロンの長期保持、およびニューロン間の移動の欠如により、神経解剖学的トレースに広く使用されています3。DiIで標識された求心性ニューロンは、蛍光顕微鏡を使用して簡単に視覚化でき、詳細な研究が可能です。しかし、1つの制限は、DiIのようなマーカーが、細胞内エピトープを用いた免疫細胞化学に必要な細胞透過化中に細胞から失われる可能性があることです4。ここでは、骨格筋にDiIを注入してDRGの筋求心性ニューロンを特定する方法を説明します。また、細胞内エピトープへの抗体アクセスを可能にしながら、ニューロンにDiIを保持する細胞透過化法についても説明します。これらの同定されたニューロンを研究するために、パッチクランプ電気生理学と免疫細胞化学の両方を使用することを実証するとともに、ニューロンの興奮性を制御するイオンチャネルを研究する際の各手法の明確な利点について説明します。最後に、電気生理学的データの解釈を妨げる可能性のある問題について説明します。これらの方法を使用して、筋肉および皮膚求心性ニューロンを同定し、これらの同定されたニューロン8で発現する電位依存性ナトリウム(NaV)チャネルを決定しました。しかし、これらの方法は、特定の標的組織または脳核を神経支配するニューロンの同定されたサブセットを研究するためのさまざまな調製物に適合させることができます。

<table><tbody><tr><td>NaV 1.8</td><td>Abcam</td><td>Ab93616</td><td></td></tr><tr><td>NaV 1.1 / 1.6/ 1.7 and 1.9</td><td>Alamone Labs, Jerusalem, Israel</td><td>ASC- 001/ 009 /008 /017</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Fluor secondary antibodies</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Gel</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17985</td><td></td></tr></tbody></table>

発現イオンチャネルの研究のための特定の感覚ニューロン集団の同定

Identification of Specific Sensory Neuron Populations for Study of Expressed Ion Channels

感覚ニューロンは、体のさまざまな部分から中枢神経系に信号を伝達します。これらのニューロンの体細胞は、脊柱を覆う後根神経節にあります。これらの感覚求心性ニューロンによって発現される受容体とチャネルを理解することは、疾患の新しい治療法につながる可能性があります。最初のステップは、関心のある感覚ニューロンの特定のサブセットを特定することです。ここでは、蛍光色素DiI(1,1'-ジオクタデシル-3,3,3',3'-テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩)を用いた逆行性標識により、筋肉を神経支配する求心性ニューロンを同定する方法について述べる。イオンチャネルが筋求心性神経の興奮に寄与していることを理解することは、末梢血管疾患や心不全などの特定の疾患状態によって引き起こされる過剰な興奮性をより適切に制御するのに役立つ可能性があります。これらのニューロンによって発現される電位依存性イオンチャネルを特定するために、パッチクランプ電気生理学と免疫細胞化学の2つのアプローチを使用しました。電気生理学と薬理学的ブロッカーを併用することで、機能的なイオンチャネルのタイプを特定できますが、免疫細胞化学を使用して、特定のブロッカーが利用できないチャネルを特定し、細胞集団のイオンチャネル分布パターンをより深く理解しました。これらの手法は、特定のニューロン群を研究するために、神経系の他の領域に適用することができます。

ここで述べた方法を用いて、我々は後根神経節（DRG）における筋感覚ニューロンを同定し、次いでこれらのニューロンで発現している電位依存性ナトリウムチャネル（NaV）を特定しました。DiIで標識された筋感覚ニューロン（図1C)はDRGの全ニューロン集団のごく一部であり、標識されたニューロンの平均割合は16%（1047個中167個）であった。定量化は、まずImageJを用いて蛍光強度を測定し、強度データのヒストグラムを作成して陽性標識ニューロンの閾値を決定することで行った。閾値は、未標識ニューロンの大きなピークにガウス分布を適合させることで決定し、これにより平均強度と標準偏差（SD）が得られた（図1D）。しきい値は、強度の平均値に2×標準偏差（SD）を加えた値に設定し、強度が &gt; 閾値はラベル付きとしてマークされます。11,12 .
電気生理学：
パッチクランプ記録では、明瞭にラベル化され、明らかなニューライト（神経突起）を持たない単離ニューロ...

求心性感覚ニューロンは、末梢から中枢神経系への感覚情報の信号伝達を行います。特定の求心性ニューロンを特定することは、それらの生理機能を理解するのに役立ちます。求心性ニューロンを同定するための逆行性標識の方法を説明し、パッチクランプ電気生理学および免疫細胞化学を使用して、これらのニューロンの電位依存性イオンチャネルを研究します。

Sensory neurons transmit signals from various parts of the body to the central nervous system. The soma for these neurons are located in the dorsal root ...

この手順の総合的な目的は、逆行性染料標識によって求心性ニューロンを特定し、パッチクランプ電気生理学および免疫化学を用いてこれらのニューロンのイオンチャネルを研究することです。まず、標的組織にDAIを注入して、支配している求心性ニューロンを標識します。次に、後根神経節から求心性ニューロンを単離します。次に、ラベル化されたニューロンにパッチクランプ法を適用してゲート付きイオンチャネルを記録し、最終ステップとして、免疫化学的手法を用いてラベル化されたニューロンに発現しているイオンチャネルを同定します。最終的に、パッチクランプ法と免疫化学的手法を組み合わせることで、求心性ニューロンにおけるイオンチャネルの発現パターンおよび機能的特性を特定することが可能になります。既存の他の手法に対する本手法の主な利点は、非侵襲的な方法であること、および使用するDAIであるDAI Iがニューロン末端に迅速に取り込まれることで知られていることです。注入したニューロン内での長期的な保持、およびニューロン間の移行が起こらないことを確認します。手順のデモンストレーションは、私と、染料注入を担当する研究技師のStephanieが行います。まず、麻酔をかけたラットの両脚の下腿部の毛を、電気シェーバーで剃ります。次に、1 CCの滅菌シリンジに1.5%のDai溶液を200 µL満たします。各胃結腸筋の長軸に対して平行にゆっくりと針を刺し、針を抜く前に100 µLのdaiを筋肉内に注入します。シリンジのプランジャーを押し戻し、チップから染料が漏れていないことを確認します。10秒間待機した後、筋肉から針を抜きます。解剖に向けて染料を分散させるため、4〜5日間必要です。10 millilitersのHBSSを入れたビーカー、35 millimeterのペトリ皿、および100 millimeterのペトリ皿を氷上に置きます。次に、コラーゲナーゼ 7 mg、DNA 1 mg、およびトリプシン 10 mgを量り取ります。シェーキングウォーターバスを37 °Cに予熱し、10 mLのEBSSが入った15 mL遠心チューブをバス内で温めておきます。解剖前にラットを安楽死させた後、動物の背中の皮膚を速やかに切り開きます。その後、脊柱に沿って結合組織と筋肉組織を除去し、視認性を高めます。続いて、脊柱の腰椎部分を取り除きます。次に、分離した脊柱を100 millimeterのペトリ皿に置きます。滅菌済みパスツールピペットを用いて冷却したHBSS溶液を加え、試料を湿った冷たい状態に保ちます。脊柱の両側から筋肉を切除します。ロンジュールまたはハサミを用いて骨を慎重に除去し、後根神経節を含む陥凹部を閉鎖することで、背側椎弓切除術を繰り返し行います。この手順の間、氷冷したHBSSを適用してください。顕微鏡下で、末梢神経と中枢神経を切断してDRGを単離します。この際、神経節の取り扱いを容易にするため、神経を1〜2 mm残してください。次に、単離したDRGを氷冷したHBSSバッファーが入った35 mmペトリ皿に移します。L4およびL5のすべてのDRGが単離されるまで、この手順を繰り返します。マイクロシザーとピンセットを用いて、過剰な神経および血管を除去します。酵素をより効率的に作用させるため、DRGを切開しますが、DRGニューロンの解離を行う際は、DRGの鞘を完全に除去しないでください。温めておいたEBSS培地に酵素を加え、ボルテックスで溶解させた後、フィルター滅菌します。次に、滅菌済みのパストールピペットを用いて、すべてのDRGを酵素溶液に入れます。その後、フラスコを95% oxygenおよび5% CO2で60秒間バブリングし、フラスコの蓋をしっかりと閉めます。次に、フラスコを37 °Cに設定した振とう恒温水槽で、240 RPMで60分間インキュベートします。インキュベーション終了後、滅菌条件下でフラスコを50回激しく振盪し、DRGを解離させます。MEM plusを5 mL加えて、酵素活性を停止させます。フラスコの内容物を滅菌済みの15 milliliters遠心チューブに移し、16 times Gで6分間遠心分離します。その後、上清を除去して廃棄します。サンプルに5 millilitersのMEM plusを加え、ピペットで穏やかにトリチュレーション（懸濁）します。ペレットを分散させるために遠心分離ステップを繰り返し、上清を除去して廃棄した後、500 µLのMEM plusを加え、ピペットの1 mLピペットチップで穏やかにピペッティングして細胞懸濁液を作成します。その後、ポリリシンコートされたガラスカバースリップを、空の滅菌済み35 mmディッシュに入れます。次に、細胞懸濁液を1滴、カバースリップの中央に滴下します。細胞溶液がなくなるまでこの手順を繰り返します。35 mmディッシュを37 °C、5% CO2インキュベーターに1時間置き、ニューロンをカバースリップに接着させます。1時間後、各ディッシュに培地をさらに2 mL加え、パッチクランプ記録を行うためにインキュベーターに戻します。まず、落射型蛍光顕微鏡を用いて、色素で標識されたDRGニューロンを特定します。次に、ガラス電極に内部液を満たします。軽く叩いて、内部に残っている気泡を取り除いてください。次に、電極を電極ホルダーに装着します。マイクロマニピュレーターを用いて、電極を細胞まで降ろします。電極が細胞に接触したら、吸引チューブを介して緩やかに吸引し、密閉状態（シール）を形成させます。次に、膜電位を希望の保持電位にクランプします。より強い吸引を加え、ホールセルパッチクランプ構成を得ます。ホールセルパッチクランプ構成が確立されたら、電極先端の膜パッチを除去するために、記録を開始します。本手順では、カバーガラス上のニューロンを4%パラホルムアルデヒドで1時間固定します。次に、PBSに含まれる2%Tween 20でニューロンを10分間透過処理します。その後、細胞をブロッキング液中で1時間インキュベートします。テストセルを、ブロッキング液に一次抗体を加えた溶液中で一晩インキュベートします。コントロールセットのニューロンは、一次抗体を加えないブロッキング液中で一晩インキュベートします。翌日、カバーガラスをPBSバッファーで5分間ずつ3回洗浄し、続いて1%tween 20で5分間ずつ2回洗浄して、未結合の一次抗体を除去します。次に、試験群および対照群のカバーガラスを、可視化のために一次抗体に結合する適切な蛍光標識二次抗体とともに30分間インキュベートします。その後、過剰な二次抗体を除去するため、カバーガラスをPBSで5分間ずつ3回洗浄します。次に、封入剤を用いてカバーガラスを清潔なガラススライドに封入します。次に、カバーガラスの端に透明のネイルポリッシュを塗り、固定します。乾燥後、蛍光顕微鏡付属のソフトウェアを使用してニューロンを可視化し、画像をキャプチャします。これは、胃筋へのDai注射と、筋肉からDRGへの逆行輸送を表しています。ここではL4およびL5のDRGがラベル付けされています。明視野像には求心性ニューロンが示されており、この蛍光像では1つの染料でラベル付けされた筋求心性ニューロンが示されています。このヒストグラムは、感覚ニューロンのDiI蛍光強度を示しています。大きなピークは未標識のニューロンによるものであり、平均強度と標準偏差を決定するためにガウス関数を用いてフィッティングされています。破線の垂直線はDAI標識の閾値を示しています。このヒストグラムは1047個のニューロンのデータで構成されており、そのうち167個がdaiで標識されています。膜電位が良好に制御された、代表的な筋求心性ニューロンを示します。左側には-20、-10、0 mVにおけるナトリウム電流を、右側には電流-電圧関係を示しています。この手順を行う際は、DRGを迅速かつ慎重に切り出し、氷冷HBSSを用いて標本を繰り返し湿らせておくことが重要です。この手順に従うことで、他の遠心性ニューロンを標識・同定し、生理学的役割を理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

発現するイオンチャネルの研究のための特定の感覚ニューロン集団の同定

貫​​通電流の一部は、各チャネルの種類に起因するものがある、同時に複数のイオンチャネルを流れる電流磁束を測定するための技術的な障害があり、後に目の肥えた。このニーズに対応するため、このメソッドは、特定の周波数成分を使用して、個々のチャネルタイプのIV曲線を生成する方法を示します。...

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シングルセルRT - PCR技術を用いて黒質神経細胞に電位依存性カリウムチャネルのmRNA発現のプロファイリング

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一チャネルセル付パッチクランプ法

ここでは、麻酔をかけたマウス皮質の特定された抑制性介在ニューロンから安定した、十分に分離された単一ユニットの記録を得るための私たちの戦略について説明します。ChR2を発現するニューロンは、青色光に対する応答によって識別されます。この方法は、標準的な細胞外記録装置を使用し、カルシウムイメージングや視覚ガイドによるパッチ適用に代わる安価な方法として機能します。...

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無傷の神経上皮におけるマウス嗅細胞の穿孔パッチクランプ記録：同定された嗅覚受容体を発現するニューロンの機能解析

臓器特有の感覚ニューロンを特定するのは困難です。Fast...

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ここでは、マウスの鋤鼻器官の急性冠組織切片における感覚ニューロンの定義された集団の同定と詳細な分析を可能にする生理学的アプローチについて説明します。...

マウス鋤鼻器官の急性組織スライスで定義された細胞集団の中で、深さ生理学的解析

ここでは、生きた麻酔薬用マウスのジェニュー酸神経節を暴露する方法と、カルシウムイメージングを使用してこれらのニューロンのアンサンブルの応答を測定して刺激を味わう方法を紹介し、異なる覚醒剤を用いた複数の試験を可能にする。これにより、どのニューロンがどのタスタントに反応するかを深く比較することができます。...

マウスの神経節神経節ニューロン反応のインビボカルシウムイメージングが味覚刺激に反応する

遺伝子コードされたカルシウム指標(GECI)は、感覚ニューロンシグナル伝達の堅牢な集団レベルの分析を可能にします。本研究では、ラット三叉神経節ニューロン活性の in vivo GECI可視化を可能にする新しいアプローチを開発しました。...

生体内 ラット三叉神経節における感覚ニューロンのカルシウムイメージング

ニューロン膜プロテアソーム (NMP)...

体性感覚ニューロンにおける神経膜プロテアソームの細胞サブタイプ特異的解析

学ぶ、逆行性蛍光色素標識とパッチクランプ電気生理学を用いて、求心性感覚ニューロンを同定しイオンチャネルの発現パターンと機能特性を解析する方法。この非侵襲的手法により神経生理学研究が可能となる。

発現イオンチャネルの研究のための特定の感覚ニューロン集団の同定

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