発現イオンチャネルの研究のための特定の感覚ニューロン集団の同定

この手順の全体的な目標は、逆行性色素標識によって求心性ニューロンを同定し、パッチクランプ電気生理学および免疫化学を使用してこれらのニューロンのイオンチャネルを研究することです。これは、最初にDAIを標的組織に注入して、神経支配求心性ニューロンを標識することによって達成されます。2番目のステップは、後根神経節から求心性ニューロンを分離することです。

次に、標識されたニューロンをパッチクランプしてゲートイオンチャネルを記録し、最後のステップは、免疫化学を用いて標識されたニューロンで発現されたイオンチャネルを同定することです。最終的には、パッチ、クランプ、免疫化学の組み合わせを使用して、求心性ニューロンのイオンチャネルの発現パターンと機能特性を特定することができます。この方法が他の既存の方法よりも優れている点は、非侵襲的な方法であり、私たちが使用するDAIであるDAI Iは、ニューロン終末による迅速な取り込みで知られていることです。

ニューロン間の移動の欠如と、注入するニューロン内の長期保持。手順を実演するのは、私自身と、染料注入のための私たちの研究室の研究技術者であるステファニーです。まず、麻酔をかけたラットの両足のふくらはぎの部分の毛を電気カミソリで剃ります。

次に、1 CC滅菌シリンジに200マイクロリットルの1.5%Dai溶液を充填します。各胃筋の長軸に平行に針をゆっくりと挿入し、100マイクロリットルのdaiを筋肉に注入してから、針を筋肉から引き抜きます。.シリンジプランジャーを引き戻して、染料が先端から流れ出ないようにします。

10秒待ってから、針を筋肉から引き抜きます。解剖のために色素の分布を設定するのに4〜5日かかります。10ミリリットルのHBSS、35ミリメートルのペトリ皿、100ミリメートルのペトリ皿を入れたビーカーを氷の上に置きます。

次に、7ミリグラムのコラゲナーゼ、1ミリグラムのDNA、10ミリグラムのトリプシンを予熱し、摂氏37度に振とうする水浴で秤量し、10ミリリットルのEBSSを含む15ミリリットルの遠心分離チューブを浴中で温めます。解剖前にラットを安楽死させた後、動物の背中の皮膚をすばやく切り開きます。.次に、脊柱に沿った結合組織と筋肉組織を取り除き、露出を改善します。

続いて、脊柱の腰部を切除します。次に、分離した脊柱を100ミリメートルのペトリ皿に入れます。滅菌牧草地ピペットを使用して冷やしたHBSS溶液を塗布し、製剤を湿らせて冷たく保

脊柱の側面から筋肉を切り取ります。ロンジャーまたはハサミを使用して骨を優しく取り除き、後根神経節を含むくぼみを閉じることにより、背側椎弓切除術を実施します。何度も何度も。この手順では、氷のように冷たいHBSSを適用します。

顕微鏡下で、末梢神経と中枢神経を切断してDRGを分離し、神経節の処理を容易にするために1〜2ミリメートルの神経を残します。次に、分離されたDRGを、氷冷HBSSバッファーを含む35ミリメートルのペトリ皿に入れます。すべてのL 4とL 5のDRGが分離されるまで、手順を繰り返します。

マイクロハサミや鉗子を使って余分な神経や血管を取り除きます。酵素への曝露を改善するためにDRGを切り開きますが、DRGニューロンの解離のためにDRGを脱鞘しないでください。温かいEBSS培地に酵素を加え、ボルテックスで溶解し、ろ過滅菌します。

次に、滅菌牧草地パイプヘッドを使用して、すべてのDRGを酵素溶液に入れます。その後、フラスコを95%の酸素と5%のCO2で60秒間泡立ててから、フラスコをしっかりとキャップします。次に、フラスコを摂氏37度の振とう水浴で240RPMで60分間インキュベー

精力的にインキュベーションの終わりに。フラスコを50回振って、無菌条件下でDRGを解離させます。5ミリリットルのMEM plusをフラスコに追加して、酵素活性を停止します。

フラスコの内容物を滅菌済みの15ミリリットル遠心チューブに移し、Gの16倍で6分間遠心分離します。その後、上清を取り除いて捨てます。5ミリリットルのMEM plusをピペットでサンプルの三分酸に穏やかに加えます。

ペレットの繰り返し遠心分離ステップを分割するには、上清を取り外して廃棄し、500マイクロリットルのMEMに加えて、ピペットの1ミリリットルのピペットチップで穏やかに三量化して細胞懸濁液を作成します。その後、ポリリジンコーティングされたガラスカバースリップを空の滅菌済み35ミリメートル皿に入れます。次に、セル懸濁液をカバースリップの中央に一滴加えます。

セル溶液がなくなるまでこの手順を繰り返します。35ミリメートルの皿を摂氏37度、CO2のインキュベーターに1時間入れて、ニューロンがカバーに付着するのを待ちます。各ディッシュにさらに2ミリリットルの培地を追加し、インキュベーターに戻してパッチクランプ記録を行います。

まず、縮射蛍光顕微鏡を使用して、DRGニューロンを標識した色素を同定します。次に、ガラス電極に内部溶液を充填します。軽くたたいて、閉じ込められた気泡を取り除きます。

次に、電極を電極ホルダーに入れます。マイクロマニピュレータを使用して電極をセルに下げます。電極が細胞に触れたら、吸引チューブを介してしっかりと密閉されるまで優しく吸引します。

次に、膜電圧を目的の保持電位にクランプします。より強力な吸引力を適用して、全細胞パッチクランプ構成を取得します。電極先端のメンブレンパッチを取り外すには、全細胞パッチクランプの構成が確立されたら、記録を開始します。

この手順では、カバースリップ上のニューロンを4%パラホルムアルデヒドで1時間固定します。次に、PBSで2%tween 20でニューロンを10分間透過します。次に、ブロッキング溶液中で細胞を1時間インキュベートします。

試験細胞は、ブロッキング溶液と一次抗体で一晩インキュベートされます。ニューロンの制御セットは、一次抗体を含まないブロッキング溶液中で一晩インキュベートします。翌日、カバースリップをPBSバッファーで5分間ずつ3回洗浄し、続いて1%tween 20で5分間ずつ2回洗浄して、結合していない一次抗体を除去します。

次に、適切な蛍光タグ付き二次抗体とコントロールカバースリップをインキュベートし、カバースリップを制御し、一次抗体に結合して可視化します。その後、カバースリップをPB S3で各5分間洗浄し、余分な二次抗体を除去します。次に、封入材を使用して、カバースリップをきれいなスライドガラスに取り付けます。

次に、カバースリップの端に透明なマニキュアを塗って所定の位置に固定します。乾いたら、ニューロンを視覚化し、蛍光顕微鏡に付属のソフトウェアを使用して画像をキャプチャします。これは、胃筋へのDai注射と、筋肉からDRGへの逆行性輸送を表しています。

ここでは、L 4 と L 5 の DRG にラベルが付けられています。この求心性ニューロンは明視野画像に示されており、この蛍光画像は、筋求心性ニューロンと標識された1つの色素を示しています。このヒストグラムは、感覚ニューロンのDII蛍光強度を示しています。

大きなピークは非標識ニューロンからのもので、平均強度と標準偏差を決定するためのガウス方程式が適合されています。縦の破線は、DAI ラベル付けのしきい値を表します。ヒストグラムは1047個のニューロンからのデータで構成され、167個はdaiで標識されています。

これは、膜電圧を良好に制御する代表的な筋求心性ニューロンです。マイナス20、マイナス10、ゼロミリボルトのナトリウム電流を左側に、電流電圧の関係を右側に示します。この手順を試行するときは、DRGを迅速かつ穏やかに解剖し、調製物を氷コードhbssで繰り返し湿らせておくことを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、他の遠心性ニューロンを標識して同定し、生理学におけるそれらの役割を理解することができます。