低温電子断層撮影法を用いて凍結 - 和状態で神経突起を可視化するための一次ニューロンの調製

超微細構造解析のための神経突起を維持するために、我々は、ガラス質氷の層に懸濁したサンプルを得瞬間冷凍に続く電子顕微鏡グリッド上に、一次ニューロンのメッキのためのプロトコルを記述します。これらのサンプルは、ナノメートルスケールでの構造を可視化するために低温電子顕微鏡で調べることができる。

この手順の全体的な目標は、クライオ電子顕微鏡による可視化に適した方法で初代ラットニューロンを成長させることです。これは、最初に一次ニューロンをプレーティングするためのEMグリッドを備えた皿を準備することによって達成されます。2番目のステップは、EMグリッド上に一次ニューロンを準備してプレートすることです。

次に、EMグリッド上のニューロンのガラス化が行われます。最後のステップは、クライオ電子顕微鏡で画像を収集することであり、その後、後処理とアノテーションが行われます。最終的に、クライオ電子顕微鏡と断層撮影法を使用して、凍結水和状態の神経突起の超構造を示します。

この手法が既存の方法と比較した場合の主な利点は、化学固定剤を使用せずに、凍結した水和神経突起をナノメートルの分解能で3D可視化できることです。したがって、ネイティブステートに近い形態学的特性の評価を容易にします。この手順は、金のEMグリッド上の聖なる炭素の完全性を調べることから始めます。

光学顕微鏡を25倍以上の倍率で使用して、カーボンホールが98%以上無傷であることを確認してください。初代ニューロンをめっきするには、ブンゼンバーナーを使用してEMグリッドを火炎滅菌し、同時にそれらを親水性にします。カーボン面を上にしてグリッドをすぐにガラスの中心に移します。

底皿、皿ごとに1つのEMグリッドを配置し、滅菌済みのガラス底皿のみを使用します。次に、光学顕微鏡を使用してグリッドの完全性をチェックしながら、EMグリッドを組織培養フードのガラス底皿内に保持し、250マイクロリットルの適切なコーティング物質をペトリ皿の中央ガラス領域に塗布します。ゆっくりと慎重に、適切なコーティング物質がEMグリッド全体を覆っていることを確認します。

その後、シャーレに蓋をして、標本を室温で1時間インキュベートします。次に、フード内の真空管に取り付けられた滅菌ピペットチップを使用して、皿からすべてのポリオールリジン混合物を吸引します。E EMグリッドとの直接の接触を避けてください。

その後、調整可能な空気置換ピペットを使用して、250マイクロリットルの滅菌PBSを慎重に適用し、各ペトリ皿の中央ガラス領域のEMグリッドを完全に覆います。次に、各皿からPBSを吸引します。その後、この手順を3回繰り返します。

EMグリッド付きの皿を組織培養フードで15分間乾燥させます。光学顕微鏡で確認します。グリッドが完全に乾いていて、グリッドに水分の泡がないことを確認してください。

それ以外の場合は、EMグリッドの隣で慎重に吸引してこの余分な水分を排除し、コーティングされたグリッドをすぐにニューロンのプレーティングに使用する必要があります。この手順では、皿あたりミリリットルあたり50, 000個の細胞の濃度を達成するために、各皿の細胞の適切な量を計算します。最大塗布量は、皿全体ではなく、中央のガラス領域のみを満たすために250マイクロリットルである必要があります。

次に、37°CのCO2インキュベーターで皿を30分間インキュベートし、細胞が回復して付着するのを待ちます30分後に、温めた細胞培地の1.5ミリリットルを各皿にゆっくりと加え、海馬ニューロンのEMグリッドに触れないようにします。翌日にメディアを交換し、その後、メディアの半分を 2 日ごとに 14 日間交換します。この手順では、湿度チャンバーを備えたガラス固化装置、カルシウムフリー濾紙、一対の長いフラットポイントピンセット、ガラス化機用の一対のファインポイント特殊ピンセット、液体窒素の実行者を含む、金EMグリッドを極低温で凍結および保管するための機器とすべての材料を準備します。 クーラントコンテナ、およびEMグリッド収納ボックス。

次に、ガラス化装置の電源を入れます。湿度を100%に、温度を摂氏32度に設定します。オプションセクションで、ブロック時間をゼロ秒に設定します。

これにより、湿度チャンバーのサイドウィンドウから手動でのブロッティングが可能になります。次に、カルシウムフリーの濾紙を3枚重ねます。スタックを幅0.5センチメートル、長さ約2センチメートルにカットし、紙の1つのセクションが0.5センチメートル×0.5センチメートルになるように90度の角度で曲げます。

このセクションは、標本のブロッティングに使用されます。真ん中の紙をはがし、使用するまで別のカルシウムフリーの濾紙の上に置きます。次に、特殊なガラス化をピンセットにして、皿からEMグリッドを慎重に選びます。

ニューロンが成長しているEMグリッドの側は、次のステップで位置が重要になるため、注意してください。次に、ピンセットの黒いスライドロックを使用して、ピンセットをEMグリッドにしっかりとロックします。次に、ニューロンが接着されているEMグリッドの側面がガラス化装置の側面にある円形の開口部から離れて左側を向くように、ピンセットをガラス化装置

次に、EMグリッドを保持しているピンセットをガラス化機に引っ込めます。その後、ガラス化機の適切なスクリーンコマンドを使用して、適切なLN 2と液体エタンを充填した冷却剤容器をガラス化機の適切なホルダーに入れます。フラットポイントピンセットで、冷却チャンバーが湿度チャンバーの底と同じ高さになるまで、クーラントチャンバーを上に上げます。

濾紙の一方の端をつかみ、短い方の辺がピンセットに対して垂直になるようにします。この面は、ブロッティングのためにEMグリッドと直接接触します。次に、濾紙を湿度チャンバーの側面の穴に慎重に安定して挿入します 紙をEMグリッドに10秒間押し付け、紙を捨ててすぐに突っ込みます。

ガラス固化装置の自動化を使用して、試料を液体エタンで凍結します。その後、凍結した水和EMグリッドをグリッドストレージのスロットの1つに慎重に移します。これは、ラットの初代ニューロンが2週間にわたって成長しているEMグリッドの中央領域を10倍の倍率で撮影した光学顕微鏡画像です。

これは、ニューロンとその神経突起が観察されるアクアボックスの拡大図です。神経突起をニューロン本体から外側に突き出た電子顕微鏡写真を4K倍率で撮影したものです。青いボックスは、20Kの倍率で神経突起の内部の特徴がはっきりと見えるところをクローズアップして見ています。

このビデオは、ラット海馬ニューロンの初代培養物から採取した神経突起の顕微鏡写真を3D再構成したものです。トモグラフィーを使用して画像化され、その後に対応する3Dカラーアノテーションが続きます。これは、クライオ電子断層撮影法を使用して収集されたラット後根神経節軸索の画像の3D再構成スタックとそれに対応する3Dカラーアノテーションを示す別のビデオであり、ここに示されているのは、20K倍率で撮影された別のラット後根神経節軸索の4つの2DクライオEM画像のモンタージュです。

このビデオを見れば、クライオ電子線トモグラフィーを使用して凍結水和状態のニューロンを視覚化するのに適した方法で、電子顕微鏡グリッド上に一次ニューロンを準備する方法について十分に理解できるはずです。