Name: マイクロRNAその場でホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 学ぶマイクロRNAのその場でハイブリダイゼーション法を用いて、ホルマリン固定腎臓組織における発現パターンを可視化・定量化する手法です。ジゴキシゲニン標識プローブとN-B-T-B-C-I-P基質による青色発色反応で、ネフロン節での局在を明らかにします。

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この作品は、米国国立衛生研究所HL082798とHL111580を補助金によって支えられている。

1。腎臓組織切片<ol><li>ホルマリン固定した（10％）パラフィン包埋腎臓切片をスライドは、分析の前に数ヶ月間保存することができるMicrom社HM 355 S.を用いて厚さ5mmの顕微鏡スライド上に切断される。 </li></ol> 2。溶液の調製<ol><li>オートクレーブのスクリュートップボトルに蒸留H 2 Oに1X PBSを1 Lを用意します。のddH 2 Oを1Lで別のボトルを埋める各ボトル、カバーにDEPCの1ミリリットルを追加し、激しく振る。ソリューションは、RNA分解酵素を破壊した後、オートクレーブを室温で一晩放置します。 PBS-Tを作るために1X PBS 1Lに400ミリリットルのTween-20を追加します。 </li><li>プロテイナーゼKバッファー（50のトリス-塩酸、pHが8.0と、DEPCでの1のCaCl 2処理水）を準備します。 </li><li> PBS-Tで0.2％グリシン溶液を調製する。 </li></ol> 3。組織標本<ol><li> 50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％のTween、9.2からなるハイブリダイゼーション緩衝液（50 ml）を大量調製pHが6、50μg/ mlのヘパリン、およびDEPC 500μg/ mlの酵母RNAへの調整のためのクエン酸は、蒸留H 2 Oを扱うC.度-80で1ミリリットルずつ、ストアに分ける</li><li> 5分ごとに新鮮なキシレンに3回洗浄することによって、組織からパラフィンを除去。 </li><li>のddH 2 Oに（100％、75％、50％、および25％）エタノールの濃度を減少させることで、5分間のインキュベーションによって、組織切片を再水和</li><li>完全に1分間、組織切片（約0.4〜0.5ミリリットル）をカバーするのに十分なDEPCでスライドを扱う。組織が乾燥しないようにしてください。 </li><li> DEPCのスライドが適切な処分のための廃棄物を含むDEPCを集め、5分間二回、PBS-Tをあしらったすすぎます。すべての試薬は、DEPCこの時点からRNA分解酵素を除去するために扱われるべきである。 </li><li>予熱し、プロテイナーゼK緩衝液および10μg/ mlの最終濃度にプロテイナーゼKを加える。プロテイナーゼK溶液で組織切片をカバーし、5分間37℃でインキュベートする。 </li><li>迅速proteinasを削除電子K溶液で30秒間PBS-T中の0.2％のグリシンを加える。 </li><li> DEPCでのすすぎのスライドを30秒ごとに二回、PBS-Tを治療した。 </li><li> 10分間焼きたての4％パラホルムアルデヒド中でのセクションを修正します。 </li></ol> 4。混成<ol><li>組織切片あたりの50のハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％のTween、9.2 mMのpHを6に調整するためのクエン酸、50μg/ mlのヘパリン、500μg/ mlの酵母RNA）を追加し、RNA分解酵素フリーのHybriSlipsでカバー組織切片よりちょうど大きくカット。 </li><li> 3 &#39;ジゴキシゲニン標識プローブ（プローブの通常のDNAのTmのために決定ハイブリダイゼーション温度で2時間、湿度制御、ハイブリダイゼーションオーブンでプレハイブリダイゼーション切片-21°C〜、のmiR-382のために（ すなわち 54℃で、DNAのTm = 75℃を探る）、チャンバーを維持するために50％formamide/50％5×SSCに浸したティッシュラボワイプを使用して加湿。 </li><li> miRNAプローブ、ポジティブコントロール（U6、核内低分子RNA）とネガティブコントロール（スクランブルを希釈ハイブリダイゼーション緩衝液中の40 nmの配列）（バッファの75μl）をセクションごとに必要とされる。 </li><li> 5分間65度Cで、ハイブリダイゼーション緩衝液中のプローブを加熱する。 </li><li>ハイブリダイゼーションオーブンからスライドを削除し、プレハイブリダイゼーションからカバースリップと過剰ハイブリダイゼーション緩衝液を除去します。 </li><li>直接組織に、組織切片あたりのプローブを含有する緩衝液の75μlを加える。組織切片をカバーするのに十分な大きHybriSlipsで組織を覆う。 </li><li>スライドホルダーレベルを維持し、ステップ4.2（約16時間）の温度で一晩のインキュベーションのためのハイブリダイゼーションオーブンに戻ります。 </li></ol> 5。ジェンシーウォッシュ<ol><li>組織からカバースリップを解放するに役立つだけでカバースリップの1辺の下で、ハイブリダイゼーション温度に加熱し、200μlの2×SSCを追加します。スライドを傾けてカバースリップを取り除きます。 </li><li> 30分ごとにハイブリダイゼーション温度の3倍で、50％ホルムアミド、50％、2×SSC200μlのスライドを洗浄します。 </li><li>すすぎスライドは低速でオービタルシェーカー上で5分間ずつ室温でPBS-Tで5倍。 </li></ol> 6。検出<ol><li>低速でオービタルシェーカー上で室温で1時間、緩衝液（2％ヤギまたはウマ血清、2 mg / mlのPBS-TでBSA）でブロッキングスライドをインキュベートする。 </li><li> 1:100でブロッキング緩衝液中で、抗DIG-AP Fab断片を希釈する。組織切片当たり100μlを追加し、セクションをカバーするのに十分な大きカットHybriSlipsでカバーしています。 </li><li> 4℃で一晩（約16時間）の加湿チャンバー内で抗体をインキュベートする。 </li><li>低速でオービタルシェーカー上で5分間ずつ、PBS-T 7Xでスライドを洗浄します。 </li><li> 5分間ずつ、AP緩衝液（100mMトリスHCl pHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaClを、0.1％Tween 20）で3回スライドを洗浄します。 </li><li> APバッファにNBT / BCIP溶液を追加し（200 mlの緩衝液μl/10） </li><li>完全にすべての組織切片をカバーするために、各スライドに希釈し、NBT / BCIP溶液を400〜500ミリリットルを追加します。暗い、レベル、humidifで発展4-5時間のためにIED室。 </li></ol> 7。マウントスライド<ol><li>各5分間のエタノール濃度（25％、50％、75％、100％）を増加させるのセクションを脱水する。 </li><li>のセクションをクリアするためにキシレン5Xでインキュベートする。 </li><li>マウントはパーマウント封入剤と乾燥一夜にスライドする。 </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
<li>Mladinov, D., Liu, Y., Mattson, D. L., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+contribute+to+the+maintenance+of+cell-type-specific+physiological+characteristics%3A+miR-192+targets+Na%2B%2FK%2B-ATPase+%CE%B21%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs contribute to the maintenance of cell-type-specific physiological characteristics: miR-192 targets Na+/K+-ATPase β1.</a> Nucleic Acids Res. 41 (2), 1273-1283 (2013).</li>
<li>Liu, Y., Taylor, N. E., Lu, L., Usa, K., Cowley, A. W., Ferreri, N. R., Yeo, N. C., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+medullary+microRNAs+in+Dahl+salt-sensitive+rats%3A+miR-29b+regulates+several+collagens+and+related+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertension%22%5BJournal%5D)">Renal medullary microRNAs in Dahl salt-sensitive rats: miR-29b regulates several collagens and related genes.</a> Hypertension. 55 (4), 974-982 (2010).</li>
<li>Kato, M., Zhang, J., Wang, M., Lanting, L., Yuan, H., Rossi, J. J., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-192+in+diabetic+kidney+glomeruliand+its+function+in+TGF-b-induced+collagen+expression+via+inhibition+of+E-box+repressors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-192 in diabetic kidney glomeruliand its function in TGF-b-induced collagen expression via inhibition of E-box repressors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104 (4), 3432-3437 (2007).</li>
<li>Krupa, A., Jenkins, R., Luo, D. D., Lewis, A., Phillips, A., Fraser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+microRNA-192+promotes+fibrogenesis+in+diabetic+nephropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">Loss of microRNA-192 promotes fibrogenesis in diabetic nephropathy.</a> J. Am. Soc. Neph. 21 (3), 438-447 (2010).</li>
<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
<li>Kato, M., Arce, L., Wang, M., Putta, S., Lanting, L., Natarajan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microRNA+circuit+mediates+transforming+growth+factor-%CE%B21+autoregulation+in+renal+glomerular+mesangial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">A microRNA circuit mediates transforming growth factor-β1 autoregulation in renal glomerular mesangial cells.</a> Kidney Int. 80 (4), 358-368 (2011).</li>
<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
<li>Juan, D., Alexe, G., Antes, T., Liu, H., Madabhushi, A., Delisi, C., Ganesan, S., Bhanot, G., Liou, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+microRNA+panel+for+clear-cell+kidney+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Urol%22%5BJournal%5D)">Identification of a microRNA panel for clear-cell kidney cancer.</a> Urol. 75 (4), 835-841 (2010).</li>
<li>Xu, X., Kriegel, A. J., Liu, Y., Usa, K., Mladinov, D., Liu, H., Fang, Y., Ding, X., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+ischemic+preconditioning+contributes+to+renal+protection+by+upregulation+of+miR-21%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Delayed ischemic preconditioning contributes to renal protection by upregulation of miR-21.</a> Kidney Int. 82 (11), 1167-1175 (2012).</li>
<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

開示することは何もありません。

この記事の目的は、ホルマリン固定腎臓の組織でうまく機能situハイブリダイゼーションにおける miRNAのためのプロトコルを記述することでした。このプロトコルを作業中に染色アーティファクトのいくつかの重要な源が特定されている。これらの点に十分注意し、染色アーティファクトを回避し、成功したISHの実行の可能性を高めることができます。 組織切片は、長いインキュベーション中に乾燥さになったときに、染色のアーティファクトの中で最も回避可能な原因の一つは、発生する可能性があります。これが発生するようになる乾燥した組織の一部は、NBT / BCIP現像（ 図1）の間に非常に濃く染色する。このプロトコルを通じて、それは、組織切片が完全にすべてのインキュベーションを通じて、スライドが完全にレベルに保たれていることを液体で覆われたままことが重要です。さらに、組織切片は完全にそのようなハイブリダイゼーション工程限り、インキュベーション中にHybriSlipsで覆われたままであるべきである<html>液体の損失を防ぐために抗体インキュ...

マイクロRNAは、内因的に産生されている非コードRNA（約22ヌクレオチド長）小さい。これらは、一般に翻訳抑制又はmRNA分解を介してタンパク質発現を抑制するように機能する。 miRNAは、それが可能な1つのmiRNAが複数のターゲットを抑制できるようにすること、不完全な相補性を有するmRNA標的に結合する。 細胞型および構造はmiRNAを表現し理解することは、miRNAの発現の変化が、細胞や組織の表現型に影響を与えるそれを通してのメカニズムを理解することの重要な部分です。そのようなmiRNAの配列決定の方法、定量PCRおよびノー​​ザンブロッティングは、全組織におけるmiRNAの検出のために使用することができるが、このアプローチは、一つは、それらが所定の組織内から来た特定の細胞型を決定することはできません。これらの方法を用いて、分析前に細胞性および構造部品の切開は非常に困難であることができ、十分なアイソレーションを達成するために必要な条件は、文献につながる可能性がRNAの遺伝子発現または劣化terations。 in situハイブリダイゼーションは、組織中のマイクロRNAマイクロRNA位置および発現レベルを可視化するために使用される方法である。この技術は、腎臓などの異質な構造で構成組織では特に貴重である。 マイクロRNAは、腎臓発生の2,3および生理学4において調節的役割を果たしていることが示されている。マイクロRNA発現の変化はまた、線維症5月10日 、糖尿病性腎症7、腎癌11,12、および急性腎障害13などの腎病理に関与することが示されている。我々の研究では、腎臓組織のためのin situハイブリダイゼーションのマイクロRNAの最適化は、健康と病気14の両方におけるmiRNA発現の正確な構造上の位置を決定するための貴重であったことを見出した。管状の異なるマイクロRNAの細胞発現の決定は、TAのためにそれらの調節に重要であるrgetsは細胞機能に依存することができる。疾患状態では、miRNAの発現の変化が機能に影響を与えることができる方法を決定することも重要です。 ここで説明する方法の目標は、 他 Kloostermanによって開発された既存のISHの方法論に基づいて構築することでした。15、他の研究16,17、およびExiqon社1によって提案されたものと、ホルマリン固定腎臓組織のための方法を最適化します。我々が正常に片側尿管閉塞18で腎マイクロRNAのmiR-382発現における明確な地域差を識別するために、このメソッドを使用している。このアプローチは、追加の最適化、ならびに他の組織とともに使用することができる。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート</td><td>Σ</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Σ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td></td><td>Σ 534056</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>超高純度</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Lifeテクノロジー</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC バッファー</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 15557-044</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>酵母</td><td>RNA ライフテクノロジー</td><td>ズ AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3'DIG- miRNA プローブ</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3'DIG- スクランブル miR プローブ</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3'DIG- U6 miR プローブ</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>組織サイズ</td><td></td>に適合</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>アルミトレイアセンブリ</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>ステンレススチールラックインサート</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロrna<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

この記事では、マイクロRNAプローブをタグ付けされたジゴキシゲニンを用いたin situハイブリダイゼーションによって、腎臓におけるmiRNAの比色検出のための方法を説明します。もともとExiqon社miRNAプローブ1との幅広い使用にKloostermanらによって開発されたこのプロトコルは、腎臓組織におけるmiRNA解析に固有の課題を克服するように変更されました。これらには、構造同定および残留プローブおよび抗体を除去するのは難しいなどの問題があります。比較的薄いを用い、厚さ5mm、強力なプローブ信号が細胞内に保持しながら、腎臓構造の明確な可視化のために許可された組織切片。加えて、プローブ濃度およびインキュベーション条件は、低いバックグラウンドおよび非特異的シグナルを有するマイクロRNA発現の可視化を容易にするように最適化した。ここで、最適化されたプロトコルは、手順の終わりにスライドを装着を通して初期の組織収集および準備を覆って、記載されている。基本componeこのプロトコルの国税庁は、他の組織および細胞培養モデルに適用するために変更することができる。

ハイブリダイゼーション、インキュベーション中に乾燥させたり、NBT / BCIPの開発中に、より濃く染色結局、一般の手順を洗うようになる組織切片の面積は。1 HybriSlipはのエッジの脱落した腎臓切片の一部を示していますそれは部分的に脱水になることを可能にする組織。残りの手順での再水和とカバレッジにもかかわらず、脱水部分の信号が人為的に高いです。 NBT-BCIP開発の時間を制御することの重要性は、 図2Aおよび図2Bに示されている。スクランブル-MIR制御における顕著非特異的な発色でのより長い4〜5時間の結果の開発期間は、腎臓（ 図2A）を通じて組織をプローブした。このようなU6核内低分子RNAの制御のような高存在度の目標のためにプロービング腎臓は、（4-5時間以上インキュベーションして改善されたシグナルを示さない図<html> URE 2B）。 <p class=...

この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

本実験の全体的な目的は、腎組織内におけるmicro RNAの発現部位を特定し、定量することです。まず、腎組織内の特定のmicro RNAに対して、ディゴゲニン標識プローブをハイブリダイズさせます。次に、アルカリホスファターゼを結合させたディゴゲニン抗体を組織とともにインキュベートします。次に、ハイブリダイズしたmicroRNAプローブの部位に青色の生成物を発色させ、microRNAの局在を可視化するために、N-B-T-B-C-I-P基質を組織に添加します。これにより、microRNA相補的プローブのハイブリダイゼーションに基づき、腎臓の領域およびネフロン分節のどこでmicroRNAが発現しているかを示す結果が得られます。本手順では、厚さ5 µmで顕微鏡スライドに貼付された、ホルマリン固定パラフィン包埋腎臓切片を使用します。解析に向けて腎臓切片を調製するには、まず新鮮なキシレンで5分間3回洗浄し、組織からパラフィンを除去します。二回蒸留水で調製した濃度の低いエタノール溶液に5分ずつ浸し、組織切片を順次再水和させます。次に、組織切片全体が完全に浸る十分な量のdathyl、percarbonate、またはdesyをスライドに加え、1分間処理します。この際、組織が乾燥しないように注意してください。デシケーターから取り出し、スライドを洗浄します。デシケーター処理後、PBSTで5分間2回洗浄してください。廃棄物を含むデシケーターは、適切に処分されるよう回収してください。ここから先、すべての試薬はRNaseフリー処理を行う必要があります。RNAを除去するため、あらかじめ温めておいたproteinase Kバッファーにproteinase Kを加え、最終濃度を10 micrograms per milliliterにします。組織切片にproteinase K溶液を滴下し、37 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。proteinase K溶液を速やかに取り除き、0.2%glycine含有PBSTを加え、30秒間放置します。スライドを脱ガス処理したPBSTで30秒間、2回すすぎます。最後に、組織切片を調製したばかりの4%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。この手順を開始するには、組織切片1枚あたり50 µLのハイブリダイゼーションバッファーを加え、組織切片よりわずかに大きいRNaseフリーのハイブリダイゼーションスリップで覆います。50%ホルムアミドおよび50% 5X SSCに浸したラボワイプで加湿したチャンバーの中にスライドを配置します。3' DIG標識プローブに対して決定されたハイブリダイゼーション温度のオーブンに、加湿チャンバーを2時間置いて組織切片をプリハイブリダイゼーションさせます。プローブのハイブリダイゼーション温度は、通常、プローブの

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全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

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前立腺癌臨床組織におけるmiRNA発現解析

miRNAを用いた乳がん組織におけるmiRNA発現の臨床病理学的解析<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

マイクロ Rna (Mirna) は、メッセンジャー Rna (Mrna) の転写調節因子として、短いと高い相同性の RNA シーケンスです。現在の miRNA 検出方法は、感度と特異度で変わる。In situハイブリダイゼーションや免疫染色マウス心臓ティッシュ セクションのマイクロ Rna...

マウス心臓のセクションを使用してその場で交配で発現組織固有の miRNA

糸球体、近頭尿細管、太い上昇肢、集結管およびインタースティジウムを含むヒト腎臓のサブセグメントのレーザーマイクロディシセクションのプロトコルについて述べている。次いで、RNAを得られたコンパートメントから単離し、RNAシーケンシングを行い、各サブセグメント内のトランスクリプトームシグネチャの変化を決定する。...

ヒト腎臓組織における局所転写論を明らかにするレーザー微小解剖の応用

この記事では、定量的なリアルタイム逆転写ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、急性腎障害マウスモデルの腎臓におけるマイクロRNA発現を検出するためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、虚血性腎障害マウスモデルとマイクロRNAサンプルの慎重な抽出に重点を置いています。...

虚血性腎障害マウスモデルの腎臓内microRNAの定量的検出法

一方的な尿管閉塞(UUO)を有するマウスの腎臓におけるマイクロRNA発現を定量的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応により評価する方法を説明する。このプロトコルは、UUOを有するマウスおよび他の病理学的状態の文脈における腎臓マイクロRNA発現プロファイルの研究に適している。...

一方的な尿管閉塞を有するマウス腎臓におけるマイクロRNA表現の定量リアルタイムPCR評価

マイクロRNAはIgA腎症の病態形成に関与しています。我々は、IgA腎症モデルマウス(HIGAマウス)の腎臓におけるマイクロRNA発現レベルを確実に検出する方法を開発しました。この新しい方法は、IgA腎症におけるmiRNAの関与をチェックすることを容易にします。...

免疫グロブリンA腎症マウスの腎臓におけるマイクロRNA発現の検出

ここでは、いくつかの腎臓病モデルマウスにおいて、非ウイルスベクターとポリエチレンイミンナノ粒子の尾静脈注射 を介して 、外因性人工的に合成されたmiRNA模倣物を腎臓に送達します。これにより、腎臓における標的miRNAの有意な過剰発現がもたらされ、その結果、いくつかのマウスモデルにおいて腎臓病の進行が抑制された。...

いくつかの腎臓病モデルマウスにおけるポリエチレンイミンナノ粒子を用いた外因性人工合成miRNA模倣体の腎臓への送達

このプロトコルは、マイクロRNAおよびマルチプレックスタンパク質を同時に検出および定量するためのホルマリン固定パラフィン包埋組織を用いたタンデム免疫蛍光ハイブリダイゼーションアッセイを記述している。...

新しい検出および定量法としてのロック核酸 in situ ハイブリダイゼーションによるマイクロRNA増幅と認識

学ぶマイクロRNAのその場でハイブリダイゼーション法を用いて、ホルマリン固定腎臓組織における発現パターンを可視化・定量化する手法です。ジゴキシゲニン標識プローブとN-B-T-B-C-I-P基質による青色発色反応で、ネフロン節での局在を明らかにします。

マイクロRNA

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