Name: マイクロRNAその場でホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-30T19:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 21 s
Description: 学ぶマイクロRNAのその場でハイブリダイゼーション法を用いて、ホルマリン固定腎臓組織における発現パターンを可視化・定量化する手法です。ジゴキシゲニン標識プローブとN-B-T-B-C-I-P基質による青色発色反応で、ネフロン節での局在を明らかにします。

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この作品は、米国国立衛生研究所HL082798とHL111580を補助金によって支えられている。

1。腎臓組織切片<ol><li>ホルマリン固定した（10％）パラフィン包埋腎臓切片をスライドは、分析の前に数ヶ月間保存することができるMicrom社HM 355 S.を用いて厚さ5mmの顕微鏡スライド上に切断される。 </li></ol> 2。溶液の調製<ol><li>オートクレーブのスクリュートップボトルに蒸留H 2 Oに1X PBSを1 Lを用意します。のddH 2 Oを1Lで別のボトルを埋める各ボトル、カバーにDEPCの1ミリリットルを追加し、激しく振る。ソリューションは、RNA分解酵素を破壊した後、オートクレーブを室温で一晩放置します。 PBS-Tを作るために1X PBS 1Lに400ミリリットルのTween-20を追加します。 </li><li>プロテイナーゼKバッファー（50のトリス-塩酸、pHが8.0と、DEPCでの1のCaCl 2処理水）を準備します。 </li><li> PBS-Tで0.2％グリシン溶液を調製する。 </li></ol> 3。組織標本<ol><li> 50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％のTween、9.2からなるハイブリダイゼーション緩衝液（50 ml）を大量調製pHが6、50μg/ mlのヘパリン、およびDEPC 500μg/ mlの酵母RNAへの調整のためのクエン酸は、蒸留H 2 Oを扱うC.度-80で1ミリリットルずつ、ストアに分ける</li><li> 5分ごとに新鮮なキシレンに3回洗浄することによって、組織からパラフィンを除去。 </li><li>のddH 2 Oに（100％、75％、50％、および25％）エタノールの濃度を減少させることで、5分間のインキュベーションによって、組織切片を再水和</li><li>完全に1分間、組織切片（約0.4〜0.5ミリリットル）をカバーするのに十分なDEPCでスライドを扱う。組織が乾燥しないようにしてください。 </li><li> DEPCのスライドが適切な処分のための廃棄物を含むDEPCを集め、5分間二回、PBS-Tをあしらったすすぎます。すべての試薬は、DEPCこの時点からRNA分解酵素を除去するために扱われるべきである。 </li><li>予熱し、プロテイナーゼK緩衝液および10μg/ mlの最終濃度にプロテイナーゼKを加える。プロテイナーゼK溶液で組織切片をカバーし、5分間37℃でインキュベートする。 </li><li>迅速proteinasを削除電子K溶液で30秒間PBS-T中の0.2％のグリシンを加える。 </li><li> DEPCでのすすぎのスライドを30秒ごとに二回、PBS-Tを治療した。 </li><li> 10分間焼きたての4％パラホルムアルデヒド中でのセクションを修正します。 </li></ol> 4。混成<ol><li>組織切片あたりの50のハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド、5×SSC、0.1％のTween、9.2 mMのpHを6に調整するためのクエン酸、50μg/ mlのヘパリン、500μg/ mlの酵母RNA）を追加し、RNA分解酵素フリーのHybriSlipsでカバー組織切片よりちょうど大きくカット。 </li><li> 3 &#39;ジゴキシゲニン標識プローブ（プローブの通常のDNAのTmのために決定ハイブリダイゼーション温度で2時間、湿度制御、ハイブリダイゼーションオーブンでプレハイブリダイゼーション切片-21°C〜、のmiR-382のために（ すなわち 54℃で、DNAのTm = 75℃を探る）、チャンバーを維持するために50％formamide/50％5×SSCに浸したティッシュラボワイプを使用して加湿。 </li><li> miRNAプローブ、ポジティブコントロール（U6、核内低分子RNA）とネガティブコントロール（スクランブルを希釈ハイブリダイゼーション緩衝液中の40 nmの配列）（バッファの75μl）をセクションごとに必要とされる。 </li><li> 5分間65度Cで、ハイブリダイゼーション緩衝液中のプローブを加熱する。 </li><li>ハイブリダイゼーションオーブンからスライドを削除し、プレハイブリダイゼーションからカバースリップと過剰ハイブリダイゼーション緩衝液を除去します。 </li><li>直接組織に、組織切片あたりのプローブを含有する緩衝液の75μlを加える。組織切片をカバーするのに十分な大きHybriSlipsで組織を覆う。 </li><li>スライドホルダーレベルを維持し、ステップ4.2（約16時間）の温度で一晩のインキュベーションのためのハイブリダイゼーションオーブンに戻ります。 </li></ol> 5。ジェンシーウォッシュ<ol><li>組織からカバースリップを解放するに役立つだけでカバースリップの1辺の下で、ハイブリダイゼーション温度に加熱し、200μlの2×SSCを追加します。スライドを傾けてカバースリップを取り除きます。 </li><li> 30分ごとにハイブリダイゼーション温度の3倍で、50％ホルムアミド、50％、2×SSC200μlのスライドを洗浄します。 </li><li>すすぎスライドは低速でオービタルシェーカー上で5分間ずつ室温でPBS-Tで5倍。 </li></ol> 6。検出<ol><li>低速でオービタルシェーカー上で室温で1時間、緩衝液（2％ヤギまたはウマ血清、2 mg / mlのPBS-TでBSA）でブロッキングスライドをインキュベートする。 </li><li> 1:100でブロッキング緩衝液中で、抗DIG-AP Fab断片を希釈する。組織切片当たり100μlを追加し、セクションをカバーするのに十分な大きカットHybriSlipsでカバーしています。 </li><li> 4℃で一晩（約16時間）の加湿チャンバー内で抗体をインキュベートする。 </li><li>低速でオービタルシェーカー上で5分間ずつ、PBS-T 7Xでスライドを洗浄します。 </li><li> 5分間ずつ、AP緩衝液（100mMトリスHCl pHは9.5、50のMgCl 2、100mMのNaClを、0.1％Tween 20）で3回スライドを洗浄します。 </li><li> APバッファにNBT / BCIP溶液を追加し（200 mlの緩衝液μl/10） </li><li>完全にすべての組織切片をカバーするために、各スライドに希釈し、NBT / BCIP溶液を400〜500ミリリットルを追加します。暗い、レベル、humidifで発展4-5時間のためにIED室。 </li></ol> 7。マウントスライド<ol><li>各5分間のエタノール濃度（25％、50％、75％、100％）を増加させるのセクションを脱水する。 </li><li>のセクションをクリアするためにキシレン5Xでインキュベートする。 </li><li>マウントはパーマウント封入剤と乾燥一夜にスライドする。 </li></ol>

<ol><li>Nagalakshmi, V. K., Ren, Q., Pugh, M. M., Valerius, M. T., McMahon, A. P., Yu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dicer+regulates+thedevelopment+of+nephrogenic+and+ureteric+compartments+in+the+mammalian+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Dicer regulates thedevelopment of nephrogenic and ureteric compartments in the mammalian kidney.</a> Kidney Int. 79 (3), 317-330 (2011).</li>
<li>Ho, J., Pandey, P., Schatton, T., Sims-Lucas, S., Khalid, M., Frank, M. H., Hartwig, S., Kreidberg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-apoptotic+protein+Bim+is+a+MicroRNA+target+in+kidney+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Neph%22%5BJournal%5D)">The pro-apoptotic protein Bim is a MicroRNA target in kidney progenitors.</a> J. Am. Soc. Neph. 22 (6), 1053-1063 (2011).</li>
<li>Tian, Z., Greene, A. S., Pietrusz, J. L., Matus, I. R., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA-target+pairs+in+the+rat+kidney+identified+by+microRNA+microarray%2C+proteomic%2C+and+bioinformaticanalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNA-target pairs in the rat kidney identified by microRNA microarray, proteomic, and bioinformaticanalysis.</a> Genome Res. 18 (3), 404-411 (2008).</li>
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<li>Wang, B., Herman-Edelstein, M., Koh, P., Burns, W., Jandeleit-Dahm, K., Watson, A., Saleem, M., Goodall, G. J., Twigg, S. M., Cooper, M. E., Kantharidis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-cadherin+expression+is+regulated+by+miR-192%2F215+by+a+mechanism+that+is+independent+of+the+profibrotic+effects+of+transforming+growth+factor-%CE%B2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">E-cadherin expression is regulated by miR-192/215 by a mechanism that is independent of the profibrotic effects of transforming growth factor-β.</a> Diabetes. 59 (7), 1794-1802 (2010).</li>
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<li>Gottardo, F., Liu, C. G., Ferracin, M., Calin, G. A., Fassan, M., Bassi, P., Sevignani, C., Byrne, D., Negrini, M., Pagano, F., Gomella, L. G., Croce, C. M., Baffa, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-RNA+profiling+in+kidney+and+bladder+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Urol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers.</a> Urol. Oncol. 25 (5), 387-392 (2007).</li>
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<li>Kriegel, A. J., Mladinov, D., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+study+of+microRNAs+and+its+application+in+kidney+disease+and+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Translational study of microRNAs and its application in kidney disease and hypertension.</a> 122 (10), 439-447 (2012).</li>
<li>Kloosterman, W. P., Wienholds, E., de Bruijn, E., Kauppinen, S., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+miRNAs+in+animal+embryos+using+LNA-moidified+oligonucleotide+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">In situ detection of miRNAs in animal embryos using LNA-moidified oligonucleotide probes.</a> Nat. Methods. 3 (1), 27-29 (2006).</li>
<li>Nelson, P. T., Baldwin, D. A., Kloosterman, W. P., Kauppinen, S., Plasterk, R. H., Mourelatos, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAKE+and+LNA-ISH+reveal+microRNA+expression+and+localization+in+archival+human+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RAKE and LNA-ISH reveal microRNA expression and localization in archival human brain tissue.</a> RNA. 12 (2), 187-191 (2006).</li>
<li>Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locked+nucleic+acid-based+in+situ+detection+of+microRNAs+in+mouse+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections.</a> Nat. Protocols. 2 (6), 1508-1514 (2007).</li>
<li>Kriegel, A. J., Liu, Y., Cohen, B., Usa, K., Liu, Y., Liang, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MiR-382+targeting+of+kallikrein+5+contributes+to+renal+inner+medullary+interstitial+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Genomics%22%5BJournal%5D)">MiR-382 targeting of kallikrein 5 contributes to renal inner medullary interstitial fibrosis.</a> Physiol. Genomics. 44 (4), 259-267 (2012).</li>
</ol>

開示することは何もありません。

この記事の目的は、ホルマリン固定腎臓の組織でうまく機能situハイブリダイゼーションにおける miRNAのためのプロトコルを記述することでした。このプロトコルを作業中に染色アーティファクトのいくつかの重要な源が特定されている。これらの点に十分注意し、染色アーティファクトを回避し、成功したISHの実行の可能性を高めることができます。 組織切片は、長いインキュベーション中に乾燥さになったときに、染色のアーティファクトの中で最も回避可能な原因の一つは、発生する可能性があります。これが発生するようになる乾燥した組織の一部は、NBT / BCIP現像（ 図1）の間に非常に濃く染色する。このプロトコルを通じて、それは、組織切片が完全にすべてのインキュベーションを通じて、スライドが完全にレベルに保たれていることを液体で覆われたままことが重要です。さらに、組織切片は完全にそのようなハイブリダイゼーション工程限り、インキュベーション中にHybriSlipsで覆われたままであるべきである<html>液体の損失を防ぐために抗体インキュ...

マイクロRNAは、内因的に産生されている非コードRNA（約22ヌクレオチド長）小さい。これらは、一般に翻訳抑制又はmRNA分解を介してタンパク質発現を抑制するように機能する。 miRNAは、それが可能な1つのmiRNAが複数のターゲットを抑制できるようにすること、不完全な相補性を有するmRNA標的に結合する。 細胞型および構造はmiRNAを表現し理解することは、miRNAの発現の変化が、細胞や組織の表現型に影響を与えるそれを通してのメカニズムを理解することの重要な部分です。そのようなmiRNAの配列決定の方法、定量PCRおよびノー​​ザンブロッティングは、全組織におけるmiRNAの検出のために使用することができるが、このアプローチは、一つは、それらが所定の組織内から来た特定の細胞型を決定することはできません。これらの方法を用いて、分析前に細胞性および構造部品の切開は非常に困難であることができ、十分なアイソレーションを達成するために必要な条件は、文献につながる可能性がRNAの遺伝子発現または劣化terations。 in situハイブリダイゼーションは、組織中のマイクロRNAマイクロRNA位置および発現レベルを可視化するために使用される方法である。この技術は、腎臓などの異質な構造で構成組織では特に貴重である。 マイクロRNAは、腎臓発生の2,3および生理学4において調節的役割を果たしていることが示されている。マイクロRNA発現の変化はまた、線維症5月10日 、糖尿病性腎症7、腎癌11,12、および急性腎障害13などの腎病理に関与することが示されている。我々の研究では、腎臓組織のためのin situハイブリダイゼーションのマイクロRNAの最適化は、健康と病気14の両方におけるmiRNA発現の正確な構造上の位置を決定するための貴重であったことを見出した。管状の異なるマイクロRNAの細胞発現の決定は、TAのためにそれらの調節に重要であるrgetsは細胞機能に依存することができる。疾患状態では、miRNAの発現の変化が機能に影響を与えることができる方法を決定することも重要です。 ここで説明する方法の目標は、 他 Kloostermanによって開発された既存のISHの方法論に基づいて構築することでした。15、他の研究16,17、およびExiqon社1によって提案されたものと、ホルマリン固定腎臓組織のための方法を最適化します。我々が正常に片側尿管閉塞18で腎マイクロRNAのmiR-382発現における明確な地域差を識別するために、このメソッドを使用している。このアプローチは、追加の最適化、ならびに他の組織とともに使用することができる。

<table><tbody><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>70011044</td><td></td></tr><tr><td>ジエチルピロカーボネート</td><td>Σ</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Σ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td></td><td>Σ 534056</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>超高純度</td><td>200CSPTP</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Lifeテクノロジー</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C2536</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>J.T. Baker</td><td>4059-00</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>シグマ</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>20x SSC バッファー</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 15557-044</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>SAGENT</td><td>25021-400-30</td><td></td></tr><tr><td>酵母</td><td>RNA ライフテクノロジー</td><td>ズ AM7118</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-1004</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>4058-01</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>Fermentas</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>3'DIG- miRNA プローブ</td><td>Exiqon</td><td>miR dependent-05</td><td></td></tr><tr><td>3'DIG- スクランブル miR プローブ</td><td>Exiqon</td><td>99004-05</td><td></td></tr><tr><td>3'DIG- U6 miR プローブ</td><td>Exiqon</td><td>99002-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenin-Ab Fab</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP</td><td>Roche</td><td>11681451001</td><td></td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher</td><td>組織サイズ</td><td></td>に適合</tr><tr><td>Microtom HM 355 S</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-900-672</td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーションオーブン</td><td>Boekel</td><td>241000</td><td></td></tr><tr><td>アルミトレイアセンブリ</td><td>Boekel</td><td>C2403973</td><td></td></tr><tr><td>ステンレススチールラックインサート</td><td>Boekel</td><td>C2403754</td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロrna<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

この記事では、マイクロRNAプローブをタグ付けされたジゴキシゲニンを用いたin situハイブリダイゼーションによって、腎臓におけるmiRNAの比色検出のための方法を説明します。もともとExiqon社miRNAプローブ1との幅広い使用にKloostermanらによって開発されたこのプロトコルは、腎臓組織におけるmiRNA解析に固有の課題を克服するように変更されました。これらには、構造同定および残留プローブおよび抗体を除去するのは難しいなどの問題があります。比較的薄いを用い、厚さ5mm、強力なプローブ信号が細胞内に保持しながら、腎臓構造の明確な可視化のために許可された組織切片。加えて、プローブ濃度およびインキュベーション条件は、低いバックグラウンドおよび非特異的シグナルを有するマイクロRNA発現の可視化を容易にするように最適化した。ここで、最適化されたプロトコルは、手順の終わりにスライドを装着を通して初期の組織収集および準備を覆って、記載されている。基本componeこのプロトコルの国税庁は、他の組織および細胞培養モデルに適用するために変更することができる。

ハイブリダイゼーション、インキュベーション中に乾燥させたり、NBT / BCIPの開発中に、より濃く染色結局、一般の手順を洗うようになる組織切片の面積は。1 HybriSlipはのエッジの脱落した腎臓切片の一部を示していますそれは部分的に脱水になることを可能にする組織。残りの手順での再水和とカバレッジにもかかわらず、脱水部分の信号が人為的に高いです。 NBT-BCIP開発の時間を制御することの重要性は、 図2Aおよび図2Bに示されている。スクランブル-MIR制御における顕著非特異的な発色でのより長い4〜5時間の結果の開発期間は、腎臓（ 図2A）を通じて組織をプローブした。このようなU6核内低分子RNAの制御のような高存在度の目標のためにプロービング腎臓は、（4-5時間以上インキュベーションして改善されたシグナルを示さない図<html> URE 2B）。 <p class=...

この記事では、ホルマリン固定腎臓切片にマイクロRNA発現の比色検出のために最適化されたin situハイブリダイゼーションプロトコルについて説明します。

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

本実験の全体的な目的は、腎組織内におけるmicro RNAの発現部位を特定し、定量することです。まず、腎組織内の特定のmicro RNAに対して、ディゴゲニン標識プローブをハイブリダイズさせます。次に、アルカリホスファターゼを結合させたディゴゲニン抗体を組織とともにインキュベートします。次に、ハイブリダイズしたmicroRNAプローブの部位に青色の生成物を発色させ、microRNAの局在を可視化するために、N-B-T-B-C-I-P基質を組織に添加します。これにより、microRNA相補的プローブのハイブリダイゼーションに基づき、腎臓の領域およびネフロン分節のどこでmicroRNAが発現しているかを示す結果が得られます。本手順では、厚さ5 µmで顕微鏡スライドに貼付された、ホルマリン固定パラフィン包埋腎臓切片を使用します。解析に向けて腎臓切片を調製するには、まず新鮮なキシレンで5分間3回洗浄し、組織からパラフィンを除去します。二回蒸留水で調製した濃度の低いエタノール溶液に5分ずつ浸し、組織切片を順次再水和させます。次に、組織切片全体が完全に浸る十分な量のdathyl、percarbonate、またはdesyをスライドに加え、1分間処理します。この際、組織が乾燥しないように注意してください。デシケーターから取り出し、スライドを洗浄します。デシケーター処理後、PBSTで5分間2回洗浄してください。廃棄物を含むデシケーターは、適切に処分されるよう回収してください。ここから先、すべての試薬はRNaseフリー処理を行う必要があります。RNAを除去するため、あらかじめ温めておいたproteinase Kバッファーにproteinase Kを加え、最終濃度を10 micrograms per milliliterにします。組織切片にproteinase K溶液を滴下し、37 degrees Celsiusで5分間インキュベートします。proteinase K溶液を速やかに取り除き、0.2%glycine含有PBSTを加え、30秒間放置します。スライドを脱ガス処理したPBSTで30秒間、2回すすぎます。最後に、組織切片を調製したばかりの4%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。この手順を開始するには、組織切片1枚あたり50 µLのハイブリダイゼーションバッファーを加え、組織切片よりわずかに大きいRNaseフリーのハイブリダイゼーションスリップで覆います。50%ホルムアミドおよび50% 5X SSCに浸したラボワイプで加湿したチャンバーの中にスライドを配置します。3' DIG標識プローブに対して決定されたハイブリダイゼーション温度のオーブンに、加湿チャンバーを2時間置いて組織切片をプリハイブリダイゼーションさせます。プローブのハイブリダイゼーション温度は、通常、プローブのDNA融解温度（Tm）から21 °Cを引いた温度になります。例えば、mere 3 82プローブのハイブリダイゼーション温度は、そのTMが75 °Cであるため、54 °Cとなります。マイクロRNAプローブ、ならびに陽性および陰性コントロールを、ハイブリダイゼーション緩衝液でそれぞれ40 nMに希釈して調製します。陽性コントロールにはU six小核RNAを、陰性コントロールにはスクランブル配列を使用します。プローブとコントロールを65 °Cで5分間加熱します。ハイブリダイゼーションオーブンからスライドを取り出します。ハイブリダイゼーション前のセットアップから、ハイブリッドスリップおよび過剰なハイブリダイゼーションバッファーを除去します。バッファーを含むプローブ75 µLを、各組織切片の上に直接滴下します。再び、組織切片を覆うのに十分な大きさのハイブリダイゼーション用カバーガラスで覆います。その際、スライドホルダーを水平に保ってください。スライドを適切な温度に設定したハイブリダイゼーションオーブンに戻します。約16時間、一晩インキュベートします。ハイブリダイゼーションが完了したら、スライドをハイブリダイゼーションオーブンから取り出します。ハイブリダイゼーション温度まで加熱した2X SSC 200 µLを、カバーガラスの端のすぐ下に加え、カバーガラスが組織から離れやすくします。スライドを傾けてカバーガラスを取り除きます。カバーガラスを除去した後、決定したハイブリダイゼーション温度で、50% フォルムアミド含有 2X SSC 200 µLを用いて、30分間ずつ3回スライドを洗浄します。室温で、低速のオービタルのシェーカーを用いて、PBSTでスライドを5回、各5分間洗浄します。まず、低速のオービタルのシェーカーを用いて、スライドをブロッキングバッファー中で室温で1時間インキュベートします。1時間後、各組織切片にanti dig AP FAB fragmentsを100 µL添加し、ハイブリダイゼーション用スリップで覆います。セクションを十分に覆う大きさに切断します。スライドを湿潤チャンバーに入れ、4 °Cで一晩、または翌日まで約16時間インキュベートします。低速に設定したオービタルシェーカーを用い、室温のPBSTで5分間ずつ計7回、スライドを洗浄します。次に、スライドをAPバッファーで5分間ずつ3回洗浄します。N-B-T-B-C-I-P溶液200 µLをAPバッファー10 mLに加えて、N-B-T-B-C-I-P発色液を調製します。希釈したN-B-T-B-C-I-P溶液を、すべての組織切片が完全に覆われるように、各スライドに400〜500 µLずつ加えます。コロメトリック検出が完了したら、室温の暗所にある加湿チャンバー内で4〜5時間展開させます。エタノールの濃度を段階的に上げて切片を脱水し、それぞれ5分間処理します。その後、キシレンに5分間ずつ5回浸し、切片を透徹させます。最後に、Permount封入剤でスライドを封入し、一晩乾燥させます。組織切片を乾燥させないようにすることが、このin situハイブリダイゼーションプロトコルの成功において極めて重要です。この図の左側は、腎臓切片の一部でハイブリダイゼーションスリップが組織の端からずれ、部分的に脱水状態になった様子を示しています。その後のステップで再水和し、カバーしたにもかかわらず、脱水した部分のシグナルは、ハイブリダイゼーションスリップでカバーされていた部分と比較して、不自然に高くなっています。この画像において、キャリブレーションバーは100 micronsを示しています。続く図では、N-B-T-B-C-I-Pの発色時間の最適化がいかに重要であるかが示されています。パネルAでは、発色時間が4〜5時間を超えると、腎臓全体にわたって顕著な非特異的な発色が生じ、micro RNAコントロールをプローブした組織が乱れることがわかります。パネルBは、U6 small nuclear RNAコントロールなどの高発現ターゲットを腎臓でプローブした場合、4〜5時間を超えるインキュベーションを行ってもシグナルのさらなる改善は見られないことを示しています。先行研究から引用したこれらの図は、このin situハイブリダイゼーション法が腎組織におけるmicroRNA検出に適用可能であることを裏付けています。パネルAは、片側尿管閉塞（UUO）を誘発したマウスまたは誘発していないマウスの腎臓切片において、anti-miR-382またはanti-scrambledで処理し、in situハイブリダイゼーションによって得られたmiR-382発現の代表的な画像を示しています。sham + anti-scrambled組織と比較して、UUO + anti-scrambled組織では染まりが濃くなっており、UUOによってmiR-382の発現が増加したことがわかります。この増加は、anti-ME 3 82による処理で抑制されました。パネルBのグラフは、sham群およびanti-scrambled処理群のマウスにおけるmere 3 82の発現を、平均統合光学的密度（integrated optical density）のパーセントとして示しています。ピクセル強度の測定結果から、UUOは外髄質および内髄質においてmere 3 82の発現を有意に増加させ、anti-ME 3 82がこれを抑制することがわかります。これらの増加は、すべてmiRNA in situ hybridizationによって視覚化および測定が可能です。これらの結果は、ここでは示していませんがqPCRの結果とも一致しており、ホルマリン固定腎臓におけるmiR-382の発現を検出するためのin situ hybridizationの使用は、qPCRベースの発現解析を反映した定量的な結果を提供できる十分な感度を有していることを示しています。さらに、in situ hybridizationを用いることで、腎臓内におけるmiRNA発現の明確な局所的差異を測定することが可能になります。

microrna-in-situ-hybridization-for-formalin-fixed-kidney-tissues

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶマイクロRNAのその場でハイブリダイゼーション法を用いて、ホルマリン固定腎臓組織における発現パターンを可視化・定量化する手法です。ジゴキシゲニン標識プローブとN-B-T-B-C-I-P基質による青色発色反応で、ネフロン節での局在を明らかにします。

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