培養およびメンテナンス

本手順の全体的な目的は、糞便検体からC. difficileを分離し、長期保存用のグリセロールストックを作成するためにC. difficileを培養すること、および、さまざまなダウンストリームアプリケーションに使用するための芽胞ストックを調製し、定量することです。これは、まず選択培地に塗抹して糞便検体からC. difficileを分離することで達成されます。第2のステップは、液体培地でC. difficileを増殖させ、グリセロール中でC. difficileの長期保存ストックを維持することです。

次に、凍結グリセロールストックからC difficileを回収し、寒天プレートに画線します。最終ステップとして、これらのプロトコルに従い、C difficileの胞子ストックを調製し、最終的に定量します。C difficileは、その同一性を検証および確認し、適切に培養・維持するために、さまざまな培地で増殖させることができます。

これらのグリセロールストックおよび培養物は、動物実験やさらなる分子生物学的研究を含む、多くのダウンストリームアプリケーションに利用可能です。キャンドルジャーなどの他の方法と比較して、ビニール製嫌気チャンバーを用いてc difficileを培養する主な利点は、厳格な嫌気環境を維持できるため、c difficileの一貫した信頼性の高い増殖が可能になることです。一般的に、これらの手法に不慣れな方は、グローブによるチャンバー内での操作性の低下や、実験を事前に綿密に計画する必要があることから、困難に直面することがあります。

これらの手順の実演を行うのは、私の研究室の技術者であるJose Suarezです。まず最初に、この操作は好気条件下で実施可能です。まず、糞便サンプルの重量を量り取ります。

これは、糞便中のc difficileを定量するために必要です。次に、糞便検体を1 XPBSに再懸濁し、ボルテックスミキサーで完全に再懸濁させます。続いて、ここから適切な分離、または糞便1gあたりのコロニー形成単位（CFU）を定量するため、再懸濁した糞便検体を1 XPBSで段階希釈します。

C difficile の栄養細胞が酸素に曝露されないよう、嫌気条件下で手順を実施します。本実験で使用する嫌気チャンバーは 37 °C に維持されています。無菌操作を用いて行います。

各段階希釈液 100 µL を、Toro collate oxetane、cyclo Seine、フルクトース寒天培地、または T-C-C-F-A プレートに塗布します。これらのプレートは、残留酸素を確実に除去するため、嫌気チャンバー内で少なくとも 1 ～ 2 時間前還元処理されています。これにより、正確な計数やその他の下流アプリケーションのためのコロニー分離が可能になります。

滅菌済みの白金線を用いて、塗布した培養液をT-C-C-F-Aプレートの表面に均一に広げます。プレートを37°Cで48時間、嫌気条件下で培養します。栄養細胞の状態のc difficileが酸素への曝露によって死滅していないことを確認するため、平坦で不規則なすりガラス状の外観に基づいてc difficileのコロニーを同定します。

後続のアプリケーションに向けてコロニーを単離するためのプレートは、常に嫌気チェンバー内に保持する必要があります。コロニーの計数を行う場合は、プレートを嫌気チェンバーの外に出すことができます。一度プレートをチェンバーの外に出すと、栄養細胞状態の c difficile が酸素にさらされ、死滅することに注意してください。

これらの C difficile コロニーは、プレートをチャンバーに戻しても回復させることはできません。各希釈段階における C difficile コロニー数をカウントし、糞便サンプル1グラムあたりのCFU数を算出して、C difficile を培養しグリセロールストックを作製します。滅菌済みの白金線を用いて個々のコロニーをピックアップし、還元済みブレインハートインフュージョン培地にストリークします。

酵母エキスを添加したBHIS寒天培地または0.03%システインを添加したBHIS寒天培地に、各画分ごとに新しい滅菌接種ループを用いて、単一コロニーを画分法により画線播種する。プレートを37°Cで16〜24時間、嫌気的に培養する。BHIS寒天培地に独立したコロニーが出現したら、単一の独立コロニーをピックアップし、0.03%L-システインを添加した10 mLの還元済みBHIS液体培地に再懸濁し、一晩培養する。

37 °Cで、または培養液が濁るまで嫌気的に培養する。翌日、1.8 mLの凍結保存チューブに333 µLの50% glycerolと666 µLのC. difficile培養液を加える。分離株の15% glycerolストックを作成するため、凍結保存チューブのキャップをしっかりと閉め、混合する。

ストックを直ちに嫌気チャンバーから取り出し、長期保存のために-80°Cのフリーザーに保管します。この手順を開始するには、-80°CのフリーザーからC. difficileの凍結グリセロールストックを取り出します。解凍を防ぐためです。

凍結保存されたグリセロールストックを、使用前に-80°Cで保存しておいた冷却ラックに直ちに配置します。無菌操作を行い、滅菌済みの接種ループを用いて、冷却ラックに入った凍結グリセロールストックを嫌気チャンバー内に運びます。ストックをごく少量プレート上に盛り、プレートの1つの区画に画線します。

プレートを90度回転させ、新しい滅菌済みの白金線を用いて第2象限に画線します。個々のコロニーを単離させるため、第3および第4象限でも同様に繰り返します。直ちに凍結グリセロールストックを嫌気チャンバーから取り出し、-80 °Cの冷凍庫に戻します。

c difficile培養液から胞子を精製するため、プレートを37 °Cで一晩嫌気培養します。凍結グリセロールストックからの菌株は、前のセグメントで示した手順に従い、還元済みBHISプレートに接種します。

37°Cで一晩、嫌気的にインキュベートし、翌日に個別のコロニーをいくつかの還元済み70 30プレートにリストレークします。その後、37°Cで24〜48時間、嫌気的にインキュベートします。

胞子が形成されたら、プレートを嫌気チャンバーから取り出します。滅菌済みの白金耳を用いてプレート上の細胞を掻き取り、10 millilitersの滅菌済み1 XPBSに再懸濁します。プレートを廃棄し、細胞を3000 Gで15分間遠心分離してペレット化します。

上清を除去し、1 mLの1 XPBS再懸濁液を加えて懸濁させ、同様の手順で再度ペレット化します。細胞をPBSで2回洗浄し、4 °Cで一晩インキュベートして、翌日の栄養細胞および母細胞の溶菌を促進させます。その後、70 °Cで20分間インキュベートし、残留している栄養細胞を死滅させます。1 mLあたりのCFUを決定するために、各胞子調製液を1 XPBSで段階希釈し、0.1% Sodium Toro collateを添加した還元BHISプレートに播種します。プレートを37 °Cで最低24時間インキュベートした後、コロニー数を計測します。

胞子は1×PBSに懸濁し、短期間の保存であれば室温で、長期間の保存であれば4°Cで保存できます。ここでは、BHISおよびColumbia嫌気性羊血寒天培地で培養したC. difficileの例を示します。

C difficileは不規則な形状のコロニーを形成し、どちらの培地においても平坦ですりガラスのような外観を呈します。パネルAは、濃縮非選択培地であるBHIS寒天培地で24時間培養した、エリスロマイシン感受性臨床分離株c difficile 630 Eを示しています。37 °Cにおいて、パネルBに示すColumbia嫌気性羊血寒天培地上のコロニーは、白色光下でのBHIS上のコロニーと同様の外観を示します。

しかし、この培地を使用することで、パネルCに示されているように、長波長紫外線照射下でC. difficileが示す緑色またはシトラス色の蛍光を検出することも可能です。この手順に続き、液体培地での増殖曲線、DNAおよびRNAの解析、単一コロニーの分離、PCR、その他のC. difficileに適した分子生物学的手法および操作、さらには動物実験へのC. difficile胞子の利用などを行い、追加の分子生物学的な疑問を解明することができます。このビデオを視聴することで、嫌気環境下でC. difficileの栄養細胞および胞子を分離・培養し、維持する方法について十分に理解できたはずです。

C. difficileは胃腸疾患を引き起こす可能性のあるヒトおよび動物の病原体であることに留意してください。C. difficileを用いた実験は、適切なバイオセーフティーレベル2の条件下で実施する必要があります。