Name: 培養およびメンテナンスクロストリジウム·ディフィシル嫌気性環境での (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-14T21:25:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: 学ぶクロストリジウム・ディフィシルの分離培養法。便検体からの単離、グリセロールストックの作成、および胞子ストックの調製と計数を含む。嫌気性環境下での維持技術を習得し、抗生物質関連下痢の原因菌研究に活用できます。

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私たちは親切嫌気室の写真を提供するためのコイ研究所に感謝したいと思います。この作品は、DK087763（SMM）とSTEP /ハワードヒューズカリキュラム開発フェローシップ（ANE）を付与国立衛生研究所によってサポートされていました。

<ol><li>Hall, I. C., O'Toole, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+flora+in+new-borin+infants+-+With+a+description+of+a+new+pathogenic+anaerobe%2C+Bacillus+difficilis%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Dis.+Child%22%5BJournal%5D)">Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis.</a> Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).</li>
<li>Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clindamycin-Associated+Colitis+-+Prospective+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Intern.+Med%22%5BJournal%5D)">Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study.</a> Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).</li>
<li>Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clostridium+difficile+30+years+on%3A+what+has%2C+or+has+not%2C+changed+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Antimicrob.+Agents%22%5BJournal%5D)">Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why.</a> Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).</li>
<li>Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+Clostridium+difficile+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Treatment of Clostridium difficile infection.</a> Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).</li>
<li>Dubberke, E. R., Olsen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+Clostridium+difficile+on+the+healthcare+system%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Burden of Clostridium difficile on the healthcare system.</a> Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).</li>
<li>Bouza, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+Clostridium+difficile+infection%3A+understanding+the+healthcare+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Infect%22%5BJournal%5D)">Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden.</a> Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).</li>
<li>Peery, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Burden+of+gastrointestinal+disease+in+the+United+States%3A+2012+update%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update.</a> Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).</li>
<li>Deakin, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Clostridium+difficile+spo0A+gene+is+a+persistence+and+transmission+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor.</a> Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).</li>
<li>Drasar, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultivation+of+anaerobic+intestinal+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cultivation of anaerobic intestinal bacteria.</a> J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).</li>
<li>Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+CO+2+cabinet+for+the+cultivation+of+strict+anerobes%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes.</a> Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).</li>
<li>Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+anaerobic+systems+for+the+isolation+of+anaerobic+bacteria+from+clinical+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Clin.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens.</a> Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).</li>
<li>Bacic, M. K., Smith, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+and+cultivation+of+bacteroides+species%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11(2008).</li>
<li>Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proficiencies+of+three+anaerobic+culture+systems+for+recovering+periodontal+pathogenic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria.</a> J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).</li>
<li>Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cultivation+of+Treponema+microdentium+as+surface+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Oral.+Biol%22%5BJournal%5D)">The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies.</a> Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).</li>
<li>George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+and+differential+medium+for+isolation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).</li>
<li>Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Clostridium+difficile+by+normal+hamster+cecal+flora+and+prevention+of+antibiotic-associated+cecitis%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis.</a> Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).</li>
<li>Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+sodium+taurocholate+to+enhance+spore+recovery+on+a+medium+selective+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile.</a> J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).</li>
<li>Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+cycloserine-cefoxitin-fructose+agar+%28CCFA%29+and+taurocholate-CCFA+for+recovery+of+Clostridium+difficile+during+surveillance+of+hospitalized+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Diagn.+Microbiol.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients.</a> Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).</li>
<li>Marler, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+five+cultural+procedures+for+isolation+of+Clostridium+difficile+from+stools%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools.</a> J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).</li>
<li>Sorg, J. A., Dineen, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+maintenance+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Laboratory maintenance of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1(2009).</li>
<li>Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of Clostridium difficile.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2(2011).</li>
<li>Lemee, L., Pons, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilocus+sequence+typing+for+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Methods.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Multilocus sequence typing for Clostridium difficile.</a> Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).</li>
<li>Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+study+of+gram-stained+stool+smears+in+diagnosis+of+Clostridium+difficile+colitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis.</a> J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).</li>
<li>Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transferable+tetracycline+resistance+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).</li>
<li>Permpoonpattana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+layers+of+Clostridium+difficile+endospores%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Surface layers of Clostridium difficile endospores.</a> J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).</li>
<li>Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SpoIVA+and+SipL+are+Clostridium+difficile+spore+morphogenetic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins.</a> J. Bacteriol. , (2013).</li>
<li>Burns, D. A., Minton, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sporulation+studies+in+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Sporulation studies in Clostridium difficile.</a> J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).</li>
<li>Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clospore%3A+a+liquid+medium+for+producing+high+titers+of+semi-purified+spores+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+AOAC+Int%22%5BJournal%5D)">Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile.</a> J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).</li>
<li>Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibiting+the+initiation+of+Clostridium+difficile+spore+germination+using+analogs+of+chenodeoxycholic+acid%2C+a+bile+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid.</a> J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).</li>
<li>O'Connor, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+chromosomal+Clostridium+difficile+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants.</a> Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).</li>
<li>Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+methods+for+recovery+of+Clostridium+difficile+from+an+environmental+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface.</a> J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).</li>
<li>Koch, C. J., Kruuv, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+release+of+oxygen+from+polystyrene+Petri+dishes%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">The release of oxygen from polystyrene Petri dishes.</a> Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).</li>
<li>Ethapa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+factors+modulate+biofilm+formation+by+the+anaerobic+pathogen+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile.</a> J. Bacteriol. , (2012).</li>
<li>Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anaerobic+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Anaerobic cell culture.</a> Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F(2009).</li>
<li>Lyras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toxin+B+is+essential+for+virulence+of+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile.</a> Nature. 458, 1176-1179 (2009).</li>
</ol>

利害の対立が宣言されていません。

ここに記載された方法は、Cの簡単かつ迅速なリカバリを可能にヒト、マウスおよびハムスター、ならびにC.の長期保存を含む糞便サンプル、種々からディフィシルグリセロールまたは胞子ストックとしてディフィシル 。 でディフィシルは、育成することは困難生物であってもよいが、慎重な嫌気性環境の維持と無菌技術の適用は、堅調な成長と汚染の低減を提供することができます。 嫌気性チャンバー：考慮事項とメンテナンス剛性チャンバまたはビニル室：嫌気性チャンバーの2種類がある。硬質チャンバは、典型的には、苛性化学薬品の使用を可能にする、アルミニウムまたは硬質ポリマー（ 例えば、プレキシグラス又はアクリル材料）で形成されている。リジッド室はglovelessスタイルに変換され、パンクの可能性も低くなりますできますが、漏れは検出して見つけることが困難であり、剛性の室がためにいくつかの方法が必要です使用中にガス置換を補う。ポリマー単位は、多くの場合、動作するよ...

クロストリジウム·ディフィシルは、絶対嫌気性菌と人間と動物の致命的な胃腸病原体であるグラム陽性、芽胞形成細菌である。最初は新生児1、Cから糞便中に見られる共生生物として1935年に記載されてディフィシルは後に抗生物質治療2に関連した偽膜性大腸炎の原因物質であることが実証されました。Cをディフィシル感染症（CDI）は、典型的にはCのニッチを作成して、正常な結腸細菌叢の破壊をもたらし、抗生物質による治療が先行している2℃に発育ディフィシルディフィシルは、糞口経路を介して休眠胞子として送信され、その後、いくつかの毒素を生成し、重篤な疾患や大腸炎3を引き起こすことができる栄養細胞を生産する、消化管の中に発芽している。 CDIは、多くの場合、従来の治療と、これらの中に抵抗性fectionsは、頻繁に再発4です。その結果、CDIは米国5-7の医療費で最大48億ドルを担当している。 クロストリジウム·ディフィシルは、環境中の酸素でさえ低レベルに非常に敏感である。 Cのディフィシルが環境中に残留し、効率的にホストにホストから送信され、代謝的に不活性胞子の形成が重要で8です。なぜならCの実験室でのメンテナンスと操作ディフィシルは、これらの技術は、嫌気性チャンバーの使用を必要とし、制御され、嫌気性環境を必要とする。嫌気性チャンバーの使用は、偏性嫌気性菌の増加9-11回収及び単離をもたらした、分子の多くの技術が嫌気雰囲気下で行うことを可能にした。 C.に加えてディフィシルは 、ここで説明する嫌気性チャンバーの使用と保守が適用されますこのような他のクロストリジウム種（ 例えばウェルシュ菌 ）、他の胃腸の種（ 例えばバクテロイデス種12）と歯周病原体（ 例えばペプトストレプトコッカス属 13）のような他の偏性嫌気性菌に。

<table><tbody><tr><td>プロテオースペプトン No. 2</td><td>BD</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Fisher</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</</td><td>sub>Fisher</td><td>BP362</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 (無水)</td><td>Fisher</td><td>M65</td><td></td></tr><tr><td>-フルクトー</td><td>スフィ</td><td>ッシャーL96</td><td></td></tr>タ<tr><td>ウロコール酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>T4009</td><td></td></tr><tr><td>'...-サイクロセリン</td><td>シグマ</td><td>C6880</td><td></td></tr>セ<tr><td>フォキシチン</td><td>フルーカ</td><td>C4786</td><td></td></tr><tr><td>脳心臓輸液媒体</td><td>BD</td><td>237300</td><td></td></tr>プロ<tr><td>テオースペプトン</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>(NH4)2SO4Sigma</td><td></td> <td>A5132</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャー</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Σ</td><td>C7755</td><td></td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>BD</td><td>211684</td><td></td></tr><tr><td>コロンビア羊血液寒天</td><td>フィッシャー</td><td>L21928</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S27</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー</td><td>BP2291</td><td></td></tr><tr><td>滅菌接種ループ</td><td>フィッシャー</td><td>22363596</td><td></td></tr><tr><td>滅菌スワブ</td><td>フィッシャー</td><td>1495990</td><td></td></tr><tr><td>コイ ビニール 嫌気性チャンバーとアクセサリー</td><td>コイ ラボラトリー プロダクツ インク</td><td>顧客指定</td><td>これらのアイテムはラボのニーズ</td></tr><tr>に応じてカスタムオーダーされます<td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td colspan="4">TCCFA agar Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g Na2HPO4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO4 (無水) 0.1 g フルクトース 6 g 寒天 20 g 脱イオン水と 121 °C のオートクレーブで 1 L にします。C 20分間滅菌します. オートクレーブ後、 10 ml の 10% (w/v) タウロコール酸ナトリウムをフィルター滅菌 (水に溶解; 最終濃度、0.1%) 25 ml の 10 mg/ml á'...-サイクロセリン、フィルター滅菌 (水に溶解; 最終濃度、250 &mu;g/ml) 1.6 ml 10 mg/ml セフォキシチン 1.6 mL フィルター滅菌済み (水に溶解; 最終濃度 16 &mu;g/ml) BHIS Medium 脳心点滴 37 g 酵母エキス 5 g プレートの場合は、寒天15gを加えます。脱イオン水とオートクレーブで121°Cで1Lにします。 オプション (オートクレーブ後に追加): 3 ml 10% (w/v) L-システイン (水に溶解; 最終濃度, 0.03%) 10 ml の 10% (w/v) タウロコール酸ナトリウム (水に溶解; 最終濃度, 0.1%) SMC 胞子形成培地 BactoPeptone 90g プロテアーゼ ペプトン 5 g (NH4)2SO4 1 g トリス塩基 1.5 g 寒天 15 g 脱イオン水とオートクレーブを 121 °Cで 1 L にします。C 20分間滅菌します. オプション (オートクレーブ後に追加): 3 ml 10% (w/v) L-システイン (水に溶解; 最終濃度、0.03%) 70:30 Medium BactoPeptone 63 g プロテアーゼ ペプトン 3.5 g 脳心臓注入 11.1 g 酵母抽出物1.5 g (NH4)2SO4 0.7 g Tris base 1.06 g プレートの場合は、寒天15gを加えます。脱イオン水とオートクレーブで121°Cで1Lにします。Cを20分間加熱して滅菌します。オートクレーブ後、3 mLの10%(w / v)L-システイン(最終濃度、0.03%). Blood agar 既製のコロンビア嫌気性羊血液寒天プレート(Fisher Scientific、L21928)35の使用をお勧めします。 1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS) NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.44 g KH2PO4 0.27 g 脱イオン水で1Lにし、HCl.フィルターでpHを7.4に調整します使用前に滅菌してください。</td></tr></tbody></table>

培養およびメンテナンス<em&gt;クロストリジウム·ディフィシル</em&gt;嫌気性環境での

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

クロストリジウム·ディフィシルは、抗生物質関連下痢症（AAD）の主な原因であり、重要な院内感染病原体であるグラム陽性嫌気性、胞子形成細菌である。C.ディフィシルは隔離し、育成することで悪名高いことは困難であり、環境中の酸素でさえ低いレベルに非常に敏感である。ここでは、Cを単離する方法糞便サンプルからディフィシル 、その後培養することで長期保存用グリセロールストックの調製のためディフィシルが提示される。顕微鏡や動物実験を含む下流の様々なアプリケーションのために、実験室での胞子株を作製し、列挙するための手法についても説明します。これらの技術は、最適C.ための適切な条件を確保するための一貫性嫌気性環境を維持する嫌気性チャンバーを必要とするディフィシル成長。我々は、約なくチャンバの内外に物質を移送するためのプロトコルを提供する効率的かつ一貫したC.ための適切な嫌気性環境を維持するのに必要な定期的なメンテナンスのための提案と共に有意な酸素汚染を用いディフィシル栽培。

Cの例BHISコロンビア嫌気ヒツジ血液寒天培地上で増殖させディフィシルは、 図2に見ることができる。C.ディフィシルは平坦であり、両方のメディアに明らかであるすりガラスの外観を持っている不規則なコロニーを形成している。ここでは、Cのエリスロマイシンに敏感な臨床分離株ディフィシル 、630E 30は 、37°C（ 図2A）で24時間、BHIS寒天、濃縮された、非選択培地上で成長させる。コロンビア嫌気ヒツジ血液寒天培地上のコロニーは、白色光（ 図2B）の下でBHIS上に成長したのと同様に表示されますが、この培地の使用はまた、Cで示さ緑がかったりシャルトリューズ蛍光の検出を提供長波長紫外線（UV）光15（ 図2C）の下でディフィシル。C. TCCFA寒天上ディフィシルコロニーはBHIS寒天上での成長に似ています。なぜならT...

クロストリジウム·ディフィシルは、厳密な嫌気性菌で、抗生物質関連下痢（AAD）を引き起こす病原性細菌である。ここで、単離培養し、Cを維持するための方法ディフィシル栄養細胞と芽胞が記載されている。これらの技術は、最適C.ための適切な条件を確実にするために定期的なメンテナンスを必要とする、嫌気性チャンバーを必要とディフィシル栽培。

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

本手順の全体的な目的は、糞便検体からC. difficileを分離し、長期保存用のグリセロールストックを作成するためにC. difficileを培養すること、および、さまざまなダウンストリームアプリケーションに使用するための芽胞ストックを調製し、定量することです。これは、まず選択培地に塗抹して糞便検体からC. difficileを分離することで達成されます。第2のステップは、液体培地でC. difficileを増殖させ、グリセロール中でC. difficileの長期保存ストックを維持することです。次に、凍結グリセロールストックからC difficileを回収し、寒天プレートに画線します。最終ステップとして、これらのプロトコルに従い、C difficileの胞子ストックを調製し、最終的に定量します。C difficileは、その同一性を検証および確認し、適切に培養・維持するために、さまざまな培地で増殖させることができます。これらのグリセロールストックおよび培養物は、動物実験やさらなる分子生物学的研究を含む、多くのダウンストリームアプリケーションに利用可能です。キャンドルジャーなどの他の方法と比較して、ビニール製嫌気チャンバーを用いてc difficileを培養する主な利点は、厳格な嫌気環境を維持できるため、c difficileの一貫した信頼性の高い増殖が可能になることです。一般的に、これらの手法に不慣れな方は、グローブによるチャンバー内での操作性の低下や、実験を事前に綿密に計画する必要があることから、困難に直面することがあります。これらの手順の実演を行うのは、私の研究室の技術者であるJose Suarezです。まず最初に、この操作は好気条件下で実施可能です。まず、糞便サンプルの重量を量り取ります。これは、糞便中のc difficileを定量するために必要です。次に、糞便検体を1 XPBSに再懸濁し、ボルテックスミキサーで完全に再懸濁させます。続いて、ここから適切な分離、または糞便1gあたりのコロニー形成単位（CFU）を定量するため、再懸濁した糞便検体を1 XPBSで段階希釈します。C difficile の栄養細胞が酸素に曝露されないよう、嫌気条件下で手順を実施します。本実験で使用する嫌気チャンバーは 37 °C に維持されています。無菌操作を用いて行います。各段階希釈液 100 µL を、Toro collate oxetane、cyclo Seine、フルクトース寒天培地、または T-C-C-F-A プレートに塗布します。これらのプレートは、残留酸素を確実に除去するため、嫌気チャンバー内で少なくとも 1 ～ 2 時間前還元処理されています。これにより、正確な計数やその他の下流アプリケーションのためのコロニー分離が可能になります。滅菌済みの白金線を用いて、塗布した培養液をT-C-C-F-Aプレートの表面に均一に広げます。プレートを37°Cで48時間、嫌気条件下で培養します。栄養細胞の状態のc difficileが酸素への曝露によって死滅していないことを確認するため、平坦で不規則なすりガラス状の外観に基づいてc difficileのコロニーを同定します。後続のアプリケーションに向けてコロニーを単離するためのプレートは、常に嫌気チェンバー内に保持する必要があります。コロニーの計数を行う場合は、プレートを嫌気チェンバーの外に出すことができます。一度プレートをチェンバーの外に出すと、栄養細胞状態の c difficile が酸素にさらされ、死滅することに注意してください。これらの C difficile コロニーは、プレートをチャンバーに戻しても回復させることはできません。各希釈段階における C difficile コロニー数をカウントし、糞便サンプル1グラムあたりのCFU数を算出して、C difficile を培養しグリセロールストックを作製します。滅菌済みの白金線を用いて個々のコロニーをピックアップし、還元済みブレインハートインフュージョン培地にストリークします。酵母エキスを添加したBHIS寒天培地または0.03%システインを添加したBHIS寒天培地に、各画分ごとに新しい滅菌接種ループを用いて、単一コロニーを画分法により画線播種する。プレートを37°Cで16〜24時間、嫌気的に培養する。BHIS寒天培地に独立したコロニーが出現したら、単一の独立コロニーをピックアップし、0.03%L-システインを添加した10 mLの還元済みBHIS液体培地に再懸濁し、一晩培養する。37 °Cで、または培養液が濁るまで嫌気的に培養する。翌日、1.8 mLの凍結保存チューブに333 µLの50% glycerolと666 µLのC. difficile培養液を加える。分離株の15% glycerolストックを作成するため、凍結保存チューブのキャップをしっかりと閉め、混合する。ストックを直ちに嫌気チャンバーから取り出し、長期保存のために-80°Cのフリーザーに保管します。この手順を開始するには、-80°CのフリーザーからC. difficileの凍結グリセロールストックを取り出します。解凍を防ぐためです。凍結保存されたグリセロールストックを、使用前に-80°Cで保存しておいた冷却ラックに直ちに配置します。無菌操作を行い、滅菌済みの接種ループを用いて、冷却ラックに入った凍結グリセロールストックを嫌気チャンバー内に運びます。ストックをごく少量プレート上に盛り、プレートの1つの区画に画線します。プレートを90度回転させ、新しい滅菌済みの白金線を用いて第2象限に画線します。個々のコロニーを単離させるため、第3および第4象限でも同様に繰り返します。直ちに凍結グリセロールストックを嫌気チャンバーから取り出し、-80 °Cの冷凍庫に戻します。c difficile培養液から胞子を精製するため、プレートを37 °Cで一晩嫌気培養します。凍結グリセロールストックからの菌株は、前のセグメントで示した手順に従い、還元済みBHISプレートに接種します。37°Cで一晩、嫌気的にインキュベートし、翌日に個別のコロニーをいくつかの還元済み70 30プレートにリストレークします。その後、37°Cで24〜48時間、嫌気的にインキュベートします。胞子が形成されたら、プレートを嫌気チャンバーから取り出します。滅菌済みの白金耳を用いてプレート上の細胞を掻き取り、10 millilitersの滅菌済み1 XPBSに再懸濁します。プレートを廃棄し、細胞を3000 Gで15分間遠心分離してペレット化します。上清を除去し、1 mLの1 XPBS再懸濁液を加えて懸濁させ、同様の手順で再度ペレット化します。細胞をPBSで2回洗浄し、4 °Cで一晩インキュベートして、翌日の栄養細胞および母細胞の溶菌を促進させます。その後、70 °Cで20分間インキュベートし、残留している栄養細胞を死滅させます。1 mLあたりのCFUを決定するために、各胞子調製液を1 XPBSで段階希釈し、0.1% Sodium Toro collateを添加した還元BHISプレートに播種します。プレートを37 °Cで最低24時間インキュベートした後、コロニー数を計測します。胞子は1×PBSに懸濁し、短期間の保存であれば室温で、長期間の保存であれば4°Cで保存できます。ここでは、BHISおよびColumbia嫌気性羊血寒天培地で培養したC. difficileの例を示します。C difficileは不規則な形状のコロニーを形成し、どちらの培地においても平坦ですりガラスのような外観を呈します。パネルAは、濃縮非選択培地であるBHIS寒天培地で24時間培養した、エリスロマイシン感受性臨床分離株c difficile 630 Eを示しています。37 °Cにおいて、パネルBに示すColumbia嫌気性羊血寒天培地上のコロニーは、白色光下でのBHIS上のコロニーと同様の外観を示します。しかし、この培地を使用することで、パネルCに示されているように、長波長紫外線照射下でC. difficileが示す緑色またはシトラス色の蛍光を検出することも可能です。この手順に続き、液体培地での増殖曲線、DNAおよびRNAの解析、単一コロニーの分離、PCR、その他のC. difficileに適した分子生物学的手法および操作、さらには動物実験へのC. difficile胞子の利用などを行い、追加の分子生物学的な疑問を解明することができます。このビデオを視聴することで、嫌気環境下でC. difficileの栄養細胞および胞子を分離・培養し、維持する方法について十分に理解できたはずです。C. difficileは胃腸疾患を引き起こす可能性のあるヒトおよび動物の病原体であることに留意してください。C. difficileを用いた実験は、適切なバイオセーフティーレベル2の条件下で実施する必要があります。

culturing-maintaining-clostridium-difficile-an-anaerobic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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培養およびメンテナンス

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