培養およびメンテナンスクロストリジウム·ディフィシル嫌気性環境での

クロストリジウム·ディフィシルは、厳密な嫌気性菌で、抗生物質関連下痢（AAD）を引き起こす病原性細菌である。ここで、単離培養し、Cを維持するための方法ディフィシル栄養細胞と芽胞が記載されている。これらの技術は、最適C.ための適切な条件を確実にするために定期的なメンテナンスを必要とする、嫌気性チャンバーを必要とディフィシル栽培。

この手順の全体的な目標は、糞便サンプルからCディフィシルを単離してCディフィシルを培養し、長期保存用のグリセロールストックを調製し、さまざまなダウンストリームアプリケーション用の胞子ストックを調製して列挙することです。これは、まず選択培地にめっきすることにより、便サンプルからCディフィシルを単離することによって達成されます。第2のステップは、液体培地でCディフィシルを増殖させ、グリセロール中のCディフィシルストックを長期間維持することです。

Next Cディフィシルは、凍結したグリセロールストックから回収され、寒天プレートに縞模様が付けられます。最終ステップでは、C Difficile 胞子ストックを調製し、最終的にこれらのプロトコルに従って列挙します。Cディフィシルは、さまざまな培地で増殖させることで、その同定を確認・確認し、培養・維持することができます。

これらのグリセロール茎と培養物は、動物実験や追加の分子生物学研究など、多くのダウンストリームアプリケーションでさらに使用できます。ビニル嫌気性チャンバーを使用してcディフィシルを培養する主な利点は、キャンドルジャーなどの他の方法と比較して、厳密な嫌気性環境を維持できるため、cディフィシルの一貫した信頼性の高い成長が可能になることです。一般的に、これらの技術に不慣れな人は、手袋のためにチャンバー内の器用さが不足しているため、また、事前に実験を計画することが重要であるため、問題に遭遇する可能性があります。

これらの手順を実演するのは、私の研究室の技術者、ホセ・スアレスです。この手順は、好気性条件下で実行できます。まず、便のサンプルを計量します。

これは、便からcディフィシルを列挙するために必要です。次に、便サンプルを1つのXPBSとボルテックスに再懸濁して、便サンプルが完全に再懸濁されていることを確認します。次に、再懸濁した便サンプルを1つのXPBSで段階希釈して、コロニー形成単位または便のCFUパーグラムを適切に分離または列挙します。

嫌気性条件で手順を実行し、Cディフィシルの栄養細胞が酸素にさらされないようにします。この実験で使用した嫌気性チャンバーは摂氏37度に保たれています。無菌技術を使用します。

各段階希釈液を 100 マイクロリットルずつ、トロ コレート オキセタン、シクロ セーヌ、果糖寒天、または T-C-C-F-A プレートに塗布します。これらのプレートは、残留酸素の除去を確実にするために、嫌気性チャンバー内で少なくとも1〜2時間プレダウンされています。コロニーを分離し、正確な計数やその他のダウンストリームアプリケーションのために。

滅菌接種ループを使用して、適用した培養物をT-C-C-F-Aプレートの表面に均一に広げます。プレートを48時間後に摂氏37度で48時間嫌気的にインキュベートします。平らで不規則なすりガラスの外観に基づいてcディフィシルコロニーを特定し、栄養価の高いcディフィシルが酸素曝露によって死滅しないようにします。

ダウンストリームアプリケーションのためにコロニーを分離するためのプレートは、常に嫌気性チャンバー内に保管する必要があります。コロニーの列挙のために、プレートを嫌気性チャンバーの外に持ち出すことができます。プレートがチャンバーの外に持ち出されると、栄養剤のcディフィシルは酸素にさらされて死滅することに注意してください。

これらのCディフィシルコロニーは、プレートをチャンバーに戻してもレスキューすることはできません。各希釈液のCディフィシルコロニーを数え、糞便サンプル1グラム当たりのCFU数を計算して培養し、Cディフィシルのグリセロール茎を作製します。滅菌接種ループを使用して、個々のコロニーを選択し、事前に減らされた脳の心臓注入に縞模様を付けます。

酵母抽出物またはBHIS寒天プレートを添加し、各象限に新しい滅菌接種ループを使用して、0.03%システインストリークの個々のコロニーおよび象限を添加します。プレートを摂氏37度で16〜24時間嫌気的にインキュベートします。単離されたコロニーがBHIS寒天プレートに現れたら、個々の単離されたコロニーを選択し、0.03%Lのシステインを補充した10ミリリットルの還元前のBHIS液体培地でコロニーを懸濁し、一晩インキュベートします。

摂氏37度で、または培養物が濁るまで嫌気的に。翌日、333マイクロリットルの50%グリセロールと666マイクロリットルのcディフィシル培養液を1.8ミリリットルの極低温チューブに入れます。単離された株の15%グリセロールストックを作成するには、極低温チューブをしっかりとキャップし、混合します。

すぐにストックを嫌気性チャンバーから取り出し、マイナス80°Cの冷凍庫に入れて長期保存します。この手順を開始するには、マイナス80°Cの冷凍庫からcディフィシルの冷凍グリセロールストックを取り出します。解凍を防ぐため。

冷凍グリセロールストックは、使用前に摂氏マイナス80度で保管された冷却ラックにすぐに置きます。冷却ラック内の凍結グリセリンストックを、無菌技術と滅菌接種ループを使用して嫌気性チャンバーに持ち込みます。少量のストックをプレートに置き、プレートの1つの象限に縞

プレートを90度回転させ、新しい滅菌接種ループストリークを第2象限に横切って使用します。第3象限と第4象限についても繰り返して、個々のコロニーの分離を確保します。凍結したグリセロールストックを嫌気性チャンバーから直ちに取り出し、マイナス80°Cの冷凍庫に戻します。

プレートを37°Cで一晩嫌気的にインキュベートし、c difficile培養物から胞子を精製します。凍結グリセロールストックから事前に還元されたBHISプレートへの菌株。前のセグメントで示した手順に従います。

翌日、摂氏37度で一晩嫌気的にインキュベートします。個々のコロニーをいくつかの捕食に再配置すると、70 30プレートが減少しました。37°Cで24〜48時間嫌気的にインキュベートします。

胞子が形成されたら、嫌気性チャンバーからプレートを取り出します。滅菌接種ループを使用してプレートをこすり落とし、10ミリリットルの滅菌XPBSに細胞を再懸濁します。プレートを廃棄し、細胞を3000Gで15分間ペレット

上清を取り除き、1ミリリットルのXPBSレスサスを追加し、この方法で再び懸濁してペレット化します。PBSで細胞を2回洗浄し、摂氏4度で一晩インキュベートして翌日の栄養細胞と母細胞の溶解を助け、摂氏70度で20分間インキュベートして、残留栄養細胞を殺します。ミリリットルあたりのCFUを測定するには、各胞子調製物を1つのXPBSで連続希釈し、プレ還元BHISと0.1%トロナトリウムコレートプレートにプレートを重ねて、コロニーを計数する前に摂氏37度で最低24時間インキュベートします。

胞子は、短期保存の場合は摂氏4度、長期保存の場合は摂氏4度の温度で、どちらの部屋でも1つのXPBSに保存できます。A.BHISとコロンビアの嫌気性羊で育てたcディフィシルの一例です。血液寒天培地はここで見ることができます。

Cディフィシルは、平らで、両方の培地で明らかなすりガラスのような外観を持つ不規則なコロニーを形成します。パネルAは、エリスロマイシン感受性の臨床が、濃縮された非選択的培地であるBHIS寒天培地で24時間増殖した分離株cディフィシル630Eであることを示しています。コロンビアの嫌気性ヒツジの摂氏37度のコロニーで、パネルBに示されている血液寒天は、白色光の下でBHISで成長したものと同様に見えます。

しかし、この培地の使用は、この手順に従ってパネルCに示す長波紫外線下でCディフィシルが示す緑がかったまたは柑橘系の蛍光の検出も提供する。液体培地、DNAおよびRNAの成長曲線、単離コロニー、PCR、その他の分子生物学的手法、cディフィシルに適した操作、および動物研究のためのcディフィシル胞子の利用などの他の方法も、追加の分子生物学の質問に答えるために実行できます。このビデオを見れば、嫌気性環境下で培養物を分離し、c difficile栄養細胞と胞子を維持する方法について十分に理解できるはずです。

cディフィシルは、胃腸疾患を引き起こす可能性のあるヒトおよび動物の病原体であることを忘れないでください。c difficile を用いた実験は、適切なバイオセーフティレベル 2 の条件下で実施する必要があります。