の相互作用を研究黄色ブドウ球菌フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

次の実験の全体的な目標は、ブドウ球菌フェノール、可溶性モドリン、またはPSMがヒト好中球に及ぼす影響を研究することです。これは、まずヒトの血液から好中球を分離し、その後のin vitro分析を行うことで達成されます。次に、好中球に蛍光色素を充填し、阻害剤の有無にかかわらずPSMの濃度シリーズと混合するか、またはPSMアルファプロモーターGFPレポーターコンストラクトを含むSレウス菌を食作用させることができます。

最終的には、PSM刺激による好中球の活性化は、フローサイトメトリーと食作用のある人によるGFPの発現によって監視できます。この方法により、細菌は蛍光顕微鏡で分析することができます。ブドウ球菌、フェニル、大豆、モリン、または好中球の影響を研究することができます。

もちろん、この方法は、他の多くの細胞タイプ、刺激およびアンタゴニストに適用することができます。この方法の顕微鏡部分のアイデアは、好中球内のPSMの影響を観察する方法について話し合ったときに最初に思いつきました。細菌のGFP発現構造とタイムラプス顕微鏡を使用することで、まさにそれが可能になります。

ヘパリン処理された静脈血の5本のチューブを引いた後、12ミリリットルの1.119グラム/ミリリットルの密度のfial溶液を50ミリリットルのチューブに注ぎ、次に10ミリリットルの1.077グラム/ミリリットルの密度のFIコール溶液を慎重に重ねます。次に、血液を等量のPBSで希釈し、20〜25ミリリットルの血液を各二重層のfiコール勾配に慎重に層化します。Gの396倍、摂氏22度で勾配を20分間遠心分離します。

次に、滅菌ピペットチップを取り付けた真空ポンプを使用して、上部の黄色のプラズマ層とPBMC層を吸引します。そして、3番目の白い層。次に、小さなプラスチックピペットを使用して、各チューブから多形核好中球またはPMN画分を新しい50ミリリットルチューブに移します。

調製したばかりのプレクールに、ヒト血清アルブミンまたはR-P-M-I-H-S-Aを添加したPMIを各チューブに加えると、総容量が50ミリリットルになります。次に、細胞をスピンダウンし、真空ポンプで上清を吸引し、赤い赤血球とPMNを含むペレットを穏やかにボルテックスします。次に、9ミリリットルの滅菌脱イオン水を細胞に加え、タイマーを開始します。

正確に 30 秒を追加します。10倍濃縮PBSを1ミリリットル加えて、高浸透圧ショックを止めます。次に、総容量50ミリリットルの冷たいR-P-M-I-H-S-Aで細胞を洗浄します。

上清を取り除いた後、赤血球の溶解により白くなった各口蓋に1ミリリットルのR-P-M-I-H-S-Aを追加します。その後、蘇生し、ピペッティングで懸濁し、ペレットを1つのチューブに混ぜ合わせます。次に、セルを数え、濃度を10の1倍から1ミリリットルあたり7番目のセルに調整します。

次に、1ミリリットルあたり10〜6個の細胞に2マイクロモルのインフルエンザoh 3:00 AMをR-P-M-I-H-S-Aで5倍ロードします。また、チューブをアルミホイルで覆って光から保護します。次に、撹拌中の温度で細胞を20分間インキュベートします。

その間に、最終濃度の10倍で刺激の3倍の段階希釈を準備します。次に、30マイクロリットルの刺激物を、等量の新たに調製した10倍濃縮阻害剤または緩衝液と室温で10分間予備インキュベートします。次に、10ミリリットルのR-P-M-I-H-S-Aで細胞を洗浄し、細胞を新鮮なR-P-M-I-H-S-Aに10ミリリットルあたり6番目の細胞の5倍で再懸濁します。

フロー解析の直前に、細胞を R-P-M-I-H-S-A で 1 ミリリットルあたり 10 倍から 6 番目の細胞に希釈し、ファックス管あたり 200 マイクロリットルの細胞を追加します。振とうやピペッティングで細胞を活性化させないように注意しながら、フローサイトメーターの1本目のチューブにロードします。3秒待ってから、固定時間(たとえば8秒)後に取得を開始し、チューブを取り外して、刺激の最低希釈度の50マイクロリットルをサンプルにすばやく追加します。

すぐにチューブをリロードし、取得を続行します。希釈シリーズが終了したら、新しいシリーズを測定する前に、フローサイトメーターの針を新しいR-P-M-I-H-S-Aで洗浄します。最後のサンプルを流した後、フローサイトメトリー解析ソフトウェアでデータを解析し、細菌のGFP発現を解析します。

PMN食作用が目的のレポーターコンストラクトをブロスに一晩含むSous株を増殖させた後、細胞をOD 6 60 0 0.01に希釈することにより、一晩培養中に発現したGFPを除去します。培養物を OD 60 0 0.1 に成長させます。細胞を1〜30に希釈し、培養物が再びOD 6 60の0.1に達するまで成長を監視します。

次に、遠心分離によって細菌を収集します。細胞をDPBSとResusで一度洗浄します。カルチャを一時停止します。

元の体積の1から10を加算すると、OD 6 60が1.0、または10の約5倍から10の8分の1 CFU/mmLが得られます。次に、細菌をR-P-M-I-H-S-Aで新たに分離されたPNSと10対1の比率で混合します。次に、プールしたヒト血清を、細胞溶液中のプールしたヒト血清の10分の1の合計終末量に加えます。

細胞混合物を摂氏37度で10分間振とうすることにより、食作用を刺激します。次に、充填された細菌のPMNを1ミリリットルあたり5番目の細胞の10の5倍に希釈し、細胞の250マイクロリットルを8ウェルチャンバーのカバースリップの各ウェルに移します。最後に、40倍対物レンズを装備し、暗環境チャンバーに包まれた倒立顕微鏡で細胞を画像化し、明視野とGFPチャネルの両方で5〜10分ごとにカバースリップチャンバーの複数の場所で画像を取得し、細菌のGFP産生をリアルタイムで追跡し、好中球を合成PSMアルファ3の濃度シリーズとインキュベートすると、用量依存性の迅速な活性化が得られます。カルシウムフラックスで測定した細胞。

PSM α 3ペプチドを0.01%0.1%または1%ヒト血清と事前にインキュベートすると、刺激がカルシウム応答を誘発する能力が有意に阻害されました。再び用量依存的に1%血清で。.これらのPSMα3濃度では、活性化はほとんど見られません。

これらの画像では、A PSM alpha GFPレポーターコンストラクトを含む食作用細菌を含む2つの好中球が示されています。細菌は食作用の約1時間後に蛍光を発し始め、PSMアルファプロモーターからのGFPの発現を示しています。好中球の外側の細菌は蛍光を発せず、PSMαの発現が急速にオンになるのは、細菌が食作用しているときだけであることを示しています。

この手順を試みるときは、最適な結果を得るために常に新鮮な好中球を使用することを覚えておくことが重要です。このビデオをご覧になった方で、フローサイトメトリーによるカルシウムフラックスの測定方法と、蛍光顕微鏡による真核細胞内の細菌の遺伝子発現の測定方法についてご理解いただけたでしょうか。