Name: の相互作用を研究黄色ブドウ球菌フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 40 s
Description: 学ぶ黄色ブドウ球菌由来PSMが好中球に与える影響について、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を用いて解析する方法です。ヒト血液から好中球を分離し、カルシウム応答や細菌貪食をリアルタイムで観察できます。

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<p class="jove_content"&gt; RNは部分的に欧州共同体のセブンス枠組みプログラム、プロジェクト番号268324からマリー·キュリーの欧州再統合補助金（ERG）によって賄われていた。</p&gt;

1。密度遠心分離によるヒト血液からのPMNの分離<ol><li>ヘパリン加静脈血の星9 mlチューブを描画します。 </li><li>次のように二重の層フィコール勾配（5管の血のための4つの勾配）を準備：50 mlチューブで密度1.119グラム/ mlのフィコール溶液を12mlのその上に密度1.077グラム/ mlのフィコール溶液を注意深く層10ミリリットルを注ぐ。 </li><li> PBS等量の血液を希釈する。 </li><li>層のデュアルレイヤーフィコール勾配注意深く希釈血液;勾配20〜25 mlであった。 </li><li>スイングバケットローターで396×gで、22°ブレーキなしCで20分間遠心します。 </li><li> （RPMI-HSA）ヒト血清アルブミン、0.05％を含む風邪RPMIを準備します。また、9ミリリットルの無菌脱イオンH 2 Oを調製プリクール氷の上でRPMIとH 2 Oの両方。 </li><li> （滅菌ピペットチップを上に置く、真空ポンプの使用と血漿（黄色）とPBMCを含むトップフィコール層、およびフィコールの第二層（白色）を吸引ピペット）。 </li><li>小さなプラスチック製のピペット（毎週2勾配のPMN画分1管）を使用して50ミリリットルチューブにPMNをを収集し、氷の上に置きます。 </li><li> 4℃で249×gで10分間、50ml及び遠心分離機の総体積℃に冷RPMI-HSAを追加する</li><li>真空ポンプ、ボルテックス優しくペレット（赤血球とのPMN）の使用と上清を脱ぐ。 </li><li> 9ミリリットル滅菌脱イオンH 2 Oを追加して、タイマーを開始。 1ミリリットル10倍濃縮されたPBSを追加することにより、正確に30秒後にハイパー浸透圧ショックを停止します。注：30秒は非常に重要です。 </li><li> 4℃で249×gで10分間、50ml及び遠心分離機の総体積℃に冷RPMI-HSAを追加する</li><li>真空ポンプを利用して上清を脱いで、定義されたボリューム（1-2 ml）をRPMI-HSAで1チューブにPMNペレットを収集します。 </li><li>細胞の量を決定し、1.10 7細胞/ mlの濃度を調整します。ドナーに応じて、単離されたPMNの収率はbetweになる血液の各9ミリリットルチューブから専用5×10 6と3×10 7 PMNは</li></ol> 2。人間のPMNにおけるカルシウム動員の評価のためのフローサイトメトリーアッセイ<ol><li> 2μMとロードセル（5×10 6細胞/ ml）のFluo-3-AM室温で20分、光から保護し、ロッキングプラットフォームシェーカー例えば使用、ゆっくりとロッキング用RPMI-HSAとインキュベートした。 </li><li>その間に10倍の最終濃度で刺激の段階希釈（ 例えば 3倍）をご用意。 PSMα3は、このプロトコルで使用されるが、好中球に作用する任意のGPCR刺激は好適である。 </li><li> RPMI-HSAで受容体の10倍濃縮された阻害剤を準備します。阻害剤は、室温で10分間阻害等量の刺激（PSMα3で例えば HDL）プレインキュベートし、25μlの刺激に作用するとき。 </li><li>室温で249×gで、10 RPMI-HSA mlの遠心機を追加することで、細胞を洗浄。 5×に細胞を再懸濁し10 6細胞/ ml。 </li><li>ただ、実験前、RPMI-HSAで2×10 6細胞/ mlに細胞を希釈し、FACSチューブあたり200μlのセルを追加。希薄化後のPMNは非常に壊れやすいです。自動活性化につながるこの濃度ではあまりにも長い間それらを維持、同じことは、積極的な揺れやペッティングのために保持しています。 </li><li>フローサイトメーターにチューブを取り付け、3秒待ってから取得を開始します。一定の時間（ 例えば 8秒）の後、チューブを外して、急速にサンプルに50μlの刺激を加える。直ちに試料ホルダーにチューブを再度取り付け、買収を続行します。 </li><li>刺激の最高濃度と最低で始まり。 RPMI-HSAで各実行後に定期的にフローサイトメーターの針を洗ってください。 </li><li>フローサイトメトリー分析ソフトウェアを使用してデータを分析する。刺激を加えた後、それに刺激の添加前の平均蛍光シグナルを比較して、交流を計算するために適切な正および負のコントロールを使用測定された各希釈用tivati​​on強度。 </li></ol>あるいは、阻害剤は受容体阻害剤とプレインキュベートした細胞に作用したとき。 3。 PMNはによって貪食後の細菌GFP発現の蛍光顕微鏡分析<ol><li> S.を育てるブロス中晩関心のレポーターコンストラクトを（レポータープラスミドを維持するために必要な抗生物質）を含む黄色ブドウ球菌株 。この場合PSMαGFPレポーター構築物を含む株をMW2はLB培地5mlの50ミリリットルプラスチックチューブ中で増殖10に使用される。 </li><li> O / N式からすべてのGFPを削除するには、OD 660 0.01に文化を希釈し、OD 660 0.1まで成長。この文化1:30 Redilute、そして文化が0.1のOD 660に到達するまでの成長を監視する。遠心分離により細菌を収集し、DPBSに一度洗う。 1.0またはRのOD 660を得るために、元のボリュームの1時10に懸濁しoughly 5.10 8 CFU / mlの。 </li><li> 1.5 mlのマイクロチューブでRPMI-HSA（比率10:1）で新たに単離したPMN（1.10 6 / ml）で細菌を（1.10 7 / ml）を混合し、10％の最終濃度にプールされたヒト血清を追加します。 37時10分°C食作用を刺激するための揺れプラットフォームに振る。 5.10 5のPMN / mlで8よくチェンカバースリップのウェルに250μlのピペットにバクテリアを搭載したPMNを希釈。 </li><li>顕微鏡で細菌とのイメージのPMNを。 40X/0.85 NA目標装備倒立顕微鏡は、うまく機能し、37℃で安定した環境を維持するために暗い環境室に包まれるべき℃のカメラの明視野と時間におけるGFPの生産をフォローするGFPチャネルの両方のすべての5-10分を使用してプリセット位置の数のための画像を取得する。 </li></ol>

<ol><li>Rigby, K. M., DeLeo, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+innate+host+defense+against+Staphylococcus+aureus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in innate host defense against Staphylococcus aureus infections.</a> Semin. Immunopathol. 34, 237-259 (2012).</li>
<li>Voyich, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+Mechanisms+Used+by+Staphylococcus+aureus+to+Avoid+Destruction+by+Human+Neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into Mechanisms Used by Staphylococcus aureus to Avoid Destruction by Human Neutrophils.</a> The Journal of Immunology. 175, 3907-3919 (2005).</li>
<li>Kobayashi, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neutrophil+destruction+following+phagocytosis+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Innate+Immun%22%5BJournal%5D)">Rapid neutrophil destruction following phagocytosis of Staphylococcus aureus.</a> J. Innate Immun. 2, 560-575 (2010).</li>
<li>DeLeo, F. R., Otto, M., Kreiswirth, B. N., Chambers, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-associated+meticillin-resistant+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Community-associated meticillin-resistant Staphylococcus aureus.</a> The Lancet. 375, 1557(2010).</li>
<li>David, M. Z., Daum, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community-Associated+Methicillin-Resistant+Staphylococcus+aureus%3A+Epidemiology+and+Clinical+Consequences+of+an+Emerging+Epidemic%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Community-Associated Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: Epidemiology and Clinical Consequences of an Emerging Epidemic.</a> Clinical Microbiology Reviews. 23, 616-687 (2010).</li>
<li>Kretschmer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Formyl+Peptide+Receptor+2+Senses+Highly+Pathogenic+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Human Formyl Peptide Receptor 2 Senses Highly Pathogenic Staphylococcus aureus.</a> Cell Host & Microbe. 7, 463(2010).</li>
<li>Prat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homolog+of+formyl+peptide+receptor-like+1+%28FPRL1%29+inhibitor+from+Staphylococcus+aureus+%28FPRL1+inhibitory+protein%29+that+inhibits+FPRL1+and+FPR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A homolog of formyl peptide receptor-like 1 (FPRL1) inhibitor from Staphylococcus aureus (FPRL1 inhibitory protein) that inhibits FPRL1 and FPR.</a> J. Immunol. 183, 6569-6578 (2009).</li>
<li>Prat, C., Bestebroer, J., de Haas, C. J. C., van Strijp, J. A. G., van Kessel, K. P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Staphylococcal+Anti-Inflammatory+Protein+That+Antagonizes+the+Formyl+Peptide+Receptor-Like+1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A New Staphylococcal Anti-Inflammatory Protein That Antagonizes the Formyl Peptide Receptor-Like 1.</a> The Journal of Immunology. 177, 8017-8026 (2006).</li>
<li>de Haas, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+inhibitory+protein+of+Staphylococcus+aureus%2C+a+bacterial+antiinflammatory+agent%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis inhibitory protein of Staphylococcus aureus, a bacterial antiinflammatory agent.</a> The Journal of Experimental Medicine. 199, 687-695 (2004).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+Staphylococcal+Phenol+Soluble+Modulins+by+Serum+Lipoprotein+Particles%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Inactivation of Staphylococcal Phenol Soluble Modulins by Serum Lipoprotein Particles.</a> PLoS Pathog. 8, e1002606(2012).</li>
<li>Kubica, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Potential+New+Pathway+for+Staphylococcus+aureus+Dissemination%3A+The+Silent+Survival+of+S.+aureus+Phagocytosed+by+Human+Monocyte-Derived+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Potential New Pathway for Staphylococcus aureus Dissemination: The Silent Survival of S. aureus Phagocytosed by Human Monocyte-Derived Macrophages.</a> PLoS ONE. 3, e1409(2008).</li>
<li>Surewaard, B. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staphylococcal+alpha-phenol+soluble+modulins+contribute+to+neutrophil+lysis+after+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Staphylococcal alpha-phenol soluble modulins contribute to neutrophil lysis after phagocytosis.</a> Cellular Microbiology. , In Press (2013).</li>
<li>Queck, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAIII-Independent+Target+Gene+Control+by+the+agr+Quorum-Sensing+System%3A+Insight+into+the+Evolution+of+Virulence+Regulation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">RNAIII-Independent Target Gene Control by the agr Quorum-Sensing System: Insight into the Evolution of Virulence Regulation in Staphylococcus aureus.</a> Molecular Cell. 32, 150(2008).</li>
<li>Baban, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+Bacterial+Imaging+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent Bacterial Imaging In Vivo.</a> J. Vis. Exp. (69), e4318(2012).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここで説明する方法では、いくつかのステップは非常に重要です。ここでは、これらをハイライト表示さ​​れます。 密度勾配遠心分離により好中球の単離のためには、遠心分離ステップの間または後に層を妨げないことが重要である。プラスチックピペットを用いて好中球を吸引すると、液体を吐出するレイヤーを邪魔するように、細胞の層の中に風船を圧迫しないように確認してください。また、視覚的に浸透圧ショック、遠心分離工程後の好中球のペレットを検査します。ペレットがまだ赤の場合赤血球溶解が十分に効果的でなかったし、もう一度繰り返す必要があります。これは定期的に発生する場合は、より完全な赤血球溶解を得るために5秒までで脱イオンH 2 Oでインキュベーション時間を増やします。 カルシウム動員法のためには、新鮮な単離された好中球を有することが重要である。一般に、細胞への冷蔵庫に保存されていることO長いも応答しません。彼らはどちらか既に追加刺激策の効果の減少の原因となって活性化したかもしれない、または死亡していると、まったく反応しません。好...

好中球（PMNは）は、 黄色ブドウ球菌 1に対する自然免疫応答において重要な役割を果たす専門の食細胞である。宿主と微生物の間に一定の戦いは双方の軍備競争につながっている。メチシリン耐性S.の最近では、コミュニティ関連（CA）の株黄色ブドウ球菌 （MRSA）は、好中球の殺害2,3の回避は非常に効率的であるように見えることが浮上している。 CA-MRSAの過剰フェノール可溶性のモジュリン（のPSM）生産は4,5高病原性と関連している。ヒト好中球は、このGタンパク質共役受容体6の活性化につながるFPR2を介してこれらのPSMを認識することができます。最古のいずれかのイベントは、カルシウムの細胞内貯蔵（のCa 2 +）の動員である。 Ca 2 +の脱顆粒と貪食7を含めたPMNのエフェクター機能の様々な二次メッセンジャーとして機能します。したがってのCa 2 +の非常に敏感な指標であるたPMNを活性化するためのPSMの機能的能力。好中球上のPSMの効果を研究するために、新鮮な好中球がカルシウム動員により蛍光を発する色素を分離し、ロードされます。フローサイトメトリー実験で急速な動員を測定することができる。この方法を使用すると、好中に有毒で他の成分の直接的な影響を検討し、これらがアクティブである最低濃度を決定することができる。私たちにとって、それはS.によって生成された多くのタンパク質の効果を研究するための非常に便利なツールです黄色ブドウ球菌は、そのようなFPR2阻害タンパク質（FLIPR）8、7 FLIPRような、および黄色ブドウ球菌 （CHIPS）9の走化性阻害タンパク質として免疫回避に関与。すべてのこれらのタンパク質は、アゴニストを認識する受容体に結合することにより、好中球カルシウム動員を阻害することが示されている。 最近では、私たちのグループはのPSMは機能10血清リポタンパク質によって阻害されていることを説明した&lt;/&gt;（商標）。これらのリポタンパク質は、PSMは、主に細胞内環境でその機能を発揮することを示し、血液や人体組織内に豊富に存在している。カルシウム動員アッセイの有用性は、血清の非常に低濃度でかなりの阻害によって示されるように、私たちは正確にのPSMによる好中球の活性化に血清リポタンパク質の効果を測定することができました。 PSMは、機能的には、血清によって阻害されるので、細胞内毒素としてのPSMための重要な機能があるという仮説を立てた。したがって、我々は貪食後のPSMの役割を決定しようとした。細胞間隙でのPSMの発現を調べるために、我々は、GFPにpsmαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食された、発現の誘導を、蛍光顕微鏡10を用いて観測した。明らかに、このTEChniqueはS.で多数の遺伝子の発現の研究を可能にする貪食後に黄色ブドウ球菌や他の病原体。 S.のために導入されたバージョン細胞間のニッチで生き残る球菌は 11 10 12自然免疫系を克服するために非常に重要であり、このニッチで活性化する遺伝子の役割を研究すると、その病原性を理解することに非常に関連しています。

<table><tbody><tr><td>Fluo-3、AM</td><td>Molecular Probes / Life Technologies</td><td>F-1241</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5442-03</td><td>密度 1.077 g/ml</td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td>密度 1.119 g/ml</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco、Life Technologies</td><td>52400-025</td><td>25 mM HEPESおよびL-グルタミンを含む</td></tr><tr><td>ライカ TCS SP5 顕微鏡</td><td>ライカMicrosystems, The Netherlands</td><td>TCS SP5</td><td>対物レンズ: HCX PL APO 40x/0.85 </td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td>測定プロセス中にチューブを取り外して交換できることが非常に重要です</td></tr></tbody></table>

の相互作用を研究<em&gt;黄色ブドウ球菌</em&gt;フローサイトメトリーとタイムラプス顕微鏡による好中球と

Studying Interactions of Staphylococcus aureus with Neutrophils by Flow Cytometry and Time Lapse Microscopy

私たちは、好中球上の黄色ブドウ球菌によって産生され、分泌されるフェノール可溶性のmodulins（PSMが）や他の毒素の影響を研究するための方法を提示する。我々は、密度勾配遠心分離を使用した新鮮な好中球を分離した好中球上のPSMの効果を研究する。これらの好中球は、カルシウム動員により蛍光を発する色素でロードされます。 PSMはによって好中球の活性化は、自由細胞内カルシウム濃度の急激かつ一過性の上昇を開始します。フローサイトメトリー実験で急速な動員は、遊離Ca 2 +濃度の増加に反応プリロードされた色素の蛍光をモニターすることによって測定することができる。この方法で用いて、我々は、好中球を活性化し、好中球活性化の特異的かつ一般的な阻害剤の効果を測定する必要がPSMの濃度を決定することができる。 細胞内空間、WでのPSMの発現を調べるために、電子GFPへPSMαオペロンのプロモーターのレポーター融合を構築した。ときS.これらのレポーター株黄色ブドウ球菌は、好中球によって貪食され、発現の誘導は、蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。

人間のPMNの内カルシウム動員の評価のためのフローサイトメトリーアッセイ FL-1におけるシグナルの増加によって示されるカルシウム流入によって測定されるように急速な活性化をもたらす合成PSMα3の濃度一連の好中球をインキュベートする。 0.01％で合成PSMα3のプレインキュベーション、0.1％または1％のヒト血清が大幅カルシウムフラックス（ 図1）を誘発する能力を阻害した。 蛍光顕微鏡を用いたPMNによる貪食後の細菌におけるGFP発現の分析 PSMα-GFPレポーターを含む貪食細菌はPSMαプロモーターからの発現を示す、貪食後に緑1〜2時間の蛍光を発するように10スタートを構築する。好中球外細菌は蛍光を発する、または細胞外細菌が高密度微小コロニーを（ 図2）を形成した後にのみ、蛍光表示されません。これらのデータは、PSMαの発現が急速に細菌がPMNを貪食されたときに切り替えられることを示してい...

我々はによって分泌のPSMや他の毒素の影響を研究するための方法を提示<em&gt;黄色ブドウ球菌</emフローサイトメトリー、蛍光顕微鏡を用いて好中球&gt;。

We present methods to study the effect of phenol soluble modulins (PSMs)  and other toxins produced and secreted by Staphylococcus  aureus on neutrophils. ...

本実験の目的は、ブドウ球菌フェノール可溶性モジュリン（PSMs）がヒト好中球に及ぼす影響を調べることです。まず、その後のin vitro解析のためにヒト血液から好中球を分離します。次に、好中球に蛍光染料を充填させ、阻害剤の有無を伴う濃度系列のPSMsと混合させるか、あるいはPSM alphaプロモーターGFPレポーター構築物を保持するS. aureus細菌を好中球に食作用させます。最終的に、PSM刺激による好中球の活性化はフローサイトメトリーによって、また食細胞によって取り込まれた細菌によるGFPの発現は蛍光顕微鏡によって解析することができます。この方法により、ブドウ球菌フェノール可溶性モジュリン（PSM）が好中球に及ぼす影響を研究することが可能です。当然ながら、この手法は他の多くの細胞型、刺激、およびアンタゴニストにも適用可能です。この手法の顕微鏡観察の部分については、好中球内部でのPSMの効果を観察する方法を検討していた際に、最初に着想を得ました。細菌のGFP発現コンストラクトとタイムラプス顕微鏡を用いることで、まさにその観察が可能になります。ヘパリン添加静脈血を5本採取した後、密度1.119 g/mLのFicoll溶液12 mLを50 mLチューブに注ぎ、その上に密度1.077 g/mLのFicoll溶液10 mLを慎重に重ねます。次に、血液を等量のPBSで希釈し、各Ficoll二層グラジエントの上に20〜25 mLの血液を慎重に重層します。ブレーキをかけずに、396 ×g、22 °Cで20分間遠心分離します。次に、滅菌済みのピペットチップを装着した真空ポンプを用いて、上層の黄色い血漿層とPBMC層を吸引します。続いて、3番目の白い層を吸引します。その後、小型のプラスチックピペットを用いて、各チューブから多形核白血球（PMN）分画を新しい50 mLチューブに回収します。新鮮に調製し、あらかじめ冷却したヒト血清アルブミン補充PMI（R-P-M-I-H-S-A）を各チューブに加え、全量を50 millilitersにします。次に、細胞を遠心分離し、上清を真空ポンプで吸引し、赤血球とPMNを含むペレットを穏やかにボルテックスします。続いて、細胞に9 millilitersの滅菌脱イオン水を加え、タイマーを開始します。正確に30秒間追加します。10倍濃縮PBSを1 mL加えて高浸透圧ショックを停止させます。その後、冷やしたR-P-M-I-H-S-Aを合計50 mL用いて細胞を洗浄します。上清を除去した後、赤血球の溶血により白色となった各ペレットに1 mLのR-P-M-I-H-S-Aを加えてください。次に、ピペッティングにより再懸濁し、ペレットを1本のチューブにまとめます。その後、細胞数をカウントし、濃度を1×10⁷ cells/mLに調整します。次に、2 µM の Fluo-3 AM を含む RPMI-HSA に、5 × 10⁶ cells/mL の細胞を添加します。そして、遮光するため、チューブをアルミホイルで覆います。続いて、攪拌しながら、規定の温度で細胞を 20 分間インキュベートします。その間に、最終濃度の10倍の刺激剤を3倍段階希釈で調製します。次に、30 µLの刺激剤を、新しく調製した10倍濃度の阻害剤またはバッファーと同量で、室温で10分間プレインキュベートします。続いて、細胞を10 mLのR-P-M-I-H-S-Aで洗浄し、新鮮なR-P-M-I-H-S-Aを用いて5 × 10⁶ cells/mLの濃度で細胞を再懸濁します。フロー分析の直前に、細胞をR-P-M-I-H-S-Aを用いて2×10⁶ cells/mLに希釈し、1本あたりのfaxチューブに200 µLの細胞液を分注します。シェーキングやピペッティングによって細胞が活性化しないよう注意しながら、最初のチューブをフローサイトメーターにセットします。3秒間待機してからデータ収集を開始し、一定の時間（例えば8秒間）が経過した後にチューブを取り出し、速やかに刺激剤の最低希釈液50 µLをサンプルに添加します。直ちにチューブを再ロードし、測定を続けます。希釈系列の測定が完了したら、新しい系列を測定する前に、フレッシュなR-P-M-I-H-S-Aでフローサイトメーターのニードルを洗浄してください。最後のサンプルの測定後、フローサイトメトリー解析ソフトウェアを用いてデータを解析し、細菌のGFP発現を分析します。PMNによる食作用の後、目的のリポーター構築物を含むS. aureus株をブロス中で一晩培養し、細胞をOD₆₀₀ 0.01まで希釈して、一晩の培養中に発現したGFPを除去します。培養液をOD₆₀₀ 0.1まで増殖させます。細胞を30倍に希釈し、培養液が再びOD₆₀₀ 0.1に達するまで増殖をモニターします。その後、遠心分離によって細菌を回収します。細胞をDPBSで1回洗浄し、再懸濁します。OD₆₀₀が1.0、または概ね5×10⁸ CFU/mLになるように、元の液量に1～10倍の量を加えて調整します。次に、細菌とR-P-M-I-H-S-Aで新鮮に単離したPNSを10:1の割合で混合します。その後、細胞溶液の全量に対して1/10の割合になるように、混合ヒト血清を加えます。細胞混合液を37 °Cで10分間振とうし、食作用を刺激します。次に、細菌を負荷したPMNを5 × 10⁵ cells/mLに希釈し、8ウェルチャンバーカバースリップの各ウェルに250 µLずつ分注します。最後に、40倍対物レンズを備え、遮光環境チャンバーに封入された倒立顕微鏡で細胞を観察し、明視野およびGFPチャネルの両方で5〜10分ごとにカバースリップチャンバー内の複数箇所で画像を撮影し、細菌のGFP産生をリアルタイムで追跡します。異なる濃度の合成PSM α3で好中球をインキュベートした結果、カルシウムフラックスによる測定で、細胞の用量依存的な急速な活性化が認められました。PSM alpha threeペプチドを0.01%、0.1%または1%のヒト血清で前インキュベートしたところ、刺激によるカルシウム応答の誘発能が有意に抑制されました。1%の血清において、再び用量依存的な抑制が認められました。これらのPSM alpha three濃度では、活性化はほとんど観察されません。これらの画像では、PSM alpha GFPレポーター構築物を保持した細菌を食作用によって取り込んだ2つの好中球が示されています。細菌は食作用から約1時間後に蛍光し始め、これはPSM AlphaプロモーターからのGFP発現を示しています。好中球外の細菌は蛍光していないことから、PSM alphaの発現は細菌が食作用によって取り込まれた時にのみ急速にオンに切り替わることがわかります。この手順を試みる際は、最適な結果を得るために、常に新鮮な好中球を使用することが重要であることを忘れないでください。このビデオを視聴することで、フローサイトメトリーによるカルシウムフラックスの測定方法、および蛍光顕微鏡を用いた真核細胞内での細菌遺伝子発現の測定方法について、十分に理解していただけたなら幸いです。

studying-interactions-staphylococcus-aureus-with-neutrophils-flow

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

この記事は、最初の臍帯静脈からヒト内皮細胞を単離するための手順を説明した後、フロー条件下で好中球の遊出を調べるために、これらの細胞を使用する方法を示します。ガラスの光学特性を有するポリマーから作られた低容量のフローチャンバーを用いて、希少細胞集団の生細胞蛍光イメージングも可能です。...

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Source: Barbero, A. M., et al. Fluorescence Assays for the Study of Mycobacterium tuberculosis Interaction with the Immune Receptor SLAMF1. J. Vis. Exp. (2025)This video demonstrates the procedure for labeling host immune receptors that bind bacterial surface antigens, enabling their detection through flow cytometry.

Analysis of Macrophage Receptor Interactions with Pathogenic Bacteria Using Flow Cytometry

このビデオは、好中球とバイオフィルムの相互作用を研究するためのin...

好中球とバイオフィルムの相互作用を研究するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、白血球の動員に対する間質細胞の影響を調査する方法を示しています。パラレルプレートフローチャンバーモデルでは、炎症誘発性サイトカインが内皮細胞による接着受容体の発現を誘導し、好中球の動員と移動を促進します。間質細胞と内皮細胞との間のクロストークは、内皮細胞への好中球動員を減少させます。...

白血球動員に及ぼす間質細胞の影響に関するIn vitroフロー調査

白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。...

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

流れから白血球を募集する炎症を起こした内皮の能力は、間葉系間質細胞によって調節されている。我々は、フローからの好中球動員を評価し、間葉系間質細胞は、このプロセスの調節に果たす役割を調べるために使用することができる一次ヒト細胞を組み込んだ2 のインビトロモデルを記述する。...

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

本研究では、定義された流路条件におけるせん断応力下で分化したヒト一次内皮細胞の表面上で産生されるフォン・ヴィレブランド因子ストリングに対する肺炎球菌の視認性の顕微鏡的モニタリングについて述べている。このプロトコルは、微分免疫染色手順を適用することにより、特定の細胞構造の詳細な可視化および細菌の定量に拡張することができる。...

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

この生菌細胞イメージングプロトコルは、時間の経過とともに単一細胞レベルで複数の細菌種間の相互作用を可視化することを可能にする。タイムラプスイメージングは、個々の細胞の運動性および生存率を含む多種細菌群集における種間相互作用を尋問するために、単一培養または共培養における各細菌種の観察を可能にする。...

単細胞間細菌相互作用の運動的可視化

本プロトコルは、好中球-バイオフィルム相互作用の研究を記載している。 黄色ブドウ球 菌バイオフィルムは in vitro で確立され、末梢血由来のヒト好中球とインキュベートされます。好中球からの酸化バースト応答を定量化し、バイオフィルム内の好中球局在を顕微鏡で測定します。...

ヒト好中球と黄色ブドウ球菌バイオフィルムの間の相互作用を視覚化および定量するための標準化されたin vitroアッセイ

このプロトコルは、イメージングフローサイトメトリーを使用して微生物の自己凝集を測定するための定量的アプローチを説明しています。...

微生物の自己凝集を研究するためのイメージングフローサイトメトリー

この原稿では、 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌の抗生物質の生存を評価するための包括的なプロトコルを提供し、プラスミドを 緑膿菌 と 黄色ブドウ球菌...

緑 膿菌 および 黄色ブドウ球 菌の不均一な表現型のタイムラプス落射蛍光顕微鏡イメージング

学ぶ黄色ブドウ球菌由来PSMが好中球に与える影響について、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を用いて解析する方法です。ヒト血液から好中球を分離し、カルシウム応答や細菌貪食をリアルタイムで観察できます。

の相互作用を研究

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