同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

次の実験の全体的な目標は、動作の変化、電位発火頻度、および細胞内カルシウム濃度などの電圧または電流の変化との間の相互作用を調べることです。これは、カルシウム感受性プローブを充填した微小電極を使用して、SMA核ニューロンを記録するための脳スライスを調製することによって達成されます。第2のステップとして、微小電極はニューロン膜で密封されます。

次に、微小電極で封止された神経膜を破裂させてカルシウム蛍光プローブを個々の神経細胞に導入し、膜とともに記録するために、電圧または電流の測定値を示す結果が得られ、2つの波長でのカルシウムプローブ蛍光の画像これらの波長での蛍光比の変化は、ニューロン内の細胞内カルシウムの変化を反映しています。その後の分析を行い、細胞のカルシウム濃度を決定することができます。この手法の主な利点は、シナプスの活性化によって生成される膜の電気的活性と細胞内カルシウムの変化を、個々の美容上核ニューロンで同時に測定できることです。

この手法を実演するのは、私の同僚であるロバート・アーウィン博士です。この手順は、ガラスのペトリ皿の上のスライス溶液で湿らせた円形の濾紙の上にラットの脳を置き、氷の上に置いて、脳のコロナを切断して小脳と脳幹を取り除き、皮質の右側と左側の一部を切り取り、視床下部を含む脳のブロックを残し、SCN視神経と視交叉を含む脳の腹側を慎重に保存します。その後、氷冷したミクロトームスライスチャンバーに脳とアロスブロックを取り付けるのに十分な大きさの佐野アクリル接着剤の薄層を広げます。

氷のように冷えた脳ブロックのco面を下にして接着剤に移し、SCNを含む面を最初に切断するために配置し、vを形成する視神経を上向きにして、アロスブロックを他の3つの面に置きます。続いて、チャンバーに氷冷スライシングバッファーを充填し、カルボゲンで連続的に泡立ちます。佐野アクリルのりは湿気で固まり、脳とアロスブロックを所定の位置に保持します。

次に、SCNを含む冠状視床下部スライスを220〜250ミクロンの厚さで切断します。なお、左のアロスブロックはカット中に外れてしまいます。これは、接着剤の塗布が不十分な場合に発生する可能性があります。

その後、SCN を含むスライスを特定します。通常、視交叉が約2〜4ミリメートルの横で白い帯のように見え、SCNが背側だけのSCNが第3脳室の両側の視交叉に2つの小さなくぼみとして現れるスライスが選択されます。顕微鏡のステージに取り付けられた摂氏36度の記録室にスライスを移します。

チャンバーには、毎分2ミリリットルの連続流記録液が充填されています。95%カルボゲンで曝気され、インラインヒーターで予熱されています。第3脳室の両側にある2つの半透明のSCN核を観察し、透過光に照らされると黒い帯のように見える視交叉の背側を観察して、SCNを特定します。

記録用の微小電極を準備するには、マイクロフィルチューブを介して4mmシリンジフィルターでろ過されたカルシウムプローブを含む内部溶液でマイクロ電極を埋め戻します。次に、マイクロ電極をマイクロ電極ホルダーに入れます。次に、電極に少量の連続的な正圧を加えます。

赤色光照明のガイダンスにより、微小電極を記録チャンバーに下げます。次に、低電力対物レンズを使用してSCN上にマイクロ電極を配置します。その後、顕微鏡を高倍率に切り替えて、SCNのサブ領域と個々のSCNニューロンを選択します。

微小電極が細胞表面に進むにつれて、微小電極に穏やかな正圧を加え続けます。表面に付着したら、穏やかな負圧を加えて、3〜10ギガオームの抵抗でシールを形成します。その後、メンブレン電圧をマイナス60ミリボルトに調整します。

次に、電極に追加の負圧を加えて細胞膜を破裂させ、細胞パッチ全体のクランプを形成します。全細胞モードに入ると、SCNニューロンの体細胞と樹状突起は蛍光プローブで満たされます。電流クランプモードでの膜電圧または電圧クランプモードでの電流を測定します。

カルシウムプローブの画像データを監視・保存している間、取得した画像は340ナノメートルと380ナノメートルの蛍光データのグラフとともに見ることができます。実験中、モノクロノメーターを使用して、SCNを紫外線に急速にさらすことにより、カルシウム測定値を定量的に取得します。340ナノメートルと380ナノメートルでは、励起光はUG 11光学フィルターを通過して400ナノメートル以上の高調波波長を制限し、400ナノメートルのDCLPダイクロイックミラーが光を組織に反射します。

放出された光は510ナノメートルの発光フィルターを通過し、カメラによって捕捉されます。結果を解析するには、初期画像から関心領域を選択し、相対蛍光強度単位に変換する背景領域を選択します。関心領域のデータは、実験中にリアルタイムで表示されます。

背景は、後で後続のデータ分析で使用されます。これは、SCNと視交叉を含む視床下部の冠状スライスの明視野画像です。BISRA 2を含む内部溶液を充填したガラス微小電極を1つのニューロンに封入します。

ここに示されているのは、電圧クランプされたSCNニューロンから記録された一連の50の電圧ステップに対するカルシウム応答です。電位依存性ナトリウム電流を0.5マイクロモルTTXで抑制し、カルシウム応答に対応する体細胞および樹状突起の関心領域のスクリーンキャプチャ画像です。これらは、可変数の電圧ステップに対するカルシウム応答の例です。

この図は、膜電圧と細胞内カルシウムの同時記録を示しています。SCNニューロンでは、電流クランプ実験を50マイクロモルのリトキシンの存在下で行いました。膜電位のわずかな脱分極は、いくつかの作用の発作を引き起こし、細胞内カルシウムの対応する上昇とその後の減少を伴う電位発火

このビデオを見れば、健康な超美容核の脳スライスを調製する方法、および電気生理学的実験とイメージング実験を同時に行う方法をよく理解できるはずです。紫外線での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に適切な目の保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。