Name: 同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶ視交叉上核ニューロンの同時電気生理学的記録とカルシウムイメージング法。bis-fura-2を用いて膜電位変化と細胞内カルシウム濃度の相互作用を解析し、シナプス活性化による神経活動を詳細に研究できます。

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この研究は、国立総合医科学研究所(GM096972)からの助成金によって資金提供されました。

1. 視床下部脳切片の調製
<ol>
	<li>動物が関わるすべての手続きについて、事前にIACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)の承認を得てください。ここで説明する動物の手順は、2013年の動物の安楽死に関するAVMAガイドラインと一致しており、オレゴン健康科学大学IACUCによって事前に承認されています。</li>
	<li>MgCl2およびCaCl2を含まない500 mLのスライシングバッファーを調製します(表1)。室温で溶液を95%O2と5%CO2で泡立て、曝気を続けながらMgCl2とCaCl2を添加します。浸透圧をショ糖で300 mOsmに調整します。浸透圧は蒸気圧浸透計で測定されます。</li>
	<li>MgCl2とCaCl2を含まない記録媒体1Lを調製します(表2)。溶液を95%O2と5%CO2で泡立て、曝気を続けながらMgCl2とCaCl2を添加します。NaOH(10 N)でpHを7.2-7.4に調整し、スクロースで浸透圧を300 mOsmに調整します。HEPES緩衝液の添加はオプションであり、pHをさらに安定させるために使用しました。</li>
	<li>スライス液および記録液は、使用前に数日間冷蔵庫に保管することができます。</li>
	<li>3%アガロースを調製し、滅菌シャーレ(深さ6 mm)に注ぎ、冷蔵します。</li>
	<li>約6 mm x 6 mm x 6 mmのアガロースを3つの立方体に切ります。</li>
	<li>生後4〜8週齢のSprague-Dawleyラットにイソフルランを深く麻酔します。麻酔の深さをテストします。麻酔の深さは、フットパッドをつまんだ後に後肢の離脱反射がない場合に適切であると見なされます。適切に麻酔をかけられると、ラットは迅速な斬首によって安楽死されます。 </li>
	<li>最初に視神経を切断するように注意しながら脳を迅速に取り出し、5%CO2と95%O2で飽和した氷冷スライス溶液に入れ、2〜3分間冷まします。</li>
	<li>脳をトリミングします。氷の上に置かれたガラスのペトリ皿にセットされた湿らせた(スライス溶液を含む)円形の濾紙に鉗子を使用して脳を置きます。</li>
	<li>脳を冠状に切開して残りの小脳と脳幹を取り除き、次に吻側皮質と側面を取り除き、視床下部を含む脳のブロックを残し、SCN、視神経、視交叉を含む側を慎重に保存します。</li>
	<li>脳とアガロースブロックを取り付けるのに十分な大きさのシアノアクリル接着剤の薄層を、氷のように冷たく乾燥したミクロトームスライスチャンバーに広げます。</li>
	<li>氷のように冷えた脳ブロックの尾側を下にして接着剤に移し、SCNを含む側を最初に切断するために配置し、視神経が上向きの「V」を形成します。</li>
	<li>アガロースブロックを他の3つの側面に置きます。5%のCO2と95%のO2で連続的に泡立った氷冷スライシングバッファーをチャンバーに充填します。シアノアクリル接着剤は、脳とアガロースブロックを所定の位置に保持する水分で固化します。</li>
	<li>SCNを含む冠状視床下部スライス(厚さ220-250μm)を振動ブレードミクロトームで切断します。通常、視交叉が直径約2〜4 mmのスライスが選択され、SCNが背側にある白い帯のように見え、3番目の脳室の両側の視交叉に2つの小さな「くぼみ」として現れます(図1A)。</li>
	<li>ライカDMLFS顕微鏡のステージに取り付けられた記録チャンバー(36°C)にスライスを置きます。チャンバーには、95% O2 と 5% CO2 で曝気され、インラインヒーターで予熱された連続流記録溶液 (2 ml/分) が充填されています。</li>
	<li>スライス調製の0.5〜8時間後に、SCNニューロンの全細胞パッチクランプおよびカルシウムイメージング記録を実行します。</li>
</ol>
2. パッチクランプ録音
<ol>
	<li>電極溶液(細胞内)溶液を、全最終水量の半分に調製します。</li>
	<li>KOH(1N)で溶液をpH7.3に調整します。</li>
	<li>残りの水を追加します。溶液の最終的な浸透圧は、280〜290 mOsmの範囲である必要があります。</li>
	<li>電極溶液を0.2μmフィルターに通し、分注(0.5 mL)をマイクロチューブに入れ、-20°Cで保存します。</li>
	<li>1 mg のビスフラ-2 ヘキサカリウム塩を 99.29 μl の 0.2 μm ろ過水と混合して、カルシウムプローブ bis-fura-2 ヘキサカリウム塩ストック溶液 (10 mM) を調製します。</li>
	<li>分注を別々のチューブ (各2-5 μl) に入れ、凍結 (-20 °C) します。</li>
	<li>使用直前に内部溶液とCa2+プローブのアリコートを解凍します。2 μl の bis-fura-2 ストック溶液を 400 μl の内部溶液に加えると、最終的に 50 μM のカルシウムプローブ濃度が得られます。溶液を混合するために簡単に縮小します。カルシウムプローブ濃度(10-250 μM)は、実験デザインとイメージングシステムによって異なります。bis-fura-2は、結合した2つのfura-2分子で構成されていることに注意してください。</li>
	<li>全細胞パッチ電極を、細胞内溶液で満たされたときに約1μmの先端直径と7〜10MΩの抵抗に2段階で引き込みます。</li>
	<li>カルシウムプローブを含む内部溶液数μlを電極に戻し、Microfilチューブを介して少量サンプル用の4mmシリンジフィルター(0.2μm)でろ過します。</li>
	<li>電極がビデオモニターで見ながら赤色光照明の下で記録チャンバーに導かれるので、電極に少量の正圧を加えます。 </li>
	<li>低電力対物レンズ(4X)を使用して、SCN上に微小電極を配置します。SCNは、第3脳室の両側と視交叉の背側にある2つの半透明の領域として識別されます(図1A)。</li>
	<li>顕微鏡を高倍率(40倍または63倍)に切り替えます。SCNおよび個々のSCNニューロンのサブ領域は、より高い倍率で記録の対象とすることができます。</li>
	<li>微小電極がニューロンの表面に進むときに、微小電極に穏やかな陽圧を加えます。</li>
	<li>微小電極に穏やかな負圧を加えて、3〜10GΩの抵抗でシールを形成します。</li>
	<li>メンブレン電圧を-60mVに調整し、アクイジションソフトウェアでアンプを制御します。</li>
	<li>電極に追加の負圧を加えて、細胞膜を全細胞モードに破裂させます。</li>
	<li>全細胞モードに入ると、SCNニューロン、体細胞、樹状突起は蛍光プローブで満たされます。</li>
	<li>膜電圧は、カルシウムプローブの画像データを監視および保存している間に、電流クランプモードまたは電圧クランプモードで電流を測定します(以下で説明)。実験中に取得した画像を、340 nm/380 nm比の蛍光データのグラフとともに表示します。</li>
</ol>
3. 細胞内Caの測定2+
<ol>
	<li>定量的なCa2+測定は、10nm帯域幅のモノクロノメーターを介して340nmおよび380nmのUV光で組織を急速に励起し、UG11光学フィルターを通過して400nmを超える高調波波長を制限することにより、一対の画像を記録することによって得られます、400nmのDCLPダイクロイック、および510±40nmの発光フィルターを介して放出された光。</li>
	<li>画像は冷却されたCCDカメラを使用して取得され、取得時間とビニングが調整され、光退色を最小限に抑え、記録速度を最大化します。</li>
	<li>定量的イメージングソフトウェアを使用して、画像を取得して表示します。</li>
	<li>初期画像から関心領域を選択し、相対蛍光強度単位データ(体細胞、樹状突起など)に変換します。また、バックグラウンド蛍光の測定領域も選択します(図1B)。</li>
	<li>生画像と定量化された光学データは、実験中に継続的に保存されます。実験後、定量化する対象領域をより正確に選択するためにより多くの時間をかけることができる場合、保存された画像は一般的に再分析されます。</li>
	<li>データは、推定された細胞内カルシウム濃度(Est[Ca2+]i)として表すことができます。340 nmでの励起およびバックグラウンド減算後に放出される光の比(R)を380 nmで割った値と、340 nmおよび380 nmでの蛍光の最大および最小の蛍光を使用して、カルシウム濃度を計算します4。バックグラウンド減算などの計算は、データ解析ソフトウェアを使用して行います。</li>
	<li>ビス-フラ-2の最大蛍光と最小蛍光のin vitro測定は、Ca2+結合に10 mM CaCl2、Ca2+フリー条件に10 mM EGTAを使用して行うことができます。プローブの Ca2+ 解離定数 Kd は、bis-fura-2 (Invitrogen) で 370 nM と見なされます。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

上記の方法は、ニューロン膜の電気的活動と細胞内カルシウム濃度の間の関連を同時に記録するための強力なツールを提供します。この方法には、全細胞パッチクランプの記録と蛍光色素を使用した細胞内カルシウムの測定という 2 つの非常によく特徴付けられた方法を組み合わせたという点で、多くの強みがあります。私たちのアプローチは、他の研究者によって説明されているものと似ています6,23。
この方法を使用する際には、いくつかの項目を考慮する必要があります。1つ目は、細胞内微小電極溶液による細胞内容物の透析につながる全細胞パッチ構成の使用です。透析は、電位依存性イオンチャネルのランダウンとセカンドメッセンジャー媒介シグナルの喪失につながる可能性があります24〜26。第二に、細胞損傷またはギガオームシールの損傷は、細胞入力抵抗の低下に関連する可能性のあるカルシウムレベルの上昇をもたらす可能性があります24。第三に、微小電極の先端が詰まらないように、プローブを含む細胞間溶液を微小電極に充填する直前にろ過する必要があります...

遺伝子発現の変化は、シナプスシグナル伝達の結果としてニューロンで起こることが知られています。興奮性神経伝達物質であるグルタミン酸によるシグナル伝達は、神経膜電位を脱分極させ、最終的に遺伝子の転写と翻訳につながる1,2。グルタミン酸によるイオン栄養受容体の活性化により、細胞外カルシウムイオンが細胞内に侵入するようになり、遺伝子転写を活性化するセカンドメッセンジャーとして重要な役割を果たすと考えられています。活動電位の発火頻度などの膜の電気的活動と細胞内カルシウム濃度の変化との関係を評価するには、全細胞パッチクランプと蛍光カルシウムプローブの定量的イメージング3-5の2つの方法を組み合わせる必要があります。シングルセル記録技術により、脳の識別可能な部分における個々のニューロンの活動を記録することができます。全細胞記録技術により、膜の電圧または電流を制御することができ、特定のイオンチャネル電流を実験的に操作することができます。蛍光カルシウムプローブを充填したマイクロピペットを使用すると、ニューロンがカルシウムプローブで十分に満たされていることも確認できます。この技術は、成人スライス調製物からの脳スライス調製物を扱う際に明らかな利点を有する、なぜなら、これらのニューロンは、より一般的な細胞透過プローブを用いてロードすることが特に困難であり、潜在的なバックグラウンド蛍光問題6−8を低減するからである。
光は、哺乳類が視床下部視交叉上核(SCN)に位置する概日時計を調整する主要な方法です。網膜で伝達された光情報は、グルタミン酸がSCN12,13で放出される網膜視床下部路(RHT)を介して9-11に伝達されます。グルタミン酸は、SCNニューロン上に位置するNMDAおよびAMPAイオノトロピック受容体を開き、カルシウムおよびナトリウムの流入を生じさせ、細胞内シグナル伝達カスケードを開始し、最終的に時計遺伝子14-17のファミリーの発現を変化させ、概日時計18-20の位相をシフトさせる。しかし、カルシウムは、イオン型グルタミン酸受容体を介して直接ニューロンに侵入するか、膜脱分極と電位依存性カルシウムチャネル(VDCC)の活性化を通じてニューロンに侵入する可能性があります21。したがって、我々は、活動電位発火やシナプス入力22から発生するような、SCNニューロンの細胞内カルシウム濃度と膜電気活性との関係を調査するための実験プロトコルを開発した。

<table><tbody><tr><td>NaCl</td>フィ<td>ッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&bull;H2O</td><td>シグマケミカル(株)</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>MgCl<サブ>2</サブ>&ブル;6H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull;2H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック社</td><td>D16-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(株)</td><td>S233-500</td><td></td></tr>ショ<tr><td>糖</td><td>フィッシャーサイエンティフィック株式会社</td><td>S5-500</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5&�素</td><td>Sigma-アルドリッチ</td><td>A8937</td><td></td></tr><tr><td>グアノシン 5&�素 -三リン酸トリス塩</td><td>ΣAldrich</td><td>G9002</td><td></td></tr><tr><td>アガロース(超高純度)</td><td>Life技術</td><td>15510-027</td><td>無菌ペトリ皿に穴を開けたゲル 厚さ6 mmの層</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6310</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5881</td><td></td></tr><tr><td>Bis-fura-2、ヘキサカリウム塩</td><td>Invitrogen</td><td>B6810</td><td>細胞不透過</td></tr>性 <tr><td>機器の名前</td><td>会社</td><td>カタログ番号</td><td>コメント</td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>VT1000S</td><td>ティッシュスライス</td></tr><tr><td>シアノアクリル接着剤 (Roti-Coll1)</td><td>Carl Roth GmbH+Co</td><td>Art-Nr. 0258.1</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Puller</td><td>Narshige International USA</td><td>PP-83</td><td></td></tr><tr><td>Microelectrode Capillary Tubes</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td></td></tr><tr><td>Microfil 34 g</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Corning</td><td>#431212</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DM LFS</td><td>4倍、40倍、40倍、63倍紫外線対物レンズ、落射蛍光付き</td></tr><tr><td>CCDカメラ</td><td>浜松</td><td>オルカ ER</td><td>12ビットCCD</td></tr><tr><td>Fura-2 フィルターキューブ</td><td>Chroma</td><td>71500A</td><td>UG11フィルター付きセット</td></tr><tr><td>ポリクロームIV</td><td>ティルフォトニクス GmBH</td><td></td><td>モノクロノメーター</td></tr><tr><td>紫外線防止安全メガネ</td><td>紫外線製品</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPC-9アンプ</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metafluor</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>イメージングソフトウェア</td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>HEKA Eletronik</td><td></td><td>データ収集ソフトウェア</td></tr><tr><td>Igor version 6</td><td>Wavemetrics</td><td></td><td>電気生理学 &Ca2+ データ分析</td></tr><tr><td>VAPRO 5520</td><td>Westcor</td><td></td><td>蒸気圧浸透圧計</td></tr></tbody></table>

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

Simultaneous Electrophysiological Recording and Calcium Imaging of Suprachiasmatic Nucleus Neurons

細胞内カルシウム濃度の調節における膜電位または電流の変化の役割を研究するために、電気生理学的および蛍光イメージング同時記録法が使用されました。明暗サイクルなどの環境条件の変化は、ニューロンや神経ネットワークの活動、哺乳類の脳のマスター概日時計の位置である視交叉上核(SCN)内の概日時計遺伝子ファミリーの発現を変化させる可能性があります。興奮性シナプス伝達は、概日時計遺伝子のリズミカルな発現をシフトするシグナル伝達経路を活性化すると考えられているシナプス後Ca2+濃度の増加につながります。SCNを含む視床下部スライスは、カルシウム指示薬bis-fura-2を含む内部溶液で満たされた微小電極を使用してパッチクランプされました。微小電極とSCNニューロン膜との間にシールが形成された後、穏やかな吸引で膜が破裂し、カルシウムプローブが体細胞と樹状突起の両方を埋めるニューロンに拡散しました。細胞内カルシウム濃度の定量的レシオメトリック測定は、膜電位または電流と同時に記録されました。これらの方法を用いて、シナプス活動や個々のニューロンの活動電位発火によって生じる細胞内カルシウム濃度の変化の役割を研究することが可能です。本発表では、脳切片に保持されている個々のSCNニューロンからの電気生理学的活動と細胞内カルシウムを同時に記録する方法を実演します。

視床下部脳切片を用い、電位固定および電流固定の両条件下のホールセルモードにおいて、細胞内カルシウムの変化を同時に記録しました。Figure 1Aに示す微小電極を、少量の正圧をかけながら高倍率（40X または 63X UV対物レンズ）で所定の位置まで降下させます。ニューロンに接触した後、緩やかな吸引によってギガオームシールを形成します。電位固定モードにおいて、細胞膜電位を -60 mV に設定した後、さらに吸引を行うことで膜を破り、ホールセル構成とします。モニターで観察すると、ニューロン内にプローブが急速に充満します。細胞体と同様の焦点面にある樹状突起を可視化できます（Figure 1A 挿入図）。あるいは、焦点を調整して遠位樹状突起におけるカルシウム変化を測定することも可能です。-60 mV の電位固定モードでの記録において、+20 mV への短時間（2 msec）のステップを 10 Hz で与えることで活動電位の発生をシミュレートしました。これは、多くの SCN ニューロンの日中の活動電位発火率の生理学的範囲内にあります(Figures 1B</str...

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。

Simultaneous electrophysiological and fluorescent imaging recording methods were used to study the role of changes of membrane potential or current in ...

次の実験の全体的な目標は、動作の変化、電位発火頻度、および細胞内カルシウム濃度などの電圧または電流の変化との間の相互作用を調べることです。これは、カルシウム感受性プローブを充填した微小電極を使用して、SMA核ニューロンを記録するための脳スライスを調製することによって達成されます。第2のステップとして、微小電極はニューロン膜で密封されます。次に、微小電極で封止された神経膜を破裂させてカルシウム蛍光プローブを個々の神経細胞に導入し、膜とともに記録するために、電圧または電流の測定値を示す結果が得られ、2つの波長でのカルシウムプローブ蛍光の画像これらの波長での蛍光比の変化は、ニューロン内の細胞内カルシウムの変化を反映しています。その後の分析を行い、細胞のカルシウム濃度を決定することができます。この手法の主な利点は、シナプスの活性化によって生成される膜の電気的活性と細胞内カルシウムの変化を、個々の美容上核ニューロンで同時に測定できることです。この手法を実演するのは、私の同僚であるロバート・アーウィン博士です。この手順は、ガラスのペトリ皿の上のスライス溶液で湿らせた円形の濾紙の上にラットの脳を置き、氷の上に置いて、脳のコロナを切断して小脳と脳幹を取り除き、皮質の右側と左側の一部を切り取り、視床下部を含む脳のブロックを残し、SCN視神経と視交叉を含む脳の腹側を慎重に保存します。その後、氷冷したミクロトームスライスチャンバーに脳とアロスブロックを取り付けるのに十分な大きさの佐野アクリル接着剤の薄層を広げます。氷のように冷えた脳ブロックのco面を下にして接着剤に移し、SCNを含む面を最初に切断するために配置し、vを形成する視神経を上向きにして、アロスブロックを他の3つの面に置きます。続いて、チャンバーに氷冷スライシングバッファーを充填し、カルボゲンで連続的に泡立ちます。佐野アクリルのりは湿気で固まり、脳とアロスブロックを所定の位置に保持します。次に、SCNを含む冠状視床下部スライスを220〜250ミクロンの厚さで切断します。なお、左のアロスブロックはカット中に外れてしまいます。これは、接着剤の塗布が不十分な場合に発生する可能性があります。その後、SCN を含むスライスを特定します。通常、視交叉が約2〜4ミリメートルの横で白い帯のように見え、SCNが背側だけのSCNが第3脳室の両側の視交叉に2つの小さなくぼみとして現れるスライスが選択されます。顕微鏡のステージに取り付けられた摂氏36度の記録室にスライスを移します。チャンバーには、毎分2ミリリットルの連続流記録液が充填されています。95%カルボゲンで曝気され、インラインヒーターで予熱されています。第3脳室の両側にある2つの半透明のSCN核を観察し、透過光に照らされると黒い帯のように見える視交叉の背側を観察して、SCNを特定します。記録用の微小電極を準備するには、マイクロフィルチューブを介して4mmシリンジフィルターでろ過されたカルシウムプローブを含む内部溶液でマイクロ電極を埋め戻します。次に、マイクロ電極をマイクロ電極ホルダーに入れます。次に、電極に少量の連続的な正圧を加えます。赤色光照明のガイダンスにより、微小電極を記録チャンバーに下げます。次に、低電力対物レンズを使用してSCN上にマイクロ電極を配置します。その後、顕微鏡を高倍率に切り替えて、SCNのサブ領域と個々のSCNニューロンを選択します。微小電極が細胞表面に進むにつれて、微小電極に穏やかな正圧を加え続けます。表面に付着したら、穏やかな負圧を加えて、3〜10ギガオームの抵抗でシールを形成します。その後、メンブレン電圧をマイナス60ミリボルトに調整します。次に、電極に追加の負圧を加えて細胞膜を破裂させ、細胞パッチ全体のクランプを形成します。全細胞モードに入ると、SCNニューロンの体細胞と樹状突起は蛍光プローブで満たされます。電流クランプモードでの膜電圧または電圧クランプモードでの電流を測定します。カルシウムプローブの画像データを監視・保存している間、取得した画像は340ナノメートルと380ナノメートルの蛍光データのグラフとともに見ることができます。実験中、モノクロノメーターを使用して、SCNを紫外線に急速にさらすことにより、カルシウム測定値を定量的に取得します。340ナノメートルと380ナノメートルでは、励起光はUG 11光学フィルターを通過して400ナノメートル以上の高調波波長を制限し、400ナノメートルのDCLPダイクロイックミラーが光を組織に反射します。放出された光は510ナノメートルの発光フィルターを通過し、カメラによって捕捉されます。結果を解析するには、初期画像から関心領域を選択し、相対蛍光強度単位に変換する背景領域を選択します。関心領域のデータは、実験中にリアルタイムで表示されます。背景は、後で後続のデータ分析で使用されます。これは、SCNと視交叉を含む視床下部の冠状スライスの明視野画像です。BISRA 2を含む内部溶液を充填したガラス微小電極を1つのニューロンに封入します。ここに示されているのは、電圧クランプされたSCNニューロンから記録された一連の50の電圧ステップに対するカルシウム応答です。電位依存性ナトリウム電流を0.5マイクロモルTTXで抑制し、カルシウム応答に対応する体細胞および樹状突起の関心領域のスクリーンキャプチャ画像です。これらは、可変数の電圧ステップに対するカルシウム応答の例です。この図は、膜電圧と細胞内カルシウムの同時記録を示しています。SCNニューロンでは、電流クランプ実験を50マイクロモルのリトキシンの存在下で行いました。膜電位のわずかな脱分極は、いくつかの作用の発作を引き起こし、細胞内カルシウムの対応する上昇とその後の減少を伴う電位発火を引き起こしました。このビデオを見れば、健康な超美容核の脳スライスを調製する方法、および電気生理学的実験とイメージング実験を同時に行う方法をよく理解できるはずです。紫外線での作業は非常に危険である可能性があり、この手順を実行するときは常に適切な目の保護具を着用するなどの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。

simultaneous-electrophysiological-recording-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、神経活動と血中酸素レベル依存（BOLD）MRI信号との関係の調査のためのプラットフォームを提供し、齧歯類の脳における同時機能的磁気共鳴イメージングと電気生理学的記録法を開発した。...

齧歯類の脳における同時fMRIと電気生理学

同定されたニューロンと摂食行動からカルシウム信号の同時記録キイロショウジョウバエ</em

皮質機能は、多数のニューロン集団のレベルで発生するので、脊椎動物の中枢神経系の機能を理解することは、多くのニューロンからの記録が必要になります。ここでは、単一セルと単スパイク解像度、ディザリングされたランダムアクセスのスキャンと閾値上の神経活動を記録する光学的方法を説明します。この方法は、高時間分解能で、最大100からニューロンに蛍光体のカルシウムシグナルを記録します。最尤アルゴリズムは、体蛍光カルシウムシグナルから基礎閾値上神経活動をdeconvolves。この方法は、確実に高い検出効率と誤検知率の低さとスパイクを検出し、神経集団を研究するために使用することができます...

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

隔離された海馬から急性脳スライスだけでなく、アストロサイトとニューロンの同時電気生理学的記録の準備...

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

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両生類網膜スライス標本における感光体と2次ニューロンからの同時ホールセル録音

2異なる脳neuropilesまたは2つの異なる解剖学的管から同時に細胞外の長期的な記録は、ミツバチに設立された。これらの録音は、単一のニューロンでだけでなく、行動する動物でのアンサンブルのレベルで異なる脳領域間での神経処理の時間的な側面の調査を可能にする。...

行動するミツバチの二つの神経の処理段階での同時長期レコーディング

このプロトコルでは、共局在脳波 (EEG) や麻酔下のラットにおける潜在的なマルチ-層流のローカル...

共局在脳波および齧歯動物のローカル フィールド電位の同時記録

本研究では、脳、心電図、筋電図、局所電界電位の同時計測と自由行動ラットの信号を呼吸するためのメソッドを紹介します。この技術は、実験のコストを削減し、データの分析を簡素化は、脳と末梢器官との間の相互作用の理解に貢献します。...

皮質局所電界電位、心電図、筋電図、呼吸リズム自由行動ラットからの同時録音

人工網膜には、視覚を発生させる能力があります。新しいプロテーゼの開発を進めるためには、移植前にデバイスを試験する ex vivo...

電気刺激フラットマウント網膜におけるカルシウムイメージング

このプロトコルは、複数の記憶関連脳領域にまたがるニューロンおよびアストロサイトからのカルシウム信号を同時に記録する方法を包括的に説明し、学習および記憶行動のパラダイムにおける応用を示しています。...

学習および記憶行動中の複数の脳領域にわたるアストロサイト-ニューロン活動を記録するための二色ファイバーフォトメトリー法

学ぶ視交叉上核ニューロンの同時電気生理学的記録とカルシウムイメージング法。bis-fura-2を用いて膜電位変化と細胞内カルシウム濃度の相互作用を解析し、シナプス活性化による神経活動を詳細に研究できます。

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

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