での採餌行動のためのシングル·フライアッセイショウジョウバエ

この手順の全体的な目標は、成虫のハエSalala Melanogasterの食物欠乏によって引き起こされる行動変化を定量化することです。これは、最初に飢えたハエを18〜24時間放置することで達成されます。2番目のステップは、個々のハエを行動チャンバーにロードすることであり、各ハエにはその中心に魅力的な臭気源が含まれています。

次に、デジタルカメラを搭載したコンピューターシステムが、各フライの位置を経時的に追跡し、記録します。後のデータ分析のための座標。最後のステップは、カスタムソフトウェアを使用して、各フライが臭気源に到達するまでの遅延を決定することです。

最終的には、このハイスループット食品探索行動アッセイを使用して、神経回路機能と行動応答との関係を研究することができます。このアッセイが既存の方法よりも優れている点は、チームメイトと同様に、単一のフライの走化性挙動を定量化できることです。この方法は、走化性行動にとってどの神経回路が重要であるか、これらの神経回路が動物の内部生理学的状態によってどのように緩和されるかなど、神経生物学の質問に答えるのに役立ちます。

このメソッドの目標は、大規模な行動データセットを短時間で取得することです。この手法は、採餌行動に関する洞察を与えてくれましたが、ローカリゼーションなどの他の行動の研究にも使用できます。この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。

適切なフライハンドリングとコンピュータソフトウェアの実行は、この実験の成功に不可欠です。一般的に、この方法に不慣れな個々の人は、手順が針の周りになるハエを優しく示す方法を学ぶのにある程度の時間と忍耐が必要なため、最初は少し苦労するかもしれません。フライコレクションの前に私の研究室の技術者に連絡してください。

実験用フライを、制御された温度と湿度の条件下で、12時間の明暗サイクルで飼育します。EECの爆発の日には、ハエを二酸化炭素下で麻酔してから、顕微鏡で性別を判定します。男性と女性を区別するために、いくつかの基本的な基準を使用できます。

男性は、女性にはないセックスコームと呼ばれる4本の足に黒い剛毛のパッチを持っています。また、オスの腹部の先端は暗いキューティクルで覆われており、メスには見られない性器が露出しており、メスのハエを集めて4〜5匹の白い目のオスと一緒に新しいフードファイルに入れ、バイアルの年齢ごとに最大30匹のハエを入れます。2〜5日間のハエは、最初に空のプラスチックバイアルの底に単一の組織を押し下げ、蒸留水で組織を完全に浸すことにより、ハエの飢餓のためにチャンバーを準備します。

次に、物を使ってティッシュを押し下げ、余分な水分をやさしく絞り出します。バイアルをひっくり返して、余分な水を捨てます。ハエの水分を補給し、飢餓室を湿らせておくのに十分な水が必要ですが、ハエを溺れさせるほどではありません。

実験開始の約18〜24時間前に、ハエを食物バイアルから飢餓チャンバーに移し、バイアルを塞ぎます。バイアルは、実験が始まるまで、制御された温度と湿度の条件下で一晩保管してください。10ミリリットルの蒸留水に100ミリグラムの低融点アロスを加えて、1%アグロ溶液を調製します。

ガラスフラスコに。アグロ溶液を電子レンジで沸騰し始めるまで加熱しますが、沸騰する前に電子レンジを止めてフラスコを一度回します。アロスが完全に溶解するまで、この手順をさらに2回繰り返します。

ホットプレート上でフラスコを保温することにより、Aros溶液を液体状態に維持します。.摂氏50度に設定し、990マイクロリットルの1%aro溶液と10マイクロリットルのアップルサイダービネガーを1.5ミリリットルのアプエンドDFチューブに加えます。1%アップルサイダービネガー溶液を作るには、50°Cに設定されたドライバスインキュベーターに入れる前に、混合されるまで溶液を渦巻き、試験室を温度や湿度などの所望の条件に設定します。

660ナノメートルのLEDパネルをオンにします。ふるいと試験プレートをお湯ですすぎ、乾燥オーブンで水分が蒸発するまで加熱します。涼しい。ふるいとプレートは試験室の温度まで下げられます。

実験を始める前に、ディフューザープレートの上に浅い皿を置き、水で満たして局所的な湿度を上げ、アロス液滴の水を隠すようにします。最後に、ふるいを水皿の上に置きます。テストプレートは透明なアクリルでできており、6つのテストアリーナで構成されています。

スライダーには、フライの装填、一時的な封じ込め、および6匹のフライをそれぞれのチャンバーに同時に放出できる保持チャンバーが含まれています。実験の開始時には、プレートの各アリーナの中央に刻まれた十字線は、臭気物質をピペットで移動する必要があることを示しています。スライダーをアクリルテストプレートに挿入します。

吸引器を綿栓を過ぎてバイアルにそっと滑り込ませ、約6匹のハエが吸引器に入るのを待ちます。それらを取り扱う際には、できるだけ穏やかにすることが重要です。写真戦術、ハエを誘発するハエの行動、薄暗い光源にバイアルの開口部を向けることによって吸引器に向かって歩くことを利用することができます。

必要に応じて、穏やかな吸引を適用して、約6匹の雌のハエを吸引することができます。白目のオスのハエは避けてください。アスピレーターの先端をテストプレートの最初の穴に挿入します。

1 つのフライが保持セルに入るのを待ち、スライダーをゆっくりと前方に進めて、別のフライを次の穴にロードします。飛ぶまで続けます。プレートの6つの保持セルすべてを占めます。

次に、1%アップルサイダービネガーのアガロ溶液の5マイクロリットルを、テストプレートの内側面の十字線の中心に直接ピペットで移します。テストプレートを中央に配置するには、Positioning tool viという名前のファイルを開きます。画面の左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。

アリーナの開口部がSIVの床に面し、臭気ターゲットがプレートの天井にくるように、テストプレートをSIBの上に置きます。位置合わせが完了したら、テストプレートの十字線をモニター画面の十字線に合わせます。モニターの左上隅にある赤い点をクリックして実行を中止し、フライの座標を追跡して記録します。

各食品検索の試用中に、取得ソフトウェアファイルを開きます。フライトラッキング6 vi.モニターの左上隅にある白い矢印をクリックして、ファイルを実行します。

ファイルに名前を付け、[OK] をクリックします。試験チャンバーのスライダーを前進させて、ハエを試験アリーナに放出します。試験室を動かさないと、座標の不適切な記録につながるので注意してください。

[スタート]をクリックし、試験チャンバー内の唯一の光源がLEDパネルであることを確認します。試験が終了したら、ふるいとビヘイビアチャンバーを取り外します。試験プレートをふるいから持ち上げ、プレートを氷に沈めてハエを取り除きます。

プレートをお湯でやさしく洗浄し、アグロスの破片を取り除きます。テストプレートを乾燥オーブンに入れて水分を取り除きます。小さなファンを約2分間回して、テストエリアを換気します。

ファンをオフにして、次のハエのグループを次のテストプレートにロードします。テキストプロトコルで説明されているように、カスタムソフトウェアを使用してデータ分析を実行します。データ分析ソフトウェアとレイアウトは、一連の分析基準に従って、10分間の試行中の各フライのパフォーマンスを評価するために使用されます。

これらの基準は、各ハエからのデータがデータ分析に使用されるかどうかを決定するために使用され、怪我、病気、ストレス、またはモチベーションの欠如のために食物検索タスクを実行できないハエを排除するように設計されています。300秒以上活動していないハエは不活性と見なされ、すでに食料源または展示物を見つけることに成功していない限り、データセットから拒否されます。非アクティブ期間後少なくとも100秒間、平均速度が毎秒10ミリメートルを超えると、アクティブ臭の初期段階で健康的な速度を示すハエのみが選択されます。データ解析では、試験の最初の50秒間に一定の速度範囲内で移動するハエのみが、アリーナ内の4つの象限すべてを通過しず、試験開始後に食料源に直行するハエが拒否されます。

半径10ミリメートル以内で最低50秒間、食料源に向かって、または食物源から離れて縫うハエは、食料源を見つけることに成功したと見なされます。ハエと臭気源からの距離を経時的に描いたプロットは、ハエの位置に目に見えるアーティファクトがあるこのまれなケースのアリーナを評価するために使用できます。トレースも拒否されます。

アーティファクトは、データ収集ソフトウェアがハエ以外の物体を検出した任意のイベントによって作成できます。それらはしばしば、アリーナを横切るか、その中心から放射状に広がる長い直線として表示されます。18時間から24時間飢餓状態にある成虫のハエは、餌を与えられたハエよりも食物関連の匂いに対する嗅覚感度が高くなります。

食の臭いの原因をうまく特定したハエの累積割合をグラフでプロットすると、飢餓状態になったハエ全体の30%が10分以内に成功していることがわかります。対照的に、餌を与えられたハエ全体の7%だけがそうしています。飢餓状態のハエは、アグロスビヒクル単独よりも酢に有意に大きな引力を示すはずであり、この観察結果はテスト条件のトラブルシューティングに使用できます。

例えば、野生型のハエを用いて摂氏32度、環境湿度35%で行われたこの餌探索実験では、酢へのハエの誘引力とアロス制御との間に有意差は検出されなかったが、これは、より暖かい試験温度下でアグロス液滴に含まれる水への引力が増加したためと考えられます。試験湿度を50〜60%に上げることにより、この行動の変化が修正され、酢への引力とアグロスビヒクルとの有意差が回復しました。一度習得すると、このテクニックは、適切に実行されれば10分間の実験的試行を含め、12で実行できます。

この手順を試みるときは、ハエを傷つけたり邪魔したりしないように、ハエを非常に優しく扱うことを忘れないでください。乾燥オーブン内では試験プレートとふるいが非常に高温になる可能性があるため、開発後はオーブンミットを着用しながら取り外す必要があることに注意してください。この技術は、神経生物学の研究者が走化性行動を探求する道を開きました。

この手法は、ハエが他の匂いの物体を見つける能力を研究するためにも適応させることができます。例えば、オスのハエにおける配偶者局在行動の研究に適用することができます。このビデオを見た後、実験の準備方法、実験条件の調整方法、実験の実行方法、各ハエの性能分析方法を十分に理解しているはずです。これにより、最終的には、臭気源をうまく特定したハエの割合を示す累積プロットが得られます。