Name: 電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-20T17:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぼう、電子プローブX線マイクロアナリシスを用いて培養ニューロンのミトコンドリアにおける総カルシウム濃度を定量的に測定する方法です。急速凍結とX線スペクトル解析により、亜細胞レベルのカルシウム動態を解明できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

私たちは、優れた技術支援のために氏クリスティーヌA.冬を感謝したいと思います。この作品は、NINDS学内研究プログラム、NIH（Z01 NS002610）の基本神経科学プログラムによってサポートされていました。

ここに記載されたアプローチは、特定の機器、ツールとソフトウェアを使用して開発されました。 Labsは、同じ実験を使用することはできませんので、アプローチは、可能な限り一般化されています。 1。急速凍結彼らは凍結の瞬間に生きている細胞であったように定量的に拡散性組織成分と化学元素の分布を保持する方法で、細胞または組織の1）「低温固定」：後述する分析方法は、極低温のためのアプローチに絶対に依存していると、2）TEMで画像化及び分析に適した超薄凍結切片の調製。これらの技術は、ここで簡単に説明しますが、他の研究室では、これらの手順を再現するために必要な詳細はこの記事の範囲を超えています。興味のある読者は、優れた最近の記事を9,14と呼ばれている。 注意：このセクションでは、液体石鹸の使用が記載されている引火性が高いと爆発する可能性あるefiedエタン;適切な予防措置が取られるべきである。また、オペレータは、液体窒素に精通している必要があります（LN 2）保護白衣、メガネ、そしてcryoresistant手袋など安全上の注意、。注：ここでは全体を通して、（鉗子など ）凍結した検体を処理するために使用されるすべてのツールは、偶発的な融解を避けるために、使用前に、LN 2で予冷されている必要があります。 カバースリップ上で培養した細胞<ol><li> LN 2冷却された中央ウェル中に-160℃で気体状エタンを凝縮して、デバイスを凍結思い切って準備します。マークに記入し、ピボットアルミ蓋、使用しないときによくカバーしています。 </li><li>濾紙ウェッジを用いて、薄い水性フィルムに、実験的に適切な条件下で培養された細胞のプラスチック製カバースリップブロット。組織に触れないようにするために、端からブロット、試行錯誤によって決定理想的な残留フィルムは、できるだけ薄いではないので、目組織表面の乾燥を蒸発させて可能にするためにある。 </li><li>クランプ鉗子でエッジカバーグラスを持ち、迅速に手動で、または重力駆動のプランジャーを用い、液体エタン中に浸す。 </li><li>長期保存容器にカバースリップ所望の数を操作するのに十分な大きさ、LN 2の近くの発泡スチロールのボールに凍結したカバーガラスを配置します。 LN 2の下で押収しないアルミスクリューキャップ缶を推奨します。 </li></ol>培養された脳スライスの急速凍結<ol start="5"><li>解剖顕微鏡下で、ビューと邪魔されず、まだ培養膜インサートに付属器官型海馬スライスを、向けます。黒シャーピー型ペンと写真でスライスのエッジ付近の膜上の基準マークを配置します。 </li><li>それでも、顕微鏡下で、約切り出す。正方形を中心とした個々のスライスに5×5ミリメートルの膜の正方形。スライスに触れたりmembranを曲げないE。 </li><li> （後述）cryoultramicrotomeに合うように作られたカスタム設計されたアルミニウム製ディスク上に、直径寒天パッドに¼によりクッション性の膜サポートスライスを、マウントします。急速に空気圧でカスタマイズされた「スラム凍結」装置を用いて、LN 2冷却型サファイアブロックに対してそれを推進することでスライスを凍結。 </li><li>培養細胞について記載したようにストレージに移動します。 </li></ol> 2。凍結切片注意点は：正常に超薄切片のドライカットのリボンを生産する、簡単で論理的ながら、訓練、忍耐とかなりの練習が必要です。 <ol><li> -135℃にcryoattachmentとクールな装備cryoultramicrotomeを焼く</li><li>約に凍結されたカバースリップをカット。シャープ、予備冷却メスを用いて3×3ミリメートルの正方形。培養物は、標準的な3に、粘性のある液体」cryoglue」に（エタノールの午前1時06分混合し、2 -プロパノール11）を上にして作品を埋め込 ​​むミクロトーム試料チャックに適合するように設計直径のアルミニウムピン。培養表面上にcryoglueが漏れないようにしてください。 -160℃で≤するcryobox温度を下げることによってcryoglueを固める<ul class="lalpha"><li>凍結した脳スライスの場合は、しっかりとネジカラーを用いてカスタムメイドの試料チャックに直接ディスクを添付します。 </li></ul></li><li>約に-スライスのカバーガラス片または識別された領域の例えば 、細胞が豊富な地域-凍結した検体の選択された領域をトリミング。ダイヤモンドのトリミングツールを使用して250×250程度のブロック面と〜100μmの深さ。 </li><li> カリフォルニア州での薄い切片のドライカットのリボン。-160℃のreferencs 4、9に記載されて本質的に、35°のダイヤモンドcryoknifeを使用。切削速度とナイフ逃げ角を経験的に決定され、良好な出発点は、9°で0.4〜0.6ミリメートル/秒である。水和された部分の公称厚さ、 すなわち標本アドバンス、Iの項では、主に圧縮のために、実際には1.5-2.0倍厚いが、一般的には80n​​mだ。満足の切片化のため、静電気防止用器具が不可欠です。ナイフエッジからデバイス0.5〜1センチメートルのイオン化の先端を置き、セクション満足なリボンが生成されるまで、出力電力を調整します。 </li><li>木製アプリケータースティックに（エポキシで）まつげを接着することによってまつげプローブを準備します。このようなプローブを使用し、100メッシュの銅グリッドを折り畳み、背後にある作業用の棚に折りインジウム箔封筒に載っ上にキャストグロー放電を行うと、炭素被覆PIOLOFORMの支持フィルム上にナイフの背面からピックアップし、転送部ナイフ。冷間プレスツールでグリッドと封筒の上半分には、を押します折り重なり。 </li><li>アルミ便利グリッドボックスとストアへの転送包まれたグリッドが、ステップ1.4で説明することができます。 </li></ol> 3。電子顕微鏡の試料のクライオトランスファー EPMAのコア測定器この研究室で120 kVので作動し、低温顕微鏡のために装備、つまり、クリーンな真空、試料面積anticontaminator、2K X 2Kの高感度デジタルカメラやクライオトランスファー試料ホルダーに設計された分析電子顕微鏡がある。両方の低·高倍率モードで顕微鏡のアライメントおよび動作条件を事前に確認して、理想的≤10 -7トル、満足なカラム真空を確認する。必要に応じてチューンアップする。 <ol><li> cryoholderのデュワー部品の真空断熱が十分であることを確認します。必要に応じてポンプ。 </li><li>顕微鏡ステージ内で高真空下にある間、その最低温度、少なくとも-160℃までcryoholderを冷却、そのコントロールボックスにホルダーを接続するケーブルを取り外す。オペレータおよび顕微鏡表面にこぼれるLN 2を最小化するためにホルダーを取り外す前に、角度計45°時計回りに傾けます。 </li><li>一体型絶縁するを冷却することによりベンチトップcryoworkstationを準備160℃〜≤Dカップ</li><li>転送（quickly!）クライオワークステーションに顕微鏡から冷却cryoholder。保有者の霜シールドを撤回。 </li><li> LN 2 cryoworkstationの作業テーブル上のストレージと場所からグリッド·サンドイッチの下で取得します。ホルダの試料ウェルについての保持リングは、テーブル上に置かれる。 </li><li>インジウム封筒を開き、cryoholderの検体ウェルに囲まれた折りたたみグリッドを移動します。提供スパナツールを使用して、保持リングとグリッドを確保し、霜シールドを閉じます。 </li><li>迅速cryoworkstationからcryoholderを削除して、顕微鏡のエアロックに挿入し、可能な限り迅速に、ポンピングシーケンスを通過。挿入時に、カラム真空の中断を最小限に抑えるがあるはずです。 </li><li> 0°チルト角度計を返します。再接続してreenergizeコントロールボックスを、試料温度が150℃≤であることを確認</li><li>のデュワーを補充試料ホルダーと真空と温度が完全に回復することができます。 </li></ol> 4。セクションの視覚的な調査<ol><li>試料を露出し、電子ビームをオンにするホルダーの霜シールドを後退させる。 </li><li>視覚的には低倍率、通常は250倍、低照度での試料を評価する。 図1に示されるように、セクションでは、薄くて滑らかで、折り畳まれていないか、または重複し、平らで十分に支持膜に付着してもよく、一般的には、グリッド·バーで隠さないようにしてください。 </li><li>必要に応じて選択した部分を撮影しています。 （注：凍結した水和の項では、ビーム誘起損傷を非常に受けやすいことから、ビーム露光を最小限に抑えます。）選択したセクションの座標を保存するために自動化されたデジタルゴニオステージを使用してください。 </li></ol> 5。セクションの凍結乾燥<ol><li>凍結乾燥切片を約するホルダ温度を増加させることによって-100°C〜30分間。 </li><li>下の-160℃以下にホルダーを再冷却。 </li><l私は&gt;イメージングの前に、熱サイクルおよび/または振動ピックアップに像ドリフトを避けるためにcryoholder制御ユニットと、物理的に切断コントローラーケーブルをオフにしてください。 </li></ol> 6。細胞およびオルガネラのイメージング凍結乾燥されたセクションの構造の画像は、約で得られる。 -160°Cのような低用量、適切なソフトウェアによって制御さ2kのX 2kのスロースキャンCCDカメラを用いてデジタル的に記録されたゼロロス像。 <ol><li>こんにちは-MAGモードでEMをアクティブにします。 </li><li>選択したセルや場所、以前に記録し、保存した高品質のセクションへの関心の細胞内の領域（TIFFのように、 図2を参照）〜2000 xで選択した画像。 （注：乾燥した切片は、現在実質的に壊れにく​​く、電子ビームによる損傷を受けにくい。 </li><li> X線分析のための関心領域（ROI）を選択するために画像を評価する。このステップは、必要に応じてEMをオンにすることができる場合には、オフラインで行うことができるオフし、室温まで温めた試料。 </li></ol> 7。 X線スペクトルの取得 X線スペクトルは、最小エネルギー分散型X線（EDX）検出器、関連するパルスプロセッサエレクトロニクスと互換取得および表示ソフトウェアからなるいくつかの商用またはカスタム設計されたX線分析装置のいずれかを用いて記録することができる。 （このラボで使用されるシステムは、 表1に記載されている。） <ol><li> 、コラム（必要な場合）にEDX検出器を挿入する対物絞りを撤回し、浮遊放射開口部を挿入し、センタリングにより、X線取得のためのEMを構成します。試料の霜汚染が回避される最低温度にcryoholderを調整するが、少なくとも-100℃以下の</li><li>ホルダの検出器に向けて20°に傾けます。 </li><li>広視野撮像条件の下で、一方がindividuaのマトリックスを分析しようとすると仮定しLのミトコンドリアは、分析のためのミトコンドリアを選択するフィールドの中央に移動し、焦点を当てています。 </li><li> 100 nmのスポットにスポットモード（一部の顕微鏡にちょうど第二凝縮フォーカスを用いたビームを集束）に移動し、CAにビーム電流を大きくしてください。3 NA（ファラデーカップまたは類似で測定した）。 </li><li>スペクトル取得ソフトウェアを起動し、表示モニターにライブの時間を表示することができます100秒の買収を、開始します。記録されたスペクトル（ 図2）を保存します。業界標準のEMSA形式が好ましい。 </li><li> EMをシャットダウンして（オフライン）分析ワークステーションに複数のスペクトルのファイルを転送します。 </li></ol> 8。 X線スペクトルの解析定性分析 EDXスペクトル（ 図2、挿入図）は、本質的なエネルギー対のX線強度のX-Yプロットである。スペクトルはTの元素組成についての定性的および定量的な情報が含まれていますピークの「特徴」エネルギーは強度がその要素の量を反映しながら、そのピークを生じさせる要素を識別するという点で、彼は、ボリュームを分析した。特徴的なピークは「連続体」、ゆっくりと変化する背景の上に乗っている。 （ 図2伝説がさらにEDXスペクトルの顕著な詳細を説明します。）全体の周期表のピーク多様体のエネルギーは、要素のよく知られた電子構造、自動的にコンポーネントを識別し、データベースへのため、すべてのEDXソフトウェアリンクによって定義されています分析対象。生理的な文脈では、EDX分析に非常に適している一般的な関心の要素は、NA（1.04 keVの時のKα）、P（2.01 keVの）、K（3.31 keVの）、およびCa（3.69 keVの）が含まれています。 <ol><li>スペクトル中の主要な要素を識別するために利用可能なソフトウェア·データベースとピーク·マッチング·ルーチンを活用。生体試料中のNa、Mgを、P、S、CL、K、およびCAのピークを見つけることを期待しています。 （注意：最後の2つの要素が重なって！） </li></ol>定量分析 EDXスペクトルの定量分析は、同定されたピークの積分面積を抽出し、この濃度値を変換することからなる。生物学的分析のために、確立されたアプローチは、（上記および図2で定義された）連続体の強度が分析され、ボリュームの乾燥質量に比例するという事実を利用するホールピーク/連続法4,7,10、ある。既知の組成の標準のスペクトルの同じ比率と比較した場合、これにより、ピーク面積/連続面積の比は、標的細胞区画中の濃度を特定する。このアプローチは、一般的ミリモル/ kg乾燥重量として表される重量当たりのモル単位での濃度を、提供することに注意してください。このユニットは珍しいとELが説明されているように解釈のため、例えば、ミリモル/ Lの湿重量またはモル/ mgタンパク質に付​​加的な変換が必要な場合があります4,10を sewhere。 <ol start="2"><li> Z = 10〜20（0.5〜4.0 keVの）との間の生物学的エレメントのピーク面積（及び誤差推定値）を抽出する、 すなわちナトリウム、およびMg、P、S、Clで、K、およびCa、解析ソフトウェアに組み込まれたフィッティングルーチンのいずれかを使用して（特に4脚注、 表1を参照）。このラボでは、シンプレックスまたは複数の最小二乗フィッティングを使用しています。このフィッティングは、KおよびCaのピークの間のオーバーラップをします（ 図2を参照） を解決するには十分注意が必要であることに注意してください。 </li><li> 1.45から1.61 keVの連続体を統合する。代替的な干渉のない領域を使用することができる。 </li><li>標準との比較により、ピーク/連続比および濃度を計算します。分析を通じてエラーを伝播する。 </li><li>生物学的変動を反映して平均値を推定するために、標準的な統計ソフトウェアや数式を使用してください。 </li></ol>

<ol><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+EFTEM+mapping+of+near+physiological+calcium+concentrations+in+biological+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens.</a> Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).</li>
<li>Aronova, M. A., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elemental+mapping+by+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).</li>
<li>Bezprozvanny, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and neurodegenerative diseases.</a> Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).</li>
<li>Fernandez-Segura, E., Warley, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+probe+X-ray+microanalysis+for+the+study+of+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology.</a> Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).</li>
<li>Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cause+and+consequence%3A+Mitochondrial+dysfunction+initiates+and+propagates+neuronal+dysfunction%2C+neuronal+death+and+behavioral+abnormalities+in+age-associated+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).</li>
<li>Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+techniques+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Novel techniques in electron microscopy.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).</li>
<li>LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontiers+in+electron+probe+microanalysis%3A+application+to+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Ultramicroscopy%22%5BJournal%5D)">Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology.</a> Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).</li>
<li>Newbury, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+new+X-ray+mapping%3A+X-ray+spectrum+imaging+above+100+kHz+output+count+rate+with+the+silicon+drift+detector%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector.</a> Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).</li>
<li>Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+electron+cryotomography+of+vitreous+cryo-sections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections.</a> J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depolarization-induced+mitochondrial+Ca+accumulation+in+sympathetic+neurons%3A+spatial+and+temporal+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics.</a> J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).</li>
<li>Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitotoxic+calcium+overload+in+a+subpopulation+of+mitochondria+triggers+delayed+death+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons.</a> J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).</li>
<li>Ritchie, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrum+simulation+in+DTSA-II%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Microanal%22%5BJournal%5D)">Spectrum simulation in DTSA-II.</a> Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).</li>
<li>Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+NMDA+receptor-dependent+calcium+loading+and+mitochondrial+dysfunction+in+CA1+vs.+CA3+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol.+Dis%22%5BJournal%5D)">Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons.</a> Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).</li>
<li>Zhang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+receptor+arrays+in+frozen-hydrated+sections+and+plunge-frozen+specimens+of+E.+coli+engineered+to+overproduce+the+hemotaxis+receptor+Tsr%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr.</a> J. Microsc. 216, 76-83 (2004).</li>
</ol>

著者らは、利害の衝突を報告していません。

ここに提示電子顕微鏡ベースの分析法をNa、K、P、および特にカルシウムを含む生物学的関心のあるいくつかの要素の検出、同定、および定量を可能にする。これらの分析は、急速凍結検体から調製した凍結切片の高品質の画像における関心構造を検索し、同定する能力により、すなわち 、内オルガネラ、解像度、細胞内で実施することができる。染色は、組織要素の位置を定量的に保持されながらも、従来の固定された、プラスチック包埋調製物構造品質に匹敵する電子画像を記録するために必要とされないことに留意されたい。 構造調査画像は低印加電子線量で記録されているが、はるかに高い用量が良好な統計値を得るのに十分な計数率でX線放射を誘発するために必要とされる。したがって、EMPAに便利顕微鏡は高電流集中プローブを形成することができなければならない。2-5 nAの25〜50ナノメートルに、ER嚢やシナプス小胞のような細胞小器官を包囲するのに適した、許容可能である。この最小限の高輝度六ホウ化ランタンの電子銃が必要になります。これらの楽器の条件下では、1月10日ミリモル/ kg乾燥重量の典型的な組織濃度のカルシ...

カルシウムイオンはシナプス伝達および遺伝子発現などの多様などの通常のプロセスにおいて重要な役割を果たして、間違いなく生物学において最も重要かつ汎用性の細胞シグナリングエンティティである。一方、カルシウムは、細胞死にも同様に重要である。特に、カルシウム、規制緩和が行程の神経損傷の重要な要因であり、パーキンソン病、アルツハイマー病および他の神経変性疾患3,5。このように、カルシウムが細胞内でどのように分布しているかを定量的に理解することが非常に重要であり、これはどのように生理学的または病態生理学的刺激、以下の変更。溶液中の遊離又は基質に結合 - - 及び細胞内カルシウム濃度は、刺激の結果として数桁にわたって変化し、この目標は、カルシウムを動的つの物理状態との間で分配されるという事実によって複雑になる。 FRの分析に利用可能ないくつかの高度な方法論がありますが細胞内カルシウムをEE、定義された細胞内区画中の総カルシウム濃度の決定は、現実的に一つのアプローチ、すなわち、電子プローブマイクロアナライザ（EPMA）に制限される。 EPMAは、透過型電子顕微鏡（TEM）に結合するX線分析技術である。 TEMの電子銃は（詳細な技術レビューのための参考文献7,4を参照）は、対象の細胞内領域に静止し、サブミクロンの電子プローブを集束し、電子の衝突の結果として放出素子特有のX線を収集し、分析する。 EPMAの利点は、単一の細胞小器官レベルの解像度とsubmillimolar感度があります。しかし実際には、EPMAは、試料調製および分析のための専門cryotechniquesや計測が必要です。ここでは、EPMAを用いた細胞内カルシウムの測定のための適切なツール、技術および器具が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムは、特別のIです神経変性疾患におけるミトコンドリアのカルシウム過負荷果たしている重要な役割の都合nterest。

<table><tbody><tr><td colspan="4">試薬/材料</td></tr><tr><td>Thermanoxプラスチックカバースリップ</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>72280</td><td></td></tr><tr><td>培養インサート</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>6ウェルプレート用</td></tr><tr><td>クライオピン</td><td>ライカマイクロシステム</td><td>ズ 16701952</td><td>溝付き</td></tr><tr><td>ウッドアプリケーター</td><td>EM Sciences</td><td>72300</td><td></td></tr><tr><td>折り畳み式電子顕微鏡グリッド</td><td>Ted Pella</td><td>4GC100/100</td><td>100メッシュ</td></tr><tr><td>インジウム箔</td><td>Alfa Aesar</td><td>13982</td><td>0.25 mm thick</td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Plunge 凍結装置</td><td>Leica Microsystems</td><td>KF-80</td><td></td></tr><tr><td>Slam 凍結装置</td><td>LifeCell</td><td>CF-100</td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome</td><td>Leica Microsystems</td><td>UC6</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム用クライオアタッチメント</td><td>ライカマイクロシステムズ</td><td>FC6</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドクライオトリミングツール</td><td>ダイアトーム</td><td>クライオトリム45</td><td></td></tr><tr><td>ダイヤモンドクライオナイフ</td><td>ダイアトーム</td><td>クライオ35</td><td></td></tr><tr><td>帯電防止装置</td><td>ダイアトーム</td><td>ハウフ スタティックライン</td><td></td></tr><tr><td>クライオ電子顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>EM912 オメガ</td><td></td></tr><tr><td>EMクライオ試料ホルダー</td><td>Gatan</td><td>CT3500</td><td></td></tr><tr><td>スロースキャンCCDカメラ、2k x 2k</td><td>Troendle (TRS)</td><td>Sharpeye</td><td></td></tr><tr><td>画像取得ソフトウェア</td><td>Olympus SIS</td><td>iTEM suite</td><td></td></tr><tr><td>ED X線検出器</td><td>オックスフォード・インストゥルメンツ</td><td>Linksystem Pentafet</td><td></td></tr><tr><td>Pulse Processor</td><td>オックスフォード・インストゥルメンツ</td><td>XP-3</td><td></td></tr><tr><td>PCIバックプレーンcard</td><td>4pi Systems</td><td>Spectral Engine II</td><td></td></tr><tr><td>デスクトップコンピュータ</td><td>Apple</td><td>OS9互換機種</td><td></td></tr><tr><td>X線解析ソフト</td><td>NIST</td><td>DTSA, DTSA II</td><td></td></tr><tr><td>表計算ソフト</td><td></td><td>Microsoft Excel</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> <ol> <li> CF100は、多くの学術施設で販売されていますが、現在は市販されていません。</li> <li>CT3500クライオトランスファーホルダーのビデオチュートリアルは、次の場所にあります。これは<a href="http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4" target="_blank">http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4</a>.</li> <li>SEIIは廃止されました。ユニバーサルスペクトルエンジンは、同等の機能を備えた後のPC互換製品です。4piは製造と販売を停止しましたが、技術的なカスタマーサポートは引き続き提供しています。中古のシステムは、オンラインでよく見かけます。</li> <li>オリジナルのDTSAは、今では廃れています。NIST は、更新された後継である DTSA II 12 (<a href="http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm" target="_blank">http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm</a>)</li> </ol) をパブリック ドメインで提供しています> </td></tr></tbody></table>

電子プローブx線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis

この記事では、電子プローブ微量分析（EPMA）として知られている技術を用いて、細胞内の元素含有量の定量的測定のための適切なツール、技術および機器が記載されている。ミトコンドリア内のカルシウムが原因ミトコンドリアカルシウム過負荷が神経変性疾患で果たす重要な役割の特定の焦点となっています。方法は、X線の分析に基づいて試料の電子ビームの相互作用によって電子顕微鏡（EM）で生成された。電子顕微鏡標本における拡散元素の天然分布を維持するために、EPMAは、超薄凍結切片の調製に続いて​​組織の「低温固定」を必要とする。培養細胞または器官型スライス培養物の急速凍結は、液体エタン、またはそれぞれ、冷たい金属ブロックに対して凍結により凍結スラムプランジによって行われる。凍結切片名目上80膜厚は、CAでダイヤモンドナイフを用いたドライカットされます。 -16076 Cは、炭素/ PIOLOFORM被覆銅グリッド上にマウントされ、専門cryospecimenホルダを用いて低温EMにcryotransferred。 ≤-160℃、低電子線量で視覚的な調査と位置マッピングした後、凍結した水和凍結切片を凍結乾燥〜30分間-100℃である。乾燥した凍結切片のオルガネラレベルの画像は、スロースキャンCCDカメラおよび分析のために選択された関心対象の細胞内領域を用いて、低用量で、記録される。静止した、集束高輝度電子プローブによりROIをから出射X線はエネルギー分散型X線（EDX）関連する電子機器によって処理分析計、およびX線スペクトルとして提示することによって収集される、すなわち、エネルギー対のX線強度のプロット。追加のソフトウェアは容易に：彼らの「特性」のピークエネルギーと指紋による元素成分の1）の識別、およびピーク面積/背景の抽出による2）定量分析。本稿では、典型的な例証2の例で締めくくりEPMAアプリケーション、ミトコンドリアのカルシウム分析は、虚血耐性の基礎を明らかにした興奮毒性損傷し、別のメカニズムに重要な洞察を提供している1。

脳細胞は通常、虚血状態下で起こる病的な神経伝達物質の放出の結果として、興奮毒性損傷を維持する。 EPMAはカルシウムを大量に隔離する神経細胞のミトコンドリアの能力は、損傷のメカニズムの基礎となる方法を発見する重要でした。 図3の電子顕微鏡写真は、急速に興奮毒性刺激（100μMNMDA）へ30分間曝露した後に凍結培養海馬ニューロンの凍結乾燥した凍結切片におけるミトコンドリアの外観を表したものである。彼らは非常に腫れている、小さな、暗い介在物（赤い矢印）が含まれているように、ほとんどのミトコンドリアは、構造的に破損しているように見える。ミトコンドリア介在物（ 図3、赤と青のスペクトルのそれぞれ）内および（「マトリックス」）の排他的な元素分析を行うのに十分な解像度を有するEPMAは、介在物は、主にカルシウム及びリンから構成されていることが明らかになった。非常に高いカルシウムCONこれらの介在物の10トン- 〜1300ミリモル/ kg乾燥重量のに対し、&lt;1ミリモル/ kgのミトコンドリアを休んでの典型的なものである-彼らの異常なカルシウム緩衝能を説明し、なぜ圧倒的なこのバ...

本稿では、生理学的に定義された生物試料中の細胞下解像度で、全カルシウム含有量や分布を定量的に測定するcryoanalytical電子顕微鏡の応用について説明しています。

電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

In this article the tools, techniques, and instruments appropriate for quantitative measurements of intracellular elemental content using the technique ...

この手順の全体的な目標は、分析電子顕微鏡を使用して、培養ニューロンの細胞内分解能でカルシウムなどの生物学的に重要な元素の濃度を定量的に測定することです。これは、最初に生細胞培養物を急速凍結し、極薄のクライオ切片を調製することによって達成されます。2つ目のステップは、クライオ切片を分析電子顕微鏡に移し、凍結乾燥することです。次に、ニューロンのミトコンドリアを含む選択した細胞内領域からの画像とX線スペクトルが必要です。最後のステップは、X線スペクトルを定量的に分析して、局所的な元素濃度を決定することです。最終的に、EPMAとして知られるこのアプローチは、細胞内カルシウムシグナル伝達の根底にあるカルシウム濃度と分布の変化を明らかにするために使用されます。この手法は、蛍光法、顕微鏡法、放射性同位元素取り込み法、火炎測光法などの関連法と比較した場合の主な利点として、単一細胞小器官レベルの分解能とサブミリモルの感度です。その手順を実演するのは、当研究室のシニアスタッフサイエンティストであるDr.Natalia pvaです。まず、液体窒素冷却システムの中央ウェルで摂氏マイナス160度のガス状エタンを凝縮することにより、冷凍浴を準備します。次に、接着した細胞を含むカバースリップの端を拭き取り、液体の薄膜を除くすべてを取り除きます。サンプルを乾燥させないように注意してください。次に、カバースリップの端を持ち、サンプルを液体エタンにすばやく浸します。2〜3秒後、エタンからカバースリップを取り外し、液体窒素トランスファーの発泡スチロールボウルに入れます。凍結したカバーは、マイナス135°Cに予冷したクライオミクロトームに滑り込みます。冷凍したカバースリップを、鋭利なプレクールメスで3mm×3mm四方に切ります。次に、直径3mmのアルミニウムピンに上向きにして、エタノール1部と6部からなるクライオグルー混合物に埋め込みます。イソプロパノール。クライオボックスの温度をマイナス160°Cに下げて、クライオ接着剤を固めます。次に、カバースリップピースのセルが豊富な領域を、約250 x 250ミクロンのブロック面と100ミクロンの深さにトリミングします。ダイヤモンドトリミングツールを使用して、付属のテキストプロトコルで説明されているように、35度のダイヤモンドクライオナイフを使用して、マイナス160°Cで薄い切片のリボンをドライカットします。次に、切片をグロー放電カーボンコーティングされたピオラフォームに移します。サポートフィルムは、開いたインジウム封筒に座っている100メッシュ以上の折り畳み式銅グリッドをキャストします。グリッドが閉じています。次に、エンベロープとサンドイッチを冷却されたプレスツールでプレスしてから、試料を電子顕微鏡にクライオで移します。顕微鏡ステージ内で高真空下で、クライオホルダーを少なくともマイナス160°Cの最低温度まで冷却します。次に、ゴニオメーターを時計回りに45度傾け、ホルダーを取り外します。冷却されたクライオホルダーを顕微鏡から冷却されたクライオワークステーションにすばやく移し、ホルダーのフロストシールドを引っ込めます。次に、検体をクライオホルダーに移します。付属のスパナツールを使用してグリッドをリテーニングリングで固定し、フロストシールドを閉じます。次に、クライオホルダーをクライオワークステーションからすばやく取り外し、顕微鏡のエアロックに挿入します。サンプルクライオホルダーを所定の位置に置き、できるだけ早くポンピングシーケンスを実行します。ゴニオメーターを0度の傾きに戻します。コントロールボックスを再接続して再通電し、試験片の温度が摂氏マイナス150度以下であることを確認します。最後に、試料ホルダーのドウアーを補充し、真空と温度が完全に回復するのを待ちます。まず、250倍の倍率と低照度で試料を視覚的に評価します。選択するセクションは、薄くて滑らかで、折りたたまれたり重なったりしてはいけません。また、サポートフィルムにしっかりと取り付けられ、通常はグリッドバーで隠されないように、平らである必要があります。デジタルゴニオメーターステージを使用して、選択したセクションの座標を格納します。次に、ホルダーの温度を摂氏マイナス100度に30分間上げて、切片を凍結乾燥させて安定させ、コントラストを向上させます。次に、サンプルをマイナス160°C以下に戻し直します。高解像度イメージングの前に。クライオホルダーコントロールユニットの電源を切り、コントローラーケーブルを物理的に切断して、熱サイクルや振動ピックアップによる画像のドリフトを回避します。次に、電子顕微鏡を高倍率モードで起動します。約2000倍の倍率で、以前に位置が保存されていた選択したセクション内にある細胞内領域を調査します。有望なエリアのTIFF画像を記録して保存します。次に、X線分析の対象領域を選択して注釈を付けるために、画像を評価します。関心領域を選択したら、EDX検出器をカラムに挿入し、対物レンズの開口部を引き出し、浮遊放射線開口部を挿入して中央に配置することにより、電子顕微鏡をX線取得用に構成します。スポットモードでホルダーを検出器に向かって20度傾けます。ビーム電流を100ナノメートルのスポットで測定すると、約3ナノアンペアに増やします。次に、クライオホルダーの温度をマイナス100°C以下に上げて、広視野イメージング条件下での霜汚染を回避します。分析用のミトコンドリアを選択します。スポットモードに戻ります。スペクトル集録ソフトウェアを起動し、102回目の集録を開始します。記録したスペクトルを標準のEMSAファイル形式で保存します。統計的に有意なデータセットを確保するために、さまざまな細胞で十分なミトコンドリアをサンプリングします。EDXスペクトルを定性的に分析するには、利用可能なソフトウェアデータベースとDTSAなどのピークマッチングルーチンを利用して、スペクトルの主要な要素を特定します。ピークの特性エネルギー位置によって元素を特定します。生物学的標本には通常、ナトリウム、カシウム、リン、硫黄、塩素、カリウム、カルシウムが含まれています。カルシウムとカリウムのピークは、定量分析のために重なり合うため、特に注意してください。まず、DTSAに組み込まれているシンプレックス法など、いくつかの標準的なフィッティングアルゴリズムのいずれかを使用して、同定されたピークの積分面積を抽出し、次に1.45キロから1.61キロの電子ボルトの間の連続体を積分して乾燥質量を推定します。代替の干渉のない領域、例えば、4.0〜5.0キロの電子ボルトを使用して、一次連続体領域における無関係な非生物学的信号を避けることができる。最後に、連続体比に対するピーク比を計算し、標準試料と比較して濃度に変換します。このアプローチは、ホールピークオーバーコンティニュアム法として知られています。ここに示されているのは、細胞傷害性刺激にさらされると急速に凍結し、イオンチャネルとフラックス中のカルシウムが開く培養海馬ニューロンの顕微鏡写真です。ここに示されているミトコンドリアのほとんどは、大きく膨らみ、小さくて暗いインクルージョンを含んでいるため、構造的に損傷しているように見えます。次に、電子プローブマイクロアナリシスを使用して、ミトコンドリアインクルージョン内およびミトコンドリアインクルージョンを含まない元素分析を行いました。この研究により、インクルージョンは主に非常に大量のカルシウムとリンで構成されていることが明らかになりました。これは、その並外れたカルシウム緩衝能力と、この緩衝メカニズムを圧倒することがカルシウム過剰を引き起こし、細胞死を引き起こす理由を説明しています。学習と記憶に重要な脳の領域である海馬は、虚血後の損傷の主要な部位です。CA 3と名付けられた機能的に異なる領域は、隣接するシナプス的に接続されたca 1領域電子プローブの微量分析よりも虚血性損傷に対してはるかに脆弱ではありませんこれらのスライスの毒性刺激後の電子プローブ微量分析は、耐性のあるCA 3ニューロンよりも脆弱なCA 1ニューロンではるかに大きなカルシウム上昇を示しました。その結果、CA 1ミトコンドリアは広範な損傷と機能障害を示し、カルシウム過剰が誘発するミトコンドリア機能障害がCA Oneニューロンの選択的脆弱性の決定要因であることを示しています。このビデオを見れば、コレクションプローブの微量分析を使用して、文化的ニューロンの単一ミトコンドリアにおける総カルシウム濃度を測定する方法について十分に理解できるはずです。

measurement-total-calcium-neurons-electron-probe-x-ray

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、細胞内遊離カルシウム濃度とシナプス伝達効率の変化が同時にのガングリオンの準備で監視する方法を示し...

軟体​​動物細胞内カルシウム濃度とシナプス伝達効率での変更のモニタ<em&gt;アメフラシ</em

このビデオでは、カルシウムイメージングの背後にある概念を紹介し、成形されたアガロースウェルに含まれる線虫のタイムラプスイメージングのプロトコル例が含まれています。...

カルシウムイメージング:生きたC.エレガンスの神経活動を可視化する方法

その小さな透明体、定評の神経解剖学と従順な遺伝学的手法および試薬のホストと、...

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

膜電位または電流と細胞内カルシウム濃度の変化を同時に記録する手順が説明されています。視交叉上核ニューロンは、全細胞パッチクランプ構成のパッチクランプ電極を使用してカルシウムインジケーターbis-fura-2で満たされています。...

同時電気生理学的記録および視交叉上核ニューロンのカルシウムイメージング

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

蛍光カルシウムイメージングとin...

ゼノプス・ラエビスにおける神経前駆体特性評価のための蛍光カルシウムイメージングとその後のその後の位置ハイブリダイゼーション

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

プロトコルは、切断された神経を通してマウス運動神経終末に蛍光カルシウム色素をロードする方法を説明しています。さらに、共焦点顕微鏡を使用して末梢神経終末の高速カルシウム過渡現象を記録するためのユニークな方法が提示されます。...

共焦点顕微鏡を用いたマウス神経筋接合部におけるカルシウム過渡現象の高時間分解能による登録

現在の方法は、容易に入手可能な遺伝的にコードされたカルシウム指標を使用して、カエノラブディティスエレガンスのin...

in vivoでの神経細胞カルシウムハンドリングの細胞内イメージング

提案されたプロトコルは、マルチモーダル分析を使用して骨再生の文脈で骨形成を評価するためのグローバルなアプローチを伴います。これは、新しい骨形成に関する定性的および定量的な情報を提供し、基本的および前臨床研究の厳密性と妥当性を高めることを目的としています。...

Ex Vivoモデルにおける組織石灰化の包括的な特性評価

学ぼう、電子プローブX線マイクロアナリシスを用いて培養ニューロンのミトコンドリアにおける総カルシウム濃度を定量的に測定する方法です。急速凍結とX線スペクトル解析により、亜細胞レベルのカルシウム動態を解明できます。

電子プローブX線マイクロアナリシスによるニューロンにおける総カルシウムの測定

さらに動画を探す