宿主細胞のRNA合成でウイルス感染の効果を測定するためにクリックケミストリーを用いた
August 9th, 2013
この方法は、リフトバレー熱ウイルス（RVFV）MP-12株による感染の後、宿主細胞転写の変化を測定するためにクリックケミストリーの使用を記載している。結果は、蛍光顕微鏡を介して、定性的に可視化またはフローサイトメトリーを介して定量的に得ることができる。この方法は、他のウイルスとの使用に適合可能である。
次の実験の全体的な目標は、ウイルス感染細胞の転写活性を分析することです。まず、2 9 3細胞をリフトバレー熱ウイルスMP 12に感染させます。次に、ウリジン類似体である5ハナルウリジンで細胞を標識し、これが新生RNAに取り込まれます。
次のカップルは、蛍光アジドに5つのハナールウリジンを組み込んだ。得られた新たに合成されたRNA結果を可視化するために、感染細胞と非感染細胞の間で新たに合成されたRNAの量の違いを蛍光顕微鏡法またはフローサイトメトリーに基づいて評価しました。トリチウム化、ウリジン、または5ブロモuinによる標識とは異なり、このクリックケミストリーアプローチは放射性同位元素の使用を必要としません。
また、抗Roma UIN免疫染色よりも迅速で感度が高いです。この方法のアイデアは、異なるドリフト品質、より少ないウイルス、およびP 12 s Placeに感染した細胞の転写抑制を測定するための迅速かつ信頼性の高い方法の必要性に由来しています。12mmの丸型カバーを12ウェル組織培養プレートの各ウェルに滑り込ませます。
次に、1ミリメートルの完全DMEM培地に2、9、3細胞を播種し、加湿インキュベーターで細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。実験デザインに従って、ウイルスストックを希釈して、MP12による細胞の感染がウェルあたり総量200マイクロリットルで3回の感染の多重度になるようにします。1つは非感染コントロールとしてよく、もう1つは転写抑制のコントロールとして
良好です。次に、成長培地を取り外します。ウイルス接種物を加え、加湿インキュベーターで1時間インキュベートします。接種物を吸引します。
ウェルごとに1ミリリットルの新鮮な増殖培地を加え、感染後15時間で摂氏37度でインキュベートします。増殖培地を、1ミリモルのウリジン類似体を含む培地と交換します。模擬感染井戸の1つに5つのエタールウリジン。
また、DNA依存性RNA合成作用の阻害剤のミリリットルあたり5マイクログラムを追加します。アンチマイシンD.感染後16時間で細胞をインキュベーターに戻します。培地を取り出し、カバースリップを1ミリリットルあたり1ミリリットルのPBSで一度洗い、ウェルごとに1ミリリットルの4%パラホルムアルデヒドで細胞をしっかりと固定します。
ウェルごとに1ミリリットルのPBSで1回すすいでください。湿潤チャンバーを組み立てるには、直径10cmの細胞培養またはシャーレの底にプラスチックパラフィンフィルムを敷きます。皿の端の内側を湿らせたペーパータオルで裏打ちします。
次に、細胞を透過させるために、PBSに0.2%トリットンX 100の1ミリリットルを加え、3回のPBS洗浄後、室温で10分間インキュベートし、カバースリップを湿ったチャンバーに移してクリック反応を起こし、標識されたRNAカバーを検出します。各カバースリップには、50〜100マイクロリットルの新たに調製したClick染色溶液を1時間インキュベートします。暗闇の中で室温を追加します。
新鮮な12の井戸に1ミリリットルのPBSを追加します。ウェルプレートとカバーをウェルに滑り込ませ、ウェルに滑り込ませ、ウェルごとに1ミリリットルのPBSでさらに2回洗浄してセルをマウントします。蛍光顕微鏡法の場合は、フローラマウントGを1滴顕微鏡スライドに置きます。
カバースリップを水に浸します。余分な水を取り除きます。カバースリップセルを下にして植物相の滴に置き、G山に置き、5分間風乾します。
実験デザインに従って、2 9 3 細胞を MP 12 に感染させます。MOI を 3 に追加します。増殖培地を取り出し、希釈したウイルスストックを加え、摂氏37度、二酸化炭素5%の加湿インキュベーターで1時間インキュベー
トします。接種材料をウェルあたり培地である2ミリリットルの新鮮な成長物と交換し、ウイルスの標識と収穫に最適な時間のために摂氏37度でインキュベートします。次に、増殖培地を0.5ミリモルの5ハナルウリジンを含む培地と交換し、模擬感染井戸の1つに保管します。また、ミリリットルあたり5マイクログラムのアクトンマイシンD.1つのPBS洗浄後1時間インキュベーターに細胞を戻し、トリプシンで細胞を収穫します。
採取した細胞を、1ミリモルのEDTAを含むPBSで3回洗浄します。細胞を固定するには、ペレットを1ミリリットルの4%PFAに再懸濁し、室温で30分間インキュベートします。チューブごとに1ミリリットルのP-B-S-E-D-T-Aで1回洗ってください。
次に、0.2%Triton X 100の0.5ミリリットルの細胞をPBSに室温で10分間浸透させます。クリック反応のために、1ミリリットルのヌクレアーゼフリーPBSで1回洗浄します。Resusは、蛍光色素を含む200マイクロリットルのクリック染色溶液に細胞ペレットを懸濁します。
細胞が凝集した場合は、ピペッティングにより懸濁液を懸濁し、暗所で室温で1時間インキュベートし、ファックスバッファーで2回洗浄します。この実験では、2 9 3細胞にMP12と宿主細胞の転写を抑制する能力を欠く欠失変異ウイルスを感染させました。模擬感染細胞では、転写が進行しているため、核は真っ赤に見えます。
細胞は1時間だけEUで標識され、その後すぐに固定されるため、ほとんどのRNAは核内に残ります。対照的に、細胞をACTアンチマイシンDで処理して転写を薬理学的に阻害すると、核の赤色蛍光が著しく減少します。この蛍光は、細胞がMP12に感染した場合と同様に減少しますが、欠失変異体には感染しません。
これは、ホストの転写を抑制するものではありません。ここでは、生きたウイルスに感染する代わりに、in vitroで合成されたmRNAを細胞にトランスフェクションしました。核内の赤色蛍光シグナルは、緑色蛍光タンパク質をコードするmRNAをトランスフェクションした細胞は、未切除細胞と比較して、リフトバレー熱ウイルスをコードするmRNAをトランスフェクションしただけで転写活性が変化しなかったことを示しています。
病原性因子N SSは、赤色蛍光の減少をもたらします。定量すると、得られたフローサイトメトリーデータは散布図として表し、EUの新生RNAへの取り込みの蛍光シグナルをY軸にプロットし、抗リフトバレー熱ウイルス染色の蛍光シグナルをX軸にプロットして表すことができます。象限ゲートは、模擬感染細胞の大部分が左上の象限に位置するように設定されました。
acty DRE細胞の大部分はプロットの左下象限に位置し、感染細胞の大部分はプロットの右半分に位置していました。細胞をMP1280に感染させると、全細胞の1.5%、または抗リフトバレー熱ウイルス陽性細胞の93%が転写活性の低下を示しました。一方、R MP 12に細胞を感染させたところ、クローン13型は全細胞の91.6%、抗リフトバレー熱ウイルス陽性細胞の97%が転写活性を示し、これはM感染細胞と遜色ないものでした。
これらのデータは、蛍光のヒストグラム、EU組み入れによるRNA標識の形で表すこともできます。これに続いて、細胞内免疫染色などの他の方法を実行して、これらの細胞におけるウイルスタンパク質の発現を視覚化することができます。このビデオを見れば、クリックケミストリーを利用してウイルス感染細胞の転写活性を蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーで可視化する方法を十分に理解できるはずです。
感染性ウイルスを扱う作業は非常に危険である可能性があるため、適切なPPEを着用し、エアロゾルを吸い込まないようにするなどの予防策を講じることを忘れないでください。
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概要
この方法は、リフトバレー熱ウイルス（RVFV）MP-12株感染後の宿主細胞転写の変化を測定するためのクリックケミストリーの使用を説明しています。結果は、蛍光顕微鏡を用いて定性的に視覚化することも、フローサイトメトリーを用いて定量的に得ることもできます。
主要な研究構成要素
科学分野
- ウイルス学
- 細胞生物学
- 転写解析
背景
- リフトバレー熱ウイルス（RVFV）は、家畜と人間に影響を与える重要な病原体です。
- 感染細胞の転写変化を理解することは、治療戦略の開発に不可欠です。
- クリックケミストリーは、RNAを標識するための非放射性方法を提供します。
- この方法により、新たに合成されたRNAをリアルタイムで視覚化することができます。
研究の目的
- ウイルス感染細胞における転写活性を分析すること。
- 感染細胞と非感染細胞の間で新たに合成されたRNAを比較すること。
- RNA検出のための非放射性標識方法を利用すること。
使用された方法
- 293細胞にリフトバレー熱ウイルスMP-12を感染させる。
- ウリジン類似体である5-エチニルウリジンで細胞を標識する。
- 組み込まれた5-エチニルウリジンを蛍光アジドと結合させる。
- 蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーを用いて結果を視覚化する。
主要な結果
- 感染細胞と非感染細胞間で新たに合成されたRNAレベルに違いが観察されました。
- クリックケミストリーアプローチは、放射性同位体を使用せずにRNAを効果的に標識しました。
- 結果はフローサイトメトリーによって定量的に評価できます。
- 蛍光顕微鏡によって定性的な視覚化が達成されました。
結論
- この方法は、ウイルス感染への応答における転写変化を研究するための信頼できる方法を提供します。
- クリックケミストリーは、他のウイルスにも適応可能な多目的ツールです。
- この知見は、宿主-病原体相互作用についての理解を深めることにつながります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Click chemistry-based RNA labeling enables rapid, non-radioactive quantification of host-cell transcriptional suppression during viral infection, directly supporting early-stage antiviral target validation. This approach increases predictive confidence in mechanistic studies by providing sensitive, quantitative readouts of host-pathogen interactions. Its adaptability and scalability position it as a reusable capability for portfolio-wide virology and host response research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct measurement of transcriptional suppression to clarify viral mechanisms of host modulation.
- Supports functional validation of viral factors implicated in host transcriptional control.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing between viral strains or mutants with differential host impact.
- Provides quantitative data to inform go/no-go decisions in antiviral target selection.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible RNA synthesis assays suitable for high-content screening.
- Eliminates radioactive waste and specialized handling, streamlining assay deployment.
- Enables multiplexed detection of viral proteins and host transcriptional activity in single cells.
- Supports robust quantitative outputs for compound or genetic perturbation screens.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by quantifying host response to infection in physiologically relevant systems.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting both qualitative and quantitative analyses.
- Provides translational biomarker potential by linking viral protein expression to host transcriptional outcomes.
- Facilitates risk-adjusted advancement of antiviral candidates based on mechanistic readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum, supporting both early mechanistic studies and downstream screening or validation workflows.
- Discovery Biology: Quantifies host transcriptional suppression to test antiviral hypotheses and clarify viral-host pathways.
- Screening: Provides assay-ready, reproducible, and scalable workflows for evaluating antiviral interventions.
- Analytics: Generates quantitative flow cytometry and fluorescence microscopy data for robust condition comparison.
- Translational Research: Links mechanistic findings to disease-relevant cellular responses, supporting biomarker development.
- Enterprise Reuse: Adaptable protocol enables broad application across viral systems and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in host-pathogen studies.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and eliminates radioactive handling constraints.
- Strategic Value: Improves decision-making and capital efficiency by providing rapid, quantitative readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of antiviral targets and candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, virology, and fluorescence-based detection methods.
- Needs access to fluorescence microscopy and flow cytometry instrumentation.
- Demands cross-team standardization for assay conditions and data analysis.
- Adaptable to various cell types and viral systems with protocol optimization.
- Safety precautions are essential when handling infectious viral agents.
