シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ

この手順の全体的な目標は、スーパーオキシドフラッシュや膜電位のin situまたはin vivoでの変動などの単一のミトコンドリアイベントをモニタリングし、生理学的に関連性のある状況でミトコンドリア機能のリアルタイム評価を実現することです。これは、最初にマウスの後肢の骨格筋を露出させることによって達成されます。次に、骨格筋のタイムラプス共焦点画像をin vivoで取得します。

次に、マウスの心臓を灌流し、共焦点顕微鏡を使用して画像化します。最後に、画像が処理され、データが分析されます。最終的には、タイムラプスと2次元共焦点画像を通じて、骨格筋、in vivo、または灌流された心臓における単一のミトコンドリアスーパーオキシドフラッシュと膜電位の変動を示す結果を得ることができます。

ミトコンドリアの単離におけるミトコンドリア機能の評価など、既存の筋肉に対するこの手法の主な利点は、この技術により、生理学的に関連性のある状態で単一のミトコンドリア機能をリアルタイムで評価できることです。この方法のデモンストレーションは、ナイフ、動物、またはナイフ組織共焦点イメージングは、より急で複雑な手順であるため、習得が難しいため、非常に重要です。等張性平衡塩溶液またはIBSS、Krebs HENSEL Light Buffer、またはKHBおよびテキストプロトコルに従って手術器具を調製した後、ペントバルビタールの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけ、つま先をつまんで動物が鎮静していることを確認します。

カミソリを使用して、後肢の1つの毛を取り除き、70%エタノールで部位を消毒します。次に、手足の外側に沿って皮膚を切開して、胃貧血の筋肉を露出させます。次に、鋭利な鉗子を使用して、エピミシウムをそっと持ち上げ、ハサミを使用してそれを切開します。

さらに解剖してエピミシウムを取り除き、その下の筋繊維を露出させます。500ナノモルのテトラエチル、ロッドドミンメチルエステル、またはTMRMをIBSSに加え、筋肉を溶液に30分間浸します。TMRMを筋肉にロードした後、40 x オイル対物レンズを使用してTMRMフリーIBSSで筋肉を洗浄します。

マウスを共焦点顕微鏡ステージに横向きに置き、露出した骨格筋がカバースリップに対してカスタムメイドのチャンバーに入るように後肢を拘束します。次に、脚をそっと押し下げて組織とカバースリップをしっかりと接触させ、露出した筋肉を8ビットのピクセル深度とフレームあたり1秒のサンプリングレートを使用してIBSSに浸し、筋肉の2次元シリアルスキャンを記録します。最初に405ナノメートルで励起し、505ナノメートルを超える場所で収集することにより、連続画像を収集します。

その後、488ナノメートルで励起し、505ナノメートル以上で収集します。MTの2波長励起用。CCP YFPは、405 488および543ナノメートルで逐次励起を使用し、505〜5 45.505〜5 45および560ナノメートル以上で発光を収集します。マウスの心臓を画像化するためのM-T-C-P-Y-F-PおよびTMRMの3波長励起イメージングには、動物に200ユニットのヘパリンを注入します。

10分待ってから、開胸術でマウスを安楽死させた後、心臓と肺、それに付着している胸腺をすばやく取り除きます。移植した組織を氷冷したIBSSに素早く移します。次に、胸腺の葉を特定し、そっと剥がします。

上行大動脈を露出させるには、肺と胸腺を切除し、周囲の組織を慎重に除去して大動脈を分離します。次に、大動脈弓の最初の枝の前の上行大動脈の上端に切り込みを入れます。次に、2つのマイクロ縫合鉗子を使用して、大動脈の壁をそっと保持して内腔を露出させ、カニューレに慎重に配置します。

マイクロベッセルクランプを使用して大動脈を所定の位置に保持し、その周りに縫合糸をすばやく結びます。クランプを取り外し、鉗子を使用して、カニューレの先端が大動脈基部より上にあることを慎重に確認します。心臓を所定の位置に保持するために、必要に応じて追加のネクタイを固定します。

蠕動ポンプをオンにし、心臓を灌流します。1分間に1ミリリットルで、灌流時に心臓は鼓動を再開します。10分間の安定化後、10マイクロモルのBLEスタチンと100〜500ナノモルのTMRMで心臓を灌流します。.

心拍は10分後に遅くなります。次に、灌流システムの位置を調整し、チャンバーを摂氏37度に加熱するためのアダプターを備えた顕微鏡ステージに心臓を置きます。チャンバーに1ミリリットルのKHB灌流溶液を追加して、心臓を部分的に沈めます。.

蠕動ポンプを使用して、チャンバーから廃液を取り除きます。ポンプの速度を徐々に上げて、心臓に十分な流れを供給し、心臓がカバースリップにしっかりと接触し、心拍をさらに抑制するために、心臓に穏やかな圧力をかけます。このビデオの前半で筋肉について説明したように臓器を画像化し、焦点面を調整して可能な限り鮮明な画像を表示します。

共焦点顕微鏡ソフトウェアの生理学的解析モジュールを使用します。まず、自動生成されたデータベースを開き、次に分析する2D画像ファイルを開きます。[関心領域] または [ROI 平均] をクリックします。

ROIsモードの平均に切り替えるには。フラッシュを選択するために、488ナノメートルのCPYFP以外のチャネルの表示をオフにしてください。画像を拡大し、スライドバーを手動で動かしてシリアル2D画像を再生します。

次に、蛍光シグナルが一過性に増加する部位を特定することにより、単一のミトコンドリアスーパーオキシドフラッシュを同定します。適切なROIツールを使用してフラッシュをマークすると、各ROIの時間依存性蛍光変化を示すトレースが画像の横に表示されます。すべてのフラッシュを選択したら、他のチャンネルの表示をオンにします。

バックグラウンド信号の減算のために、セルの外側のイメージ上の ROI を選択します。次に、各ROIの平均蛍光を時間ラベルとともに出力します。各シリアルスキャンイメージファイルのフラッシュ回数と、セルのスキャン時間と領域を記録します。

Excelを使用して、フラッシュ周波数を100秒あたりおよび1000平方ミクロンのセル領域あたりのフラッシュ数として計算します。各フラッシュの振幅時間からピークまでの時間と減衰時間を計算します。フラッシュパラメータ解析には、インタラクティブデータ言語で書かれたカスタム開発プログラムの一部であるカスタム開発プログラムを使用します。

このプロトコルを使用して、麻酔をかけたマウスの骨格筋で単一のミトコンドリアイベントのin vivoイメージングを行い、続いて灌流した心臓でinsiイメージングを行うことができます。ここに示すように。ミトコンドリア膜電位指標であるTMRMは、M-T-C-P-Y-F-Pの位置を確認するためによく使用され、M-T-C-P-Y-F-P信号と完全に重なるパターンを示す必要があります。

そのスペクトルはCP YFPのスペクトルと区別でき、シーケンシャル励起法を使用することで、TMRMとM-T-C-P-Y-F-Pの発光信号が互いに干渉することはありません。これらの画像は、膜の脱分極を伴う単一のミトコンドリアスーパーオキシドフラッシュが連続した2Dスキャン画像で識別できることを示しており、骨格筋組織と心筋の両方のバックグラウンドシグナルに対して一過性の蛍光増加が示されました。高い分解能に加えて、適切な蛍光強度も必要です。

これは、レーザー強度と収集チャネルのゲインを変調することで実現できます。一般に、細胞から得られる基礎蛍光シグナルは、チャネルの最大強度の3分の1から4分の1に設定されます。M-T-C-P-Y-F-Pの発現レベルとTMRMの負荷量は動物によって異なるため、代謝基質などの生理学的および病理学的摂動の実験ごとにイメージング条件の微調整を行う必要があります。

ここに示されているような電気刺激、および虚血性再灌流は、スーパーオキシドフラッシュ活性が細胞代謝状態の変化に応答することを示すために使用されています。この手順を試みるときは、口の適切な麻酔と灌流された心臓の正しい状態を維持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、心筋白血病や再灌流障害中のミトコンドリア機能障害などの追加の質問に答えるために、虚血や融合などの他の方法を実行できます。