Name: シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T19:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: 学ぶ 共焦点顕微鏡を用いた単一ミトコンドリアのスーパーオキシドフラッシュと膜電位変動のリアルタイムイメージング法。マウスの後肢骨格筋と灌流心臓で生体内ミトコンドリア機能を評価し、生理学的・病的状態でのダイナミクスを解明する。

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著者は、博士に感謝したいと思います。和平チェン、Huiliang張とスティーブンKolwiczこの方法を開発する上で有益なコメントや技術的なサポートのため。この研究は、NIHの助成金や米国心臓協会からWWに科学者開発助成金によって支えられている。

1。実験の準備<ol><li> 140mMのNaCl、5mMのKCl、2.5mMのCaCl 2、2mMのMgCl 2および10mM HEPES インビボでの骨格筋イメージング用液（pH 7.2）を含有する等張平衡塩類溶液（50ml）に調製する。 </li><li> 118のNaCl、5.3のKCl、1.2のMgSO 4、0.5mMのEDTAおよび25mMの炭酸水素ナトリウムを ：含むクレブス-ヘンゼライト緩衝液（KHB）を1リットル調製。 </li><li>従来2mMのCaCl 2を添加する10〜15分間、95％O 2/5％CO 2を含むガスと気泡KHB。代謝基質（ 例えば 、10 mMグルコースおよび0.5mMのピルビン酸）を追加します。 </li><li> 70％エタノールでクランプ、はさみ、鉗子を滅菌した後、滅菌蒸留H 2 Oにすすぐことにより手術器具を準備します</li><li> 、心臓の灌流システムの電源を入れ、水浴、サーキュレータの温度を調整し、6ミリリットル/分に蠕動ポンプの速度を設定します。 </li><li> 95％O 2と気泡KHB流出物/ 5％CO 2ガス、および（光ファイバ温度プローブによって37℃）、流速および温度を監視する。システムは、ガスと温度平衡化のために約20分を必要とします。 </li></ol> 2。 in vivoでの骨格筋の共焦点イメージング<ol><li>ペントバルビタール（80 mg / kgで、腹腔内）でマウスを麻酔。動物は、10〜15分以内に、手術の麻酔（つま先のピンチに応答なし）に到達し、骨格筋のin vivoイメージングのために十分な1〜1.5時間、この状態のままになります。 </li><li>後肢の1に毛を削除し、70％エタノールで皮膚を消毒する。 </li><li>腓腹筋を露出させ、肢の外側に沿って皮膚に切開する。 </li><li>鋭いピンセットで軽く筋外膜をピックアップし、ハサミでそれを介して切開する。さらに筋外膜を取り外し、その下の筋線維を露出するために解剖。 </li><li>骨格へのTMRM のin vivoロード用筋肉は、30分間の筋肉を浸した後、指示薬を含まない溶液で洗い流すこと等張平衡塩類溶液中のTMRM（500 nM）を含める。 </li><li>共焦点顕微鏡（Zeiss LSM 510）ステージ上で横にマウスを置くと、公開される骨格筋は、チャンバーの底部を形成するカバーガラスに対向する位置に、リア手足を拘束。カバースリップは、筋肉組織および反転対物レンズ（40X油）との間にある。 </li><li>組織とカバーガラスの間に密着させるようにそっと足を押してください。等張平衡塩溶液中で公開される筋肉を浸す。 </li><li>フレームあたり1秒のサンプリングレートで録音する2次元（2D、 メトキシ）共焦点画像。各画素の強度は、8ビットの深度でデジタル化される。通常、シリアルスキャンは100フレームが含まれています。 </li><li> &gt; 505 nmで最初の405 nmでのエキサイティングで収集することにより連続した画像を収集し、488 nmの二波長excitatio用&gt; 505 nmで収集しながら、MT-cpYFPのNイメージング。 MT-cpYFPとTMRMの三波長励起イメージングのために、それぞれ、405、488および543 nmで連続励起を使用し、505から545の発光を収集し、505から545、および&gt; 560 nmの。 </li></ol> 3。灌流マウス心臓の共焦点イメージング<ol><li>すぐに骨格筋のin vivoイメージングの後、ヘパリン200単位（IP）でマウスを注入します。 10分後、開胸術により、マウスを安楽死させるとすぐにそれに接続されている肺や胸腺で心を取り除く。 </li><li>すぐに氷冷緩衝液で肺を削除します。胸腺の葉を識別し、ゆっくりと上行大動脈を露出するために戻ってはがします。 </li><li>胸腺を取り外し、慎重に周囲の組織を除去することにより、大動脈を隔離。 </li><li>大動脈弓の最初の分岐の前に、上行大動脈の上端の切断を行う。 </li><li>ルーメンを露出するために2マイクロ縫合鉗子で穏やかに大動脈の壁を持って、慎重にCAに大動脈を配置nnula（PE50チューブ）。縫合糸が迅速に大動脈の周りに縛られている間は、マイクロ大動脈血管クランプで所定位置に保持される。 </li><li>カニューレの先端が大動脈基部より上であることを確認するために鉗子でカニューレをチェックし、慎重に、クランプを取り外します。追加の関係を所定の位置に心臓を保持するために必要に応じて添加される。 </li><li>蠕動ポンプの電源を入れ、1ミリリットル/分で心臓を灌流。心臓は、灌流の際に暴行を再開します。 </li><li>灌流システムの位置を調整し、顕微鏡ステージ上で心を置く。ステージは、心を保持しているチャンバーの加熱を可能にするアダプタを持っています。 </li><li>部分的に心を沈めるためにチャンバー内KHB灌流溶液1mlを加える。 37℃のチャンバーの温度を監視する蠕動ポンプを使用することにより、チャンバからの流出物を除去します。 </li><li>心臓への十分な流量（約2ミリリットル/分）を提供するために、徐々に蠕動ポンプの速度を増加させる。 </li><li>安定化の10分後、ょんを潅流10μMのブレビスタチンおよび100〜500nmのTMRMとRT。ハートビートは10分後に遅くなります。 </li><li>チャンバーの下部にあるカバーガラスで心​​の緊密な接触を確実にするために、さらにハートビートを抑制するために心に静かに押し込みます。 </li><li>上記のステップ2.8で説明したように完全な心筋の共焦点イメージングのためのと同じ手順に従ってください。慎重に可能な鮮明な画像を明らかにするために、焦点面を調整します。 </li></ol> 4。画像処理およびデータ分析<ol><li>シングルミトコンドリアが点滅し、膜電位変化を分析するために、共焦点ソフトウェアの「生理的分析」モジュールによって提供されるツールを使用してください。このモジュールは、多くの場合、共焦点システムの画像取得ソフトウェアに含まれる画像の中の特定の領域の決定だけでなく、時間ラベルとの蛍光強度の出力を可能にする。 </li><li>データベースと分析しようとする、シリアル2D画像ファイルを開きます。 </li><li> 「地域をクリックしてください関心領域（ROI）は、平均ROIの &quot;に切り替える」という意味の平均ROIの「モード」に切り替え、「関心領域（ROI）は、平均&quot;モード。をクリックして &quot;。 </li><li>点滅を選択するためのcpYFP 488nmのチャンネルを除く他のチャンネルの表示をオフにします。 </li><li>ズーム画像と手動シリアル2D画像を再生するために、スライドバーを移動します。 </li><li>蛍光シグナルが一過性に増加し、サイトを配置することにより、単一のミトコンドリアのスーパーオキシドが点滅を識別します。点滅をマークするために、適切なROIツールを使用します。各ROIの時間依存蛍光変化を示すトレースは、画像の横に表示されます。 </li><li>すべての点滅を選択した後、他のチャンネルの表示をオン。バックグラウンド信号の減算の​​ための細胞の外側で画像にROIを選択します。一緒に時間ラベルで出力各ROIの平均蛍光を。 </li><li>のスキャン時間と面積と一緒にシリアルスキャンされた画像ファイルのそれぞれに点滅回数を記録しますセル。 Excelを使用して100秒/ 1,000μm2のセル面積あたりの点滅回数などのフラッシュ頻度を計算する。 </li><li>各フラッシュ（振幅、ピークまでの時間と減衰時間）のパラメータを計算するために対話型のデータ言語（IDL、ResearchSystems）で記述されたカスタム開発されたプログラムを使用してください。 IDLのソフトウェアは市販されており、フラッシュパラメータ解析用のカスタム開発されたプログラムは、要求に応じて作成者から得ることができます。 </li></ol>

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</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

生きた動物または灌流さの臓器の単一ミトコンドリアのイベントを画像化することは、ミトコンドリア機能評価17,19,21,22,24,25のための従来の方法に比べて大きな利点があります。ここに記載された技術は、細胞内の解像度で、実際の生理学的状態にあるミトコンドリア機能のその場での決定に 、リアルタイムを実現することができます。全身的にインビボで特定の器官または細胞型の正常な機能におけるミトコンドリアの役割を研究するために、他の測定と組み合わせた場合に、特に有用である。これは様々なパラメータの制御に焦点顕微鏡で洗練された灌流システムを組み合わせた複雑な手法である。それにもかかわらず、この技術は、筋ミトコンドリア機能17,19,20に全身グルコース代謝をリンクするために使用されており、現在心臓疾患におけるミトコンドリア機能障害を研究するために我々が使用される。 ランゲンドルフ心perfusion個のシステムは、左心室の圧力を監視し、各拍動の間、細胞内Ca 2 +トランジ...

ミトコンドリアは、細胞の生体エネルギー、フリーラジカルシグナル伝達、酸化還元ホメオスタシス、イオン調節、および細胞運命決定の1,2において中心的な役割を果たす。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属のと病気3-6の病因の基礎となる。特に、心臓や骨格筋などの筋肉のシステムでは、ミトコンドリアの呼吸は、細胞内カルシウム、堅牢な力開発7,8のタイムリーな調整を支援するために、ATPの大部分を提供します。これらの筋肉は、多くの場合、全細胞容積20〜40％まで占め、筋フィラメント2間に「固定」されたミトコンドリアの多数を持っている。 多くの研究にもかかわらず、ミトコンドリア機能調節の我々の理解は、特に生体内および生理学的に関連する条件下では、限られている。理由の一つは、ミトコンドリア機能を評価するために開発された方法の大部分はvitrに頼るあるこのような人工基質を補充した単離ミトコンドリアの酸素消費量、および間接形態学を通じてミトコンドリア機能の決定（ 例えば電子顕微鏡）、酵素活性（ 例えばアコニターゼ活性）、または細胞内ATPレベル9から11の監視などoまたはex vivoでのアプローチ、 。 最近では、相対的なミトコンドリア富化を有する小分子蛍光指示薬は、無傷の細胞における膜電位、カルシウムおよび活性酸素種（ROS）、11-13を含むミトコンドリアシグナルの姿を提供するために適用されている。さらに、いくつかの緑色蛍光タンパク質（GFP）をレドックス系、ROS指標区画化、細胞内の酸化還元またはROS 14-16信号のより具体的な評価を達成するために開発されてきた。この中でも、我々は、遺伝的にコード化されたスーパーオキシドインジケーター、円形の順列黄色蛍光タンパク質、およびtargeteを開発Dそれミトコンドリア（MT-cpYFP）17に変換する。 MT-cpYFPは、515 nmでの発光ピークの両方で405又は488nmで励起することができる。 488nm励起での発光は、 インビトロおよびインビボ較正 17,18 内の前で示すように、スーパーオキシドに特異的に応答する。 405 nm励起の発光は、（様々な条件の下で、MT-cpYFPの発光および励起スペクトルの詳細については文献[17の図1をご参照ください）​​内部コントロールとして使用されます。タイムラプス共焦点イメージングでは、この指標は、無傷の細胞の単一ミトコンドリア内スーパーオキシド産生のイベント、というスーパーが点滅し、破裂を検出。スーパーフラッシュは、ミトコンドリア呼吸、添付過渡ミトコンドリア膜脱分極およびROS産17〜20の合成関数として機能します。最近では、C57/BL6の背景をpUC-CAGGS-MT-cpYFPベクトル17,19を使用したパン-組織MT-cpYFPトランスジェニックマウスを作製し、強力なEXPRESを確認しました心臓、骨格筋および他の組織（ 図2）で、この指標のシオン。トランスジェニックマウスは、要求とワシントン大学のMTAの承認を得て興味を持って、学術研究者のために利用できるようになります。 本研究では、 その場でのランゲンドルフ灌流し、心臓内のスーパーオキシドが点滅の撮影だけでなく、麻酔MT-cpYFPトランスジェニックマウス17,19の骨格筋におけるFlashイベントのin vivoイメージングに説明します。この技術は、生理学的に関連する状態またはin vivo 21,22の単一ミトコンドリアのROS産生のイベントのリアルタイム監視が可能になります。このような適切な蛍光指示薬を有する膜電位およびカルシウムなどの他の単一ミトコンドリアのパラメータを監視するシステムを使用することも可能である。細胞内のイベント（ 例えば 、カルシウムトランジェント）や心臓の機能（ 例えばとミトコンドリア機能の更なる、同時またはパラレル評価。駆出率）を達成することができる。例えば、虚血および再灌流のような病理学的摂動は、無傷心筋の単一ミトコンドリア機能に対するストレスの影響を評価するために灌流心臓に適用することができる。

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>B592500</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Acros Organics</td><td>AC34961-5000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP120-500</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull;6H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&bull;7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880-1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8282-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-1</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256-25</td><td></td></tr><tr><td>TMRM</td><td>Invitrogen</td><td>T-668</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td colspan="4">共焦点線走査型顕微鏡 (LSM 510 Meta, Zeiss), ソフトウェアバージョン 4.2 SP1 (Physiological Analysis" モジュールを含む)。</td></tr></tbody></table>

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージングインビボ

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

ミトコンドリアは、真核生物系でのエネルギー生産と細胞内シグナル伝達を担う重要な細胞内小器官である。ミトコンドリア機能障害は、多くの場合、付属の、人間の病気に貢献しています。ミトコンドリア機能および機能不全を評価するために開発されてきたアプローチの大部分は、in vitroまたはex vivoで測定に基づいている。これらの実験からの結果は、in vivoでのミトコンドリア機能を決定する上での能力が限られている。ここでは、 インビボでリアルタイムに単一ミトコンドリア機能の評価を可能にするライブアミナール中の無傷の組織のイメージング、共焦点走査顕微鏡法を用いた、新たなアプローチを記載する。まず、ミトコンドリアの対象とスーパーオキシドインジケータ、円順列黄色蛍光タンパク質（MT-cpYFP）を発現するトランスジェニックマウスを作製。麻酔をかけたMT-cpYFPマウスがカスタムメイドステージアダプタに固定され、タイムラプス画像は、Fをとっている後肢の露出骨格筋ROMをマウスはその後、犠牲にされ、心臓は37℃で、生理的なソリューションをランゲンドルフ灌流用に設定されている灌流心臓を共焦点顕微鏡ステージ上に特殊なチャンバ内に配置され、穏やかな圧力は、心臓を固定し、心拍誘導運動アーチファクトを抑制するために適用される。スーパーオキシド点滅毎秒1フレームの周波数でのリアルタイム二次元共焦点イメージングにより検出される。灌流溶液は、異なる呼吸基質または他の蛍光指示薬を含有するように修飾することができる。灌流はまた、虚血および再灌流などの疾患モデルを生成するように調整することができる。この技術は、無傷の組織およびインビボでの単一ミトコンドリアの機能を決定するためのユニークなアプローチである。

このプロトコルによると、単一のミトコンドリアのイベントのin vivoイメージングは、麻酔したマウスの骨格筋で行うことができますが灌流し、心臓内のその場での画像（ 図1） に続く。撮影条件の最適な設定は、そのまま筋肉組織の鮮明な画像を確保し、単一ミトコンドリアの解像度（ 図2）となります。 TMRMは、多くの場合、MT-cpYFPの場所を確認するために使用され、MT-cpYFP信号との完全な重複パターン（ 図2）が表示されるはずです。 TMRMは無傷の細胞23内のミトコンドリア膜電位測定用の市販の指標である。そのスペクトルはcpYFPのものとは区別される。また、連続励起法を用いて、TMRMとのmt-cpYFPの発光信号は、互いに17に干渉しない。 図3に示す代表的な画像を示していることを、単一のミトコンドリアのスーパーオキシドのフラッシュアコ膜脱分極によってmpaniedは、両方の骨格筋組織におけるバックグ...

共焦点走査顕微鏡は、生きた動物における灌流心臓または骨格筋​​におけるミトコンドリアの単一のイベントを画像化するために適用される。スーパーオキシドが点滅し、膜電位の変動などの単一ミトコンドリアのプロセスのリアルタイム監視は、生理学的に関連するコンテキストでかつ病理学的摂動の間、ミトコンドリア機能の評価が可能。

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

この手順の全体的な目標は、スーパーオキシドフラッシュや膜電位のin situまたはin vivoでの変動などの単一のミトコンドリアイベントをモニタリングし、生理学的に関連性のある状況でミトコンドリア機能のリアルタイム評価を実現することです。これは、最初にマウスの後肢の骨格筋を露出させることによって達成されます。次に、骨格筋のタイムラプス共焦点画像をin vivoで取得します。次に、マウスの心臓を灌流し、共焦点顕微鏡を使用して画像化します。最後に、画像が処理され、データが分析されます。最終的には、タイムラプスと2次元共焦点画像を通じて、骨格筋、in vivo、または灌流された心臓における単一のミトコンドリアスーパーオキシドフラッシュと膜電位の変動を示す結果を得ることができます。ミトコンドリアの単離におけるミトコンドリア機能の評価など、既存の筋肉に対するこの手法の主な利点は、この技術により、生理学的に関連性のある状態で単一のミトコンドリア機能をリアルタイムで評価できることです。この方法のデモンストレーションは、ナイフ、動物、またはナイフ組織共焦点イメージングは、より急で複雑な手順であるため、習得が難しいため、非常に重要です。等張性平衡塩溶液またはIBSS、Krebs HENSEL Light Buffer、またはKHBおよびテキストプロトコルに従って手術器具を調製した後、ペントバルビタールの腹腔内注射でマウスに麻酔をかけ、つま先をつまんで動物が鎮静していることを確認します。カミソリを使用して、後肢の1つの毛を取り除き、70%エタノールで部位を消毒します。次に、手足の外側に沿って皮膚を切開して、胃貧血の筋肉を露出させます。次に、鋭利な鉗子を使用して、エピミシウムをそっと持ち上げ、ハサミを使用してそれを切開します。さらに解剖してエピミシウムを取り除き、その下の筋繊維を露出させます。500ナノモルのテトラエチル、ロッドドミンメチルエステル、またはTMRMをIBSSに加え、筋肉を溶液に30分間浸します。TMRMを筋肉にロードした後、40 x オイル対物レンズを使用してTMRMフリーIBSSで筋肉を洗浄します。マウスを共焦点顕微鏡ステージに横向きに置き、露出した骨格筋がカバースリップに対してカスタムメイドのチャンバーに入るように後肢を拘束します。次に、脚をそっと押し下げて組織とカバースリップをしっかりと接触させ、露出した筋肉を8ビットのピクセル深度とフレームあたり1秒のサンプリングレートを使用してIBSSに浸し、筋肉の2次元シリアルスキャンを記録します。最初に405ナノメートルで励起し、505ナノメートルを超える場所で収集することにより、連続画像を収集します。その後、488ナノメートルで励起し、505ナノメートル以上で収集します。MTの2波長励起用。CCP YFPは、405 488および543ナノメートルで逐次励起を使用し、505〜5 45.505〜5 45および560ナノメートル以上で発光を収集します。マウスの心臓を画像化するためのM-T-C-P-Y-F-PおよびTMRMの3波長励起イメージングには、動物に200ユニットのヘパリンを注入します。10分待ってから、開胸術でマウスを安楽死させた後、心臓と肺、それに付着している胸腺をすばやく取り除きます。移植した組織を氷冷したIBSSに素早く移します。次に、胸腺の葉を特定し、そっと剥がします。上行大動脈を露出させるには、肺と胸腺を切除し、周囲の組織を慎重に除去して大動脈を分離します。次に、大動脈弓の最初の枝の前の上行大動脈の上端に切り込みを入れます。次に、2つのマイクロ縫合鉗子を使用して、大動脈の壁をそっと保持して内腔を露出させ、カニューレに慎重に配置します。マイクロベッセルクランプを使用して大動脈を所定の位置に保持し、その周りに縫合糸をすばやく結びます。クランプを取り外し、鉗子を使用して、カニューレの先端が大動脈基部より上にあることを慎重に確認します。心臓を所定の位置に保持するために、必要に応じて追加のネクタイを固定します。蠕動ポンプをオンにし、心臓を灌流します。1分間に1ミリリットルで、灌流時に心臓は鼓動を再開します。10分間の安定化後、10マイクロモルのBLEスタチンと100〜500ナノモルのTMRMで心臓を灌流します。.心拍は10分後に遅くなります。次に、灌流システムの位置を調整し、チャンバーを摂氏37度に加熱するためのアダプターを備えた顕微鏡ステージに心臓を置きます。チャンバーに1ミリリットルのKHB灌流溶液を追加して、心臓を部分的に沈めます。.蠕動ポンプを使用して、チャンバーから廃液を取り除きます。ポンプの速度を徐々に上げて、心臓に十分な流れを供給し、心臓がカバースリップにしっかりと接触し、心拍をさらに抑制するために、心臓に穏やかな圧力をかけます。このビデオの前半で筋肉について説明したように臓器を画像化し、焦点面を調整して可能な限り鮮明な画像を表示します。共焦点顕微鏡ソフトウェアの生理学的解析モジュールを使用します。まず、自動生成されたデータベースを開き、次に分析する2D画像ファイルを開きます。[関心領域] または [ROI 平均] をクリックします。ROIsモードの平均に切り替えるには。フラッシュを選択するために、488ナノメートルのCPYFP以外のチャネルの表示をオフにしてください。画像を拡大し、スライドバーを手動で動かしてシリアル2D画像を再生します。次に、蛍光シグナルが一過性に増加する部位を特定することにより、単一のミトコンドリアスーパーオキシドフラッシュを同定します。適切なROIツールを使用してフラッシュをマークすると、各ROIの時間依存性蛍光変化を示すトレースが画像の横に表示されます。すべてのフラッシュを選択したら、他のチャンネルの表示をオンにします。バックグラウンド信号の減算のために、セルの外側のイメージ上の ROI を選択します。次に、各ROIの平均蛍光を時間ラベルとともに出力します。各シリアルスキャンイメージファイルのフラッシュ回数と、セルのスキャン時間と領域を記録します。Excelを使用して、フラッシュ周波数を100秒あたりおよび1000平方ミクロンのセル領域あたりのフラッシュ数として計算します。各フラッシュの振幅時間からピークまでの時間と減衰時間を計算します。フラッシュパラメータ解析には、インタラクティブデータ言語で書かれたカスタム開発プログラムの一部であるカスタム開発プログラムを使用します。このプロトコルを使用して、麻酔をかけたマウスの骨格筋で単一のミトコンドリアイベントのin vivoイメージングを行い、続いて灌流した心臓でinsiイメージングを行うことができます。ここに示すように。ミトコンドリア膜電位指標であるTMRMは、M-T-C-P-Y-F-Pの位置を確認するためによく使用され、M-T-C-P-Y-F-P信号と完全に重なるパターンを示す必要があります。そのスペクトルはCP YFPのスペクトルと区別でき、シーケンシャル励起法を使用することで、TMRMとM-T-C-P-Y-F-Pの発光信号が互いに干渉することはありません。これらの画像は、膜の脱分極を伴う単一のミトコンドリアスーパーオキシドフラッシュが連続した2Dスキャン画像で識別できることを示しており、骨格筋組織と心筋の両方のバックグラウンドシグナルに対して一過性の蛍光増加が示されました。高い分解能に加えて、適切な蛍光強度も必要です。これは、レーザー強度と収集チャネルのゲインを変調することで実現できます。一般に、細胞から得られる基礎蛍光シグナルは、チャネルの最大強度の3分の1から4分の1に設定されます。M-T-C-P-Y-F-Pの発現レベルとTMRMの負荷量は動物によって異なるため、代謝基質などの生理学的および病理学的摂動の実験ごとにイメージング条件の微調整を行う必要があります。ここに示されているような電気刺激、および虚血性再灌流は、スーパーオキシドフラッシュ活性が細胞代謝状態の変化に応答することを示すために使用されています。この手順を試みるときは、口の適切な麻酔と灌流された心臓の正しい状態を維持することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、心筋白血病や再灌流障害中のミトコンドリア機能障害などの追加の質問に答えるために、虚血や融合などの他の方法を実行できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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出典:Kennedy, L. H., et.al. アデノ随伴ウイルスと共焦点顕微鏡を用いた器官型脳スライスにおけるオリゴデンドロサイトオルガネラの可視化とライブイメージング。J. Vis. Exp.

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