精巣生殖細胞の三次元クロマチンアーキテクチャを保存するためのスライド調製方法
2014年1月10日
ここでの材料は精巣生殖細胞の三次元クロマチン構造を維持するために開発された方法を記述する。これは三次元(3D)スライド法と呼ばれます。この方法は、亜核組織の検出感度を向上させ、免疫蛍光、DNA、および蛍光をその 中で の蛍光(FISH)に適用可能です。
この3次元スライド調製法は、マウスの精巣生殖細胞で示された細胞の3Dクロマチン配列を保持します。まず、細管に浸透させて細胞質物質を除去し、抗体や魚介類プローブなどの染色試薬のアクセシビリティを向上させます。核物質を固定した後、生殖細胞を鉗子で機械的に解離し、サンプルをスライド上にシトシンします。
次に、3Dスライド調製から戦略的に適用した場合に、3Dで核をカバーするために複数のZセクションを持つデータを取得します。COT one RNAを使用すると、魚は核内の転写活性領域を検出するための核新生RNAを示すことができます。この方法は、マサチューセッツ総合病院の遺伝子研究室にいたときに開発されました。
その際、ハイブリダイゼーション(魚とも呼ばれる)への知見をコットンRNAの蛍光化にスライド調製法を最適化し、ナセントを検出しました。RNA。コットンプローブは、イントロンとtlsの反復配列をハイブリダイズし、活性転写部位を視覚化できます。ワタRAフィッシュは、核RNAの分布を保存する必要があります。
この正しい準備方法の重要なポイントは、化ステップを進行する必要があるということです 固定ステップ。Cy Plasmicバックグラウンドを除去するには、破裂した精巣からPBSの氷上でOUS細管を解き明かし、長さ5〜10ミリメートルの細管を数個、0.5%トリットン×100のCSKバッファー500μLに移し、氷上で6分間インキュベートします。次に、室温で10分間インキュベートする4ウェルの1ウェルで、すべての尿細管を4%P-F-A-P-B-S溶液に移します。
次に、すべての尿細管をPBSで室温で5分間インキュベートします。インキュベーション期間中のサイトスピンチャンバーとサイトスピンチャンバーをスライドガラスの裏側に設置し、すべての尿細管を30マイクロリットルのPBSに移します。次に、2つの鉗子の先端を使用して、細管をバラバラに引き裂きます。
2つの鉗子の先端の間に細管をクリップし、鉗子を水平に引っ張ることにより、細管を水平方向に切り刻みます。PBSを30マイクロリットル添加した後、懸濁液をピペッティングで混合し、マイクロ遠心チューブに移し、PBSを総容量1.3ミリリットルまで添加します。次に、100マイクロリットルの懸濁液を各細胞スピンチャンバーに適用します。細胞。
サンプルを2000RPMで室温で10分間回転させます。PBSを含むcoplanジャーを使用して、ラボベンチで室温で数分間スライドを乾燥させます。スライドを室温で5分間洗浄します。
次に、スライドを70%エタノールに少なくとも2分間移します。20マイクロリットルの反応で、捕捉した100ナノグラム、1D NAプローブ、20ミリモルリボヌクレオチドバナジル錯体およびハイブリダイゼーションバッファーを添加します。PCR装置を用いて、摂氏80度で10分間インキュベートし、続いてプレアをインキュベートします。
使用準備が整うまで摂氏42度でひざまずきます。次に、スライドを80%エタノールで2分間連続して脱水し、続いて100%エタノールで2分間脱水します。スライドを室温で実験台で完全にドライします。
次に、スライドを摂氏42度のチップボックスチャンバーに置きます。次に、プレニードプローブを短時間遠心分離し、脱水スライドに直接ピペットで移します。カバースリップをスライド上にそっと置き、摂氏42度で少なくとも6時間のハイブリダイゼーションステップを行います。
カミソリの刃を使用して水浴中で摂氏42度で30分間、コプランジャー内の洗浄液を予熱し、サンプルを傷つけることなくスライドの端からカバースリップを取り除き、スライドを洗浄液に徐々に浸します。最初の coplan jar には 2 つの XSSC と 50%form amid、次に 2 つの XSSC と 50%form amid を含む 2 番目の coplan jar が続きます。そして、最後の 2 つの jar には 2 つの XSSC が含まれています。
次に、20マイクロリットルのDPI封入剤をサンプルに加え、カバースリップを置きます。カバーガラスをそっと押し、余分な封入剤をクリーニングティッシュで拭き取ります。この実験では、1つのRNA魚を捕獲し、XY体に局在するタンパク質の新生転写と免疫染色を同時に検出するために行われました。
このPACUでは、精母細胞はヘテロクロマチンタンパク質CCB X oneと、XY体上にヒストン変異体H two A Xのリン酸化型を検出しました。得られた魚は、低張液で処理した表面スプレッドのe色領域に蓄積された1つのシグナルを捕捉した。三次元クロマチン構造が破壊され、すべての筋染色体軸を単一のZ平面内に捕捉できます。
しかし、3Dスライドの調製では、この手順の後、無傷のクロマチン構造が維持されます。この適切な調製方法は、免疫蛍光染色DNAおよびRNA魚、およびこれらの検出方法の組み合わせに適用できます。
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概要
本論文では、精巣生殖細胞のクロマチン構造を保持する新しい三次元（3D）スライド標本作成法を提示します。この手法は、核内構造の検出感度を高め、さまざまな蛍光技術に適しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 遺伝学
背景
- クロマチン構造の理解は、遺伝子発現の研究において極めて重要です。
- 従来の手法では、クロマチンの3次元配置を十分に保存できない場合があります。
- 精巣胚細胞は、クロマチンダイナミクスの研究におけるモデルとして利用されます。
- 免疫蛍光染色法およびFISHは、クロマチンを可視化するための主要な技術です。
研究目的
- 生殖細胞におけるクロマチンの3D構造を維持する手法を開発すること。
- 高度なイメージング技術を用いて核構造の検出能を向上させること。
- 核内の転写活性領域の研究を促進すること。
使用した手法
- 染色性を高めるための精細管の透過処理。
- スライド標本作成のための生殖細胞の機械的解離。
- 核の3Dイメージングのための複数Zセクションの適用。
- 新生RNAを可視化するためのCOT-1 RNA FISHの使用。
主な結果
- 3Dスライド法はクロマチン構造を効果的に保存します。
- 核内構造の検出における感度の向上を実現しました。
- 核内の転写活性領域の可視化に成功しました。
- 本手法はさまざまな蛍光技術に適用可能です。
結論
- 3Dスライド調製法は、クロマチン研究における重要な進展です。
- この技術により、遺伝子調節に関する理解を深めることができます。
- 今後の応用範囲は、他の細胞型や研究分野にまで拡大する可能性があります。
よくある質問
産業界における重要性
天然のクロマチン構造を維持することで、生殖細胞モデルにおける転写活性および核組織の正確な評価が可能になります。本手法は、分化過程におけるDNA、RNA、およびタンパク質複合体間の空間的関係を保持し、ターゲットバリデーションを支援します。これにより、初期ディスカバリーワークフローにおけるメカニズム上のリスク低減のための再現性のあるプラットフォームが提供されます。
バイオ製薬研究開発における戦略的活用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 3Dクロマチン構造を維持することで、正確なターゲット結合評価を行い、治療仮説を検証する。
- 運用の価値： 無傷の核内において、新生RNAとタンパク質の共局在を検出することで、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値： 疾患関連システムにおける転写調節に関連するクロマチンダイナミクスを明らかにすることで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備： 免疫蛍光法およびFISHベースのクロマチン調節化合物のスクリーニングに向けて、バリデート済みの生物学的システムを調製します。
- 定量的出力： 標準化されたマルチセクションのZスタックデータを生成し、核染色パターンの信頼性の高い比較を可能にします。
- 拡張性： 下流のアプリケーションに向けて核内構造の感度を維持することで、複数のターゲットにわたるプラットフォームの再利用をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患との関連性：生殖細胞分化モデルからエピジェネティック標的の前臨床検証に至るまで、クロマチンの連続性を維持します。
- バイオマーカーとの整合性：転写状態を示す空間的なRNA-DNA相互作用を保存することで、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を促進します。
- リスク調整済み進展：摂動に応答した核構造の変化を直接可視化することにより、メカニズムに基づくリスク低減を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、生殖細胞モデルにおける仮説検証およびパスウェイの解明に向けてクロマチン構造を保持することで、ディスカバリー生物学のワークフローに統合されます。
- 探索生物学：天然のクロマチン構造を維持することで、イメージングデータの正確な解釈による仮説検証を支援します。
- スクリーニング：マルチプレックス免疫蛍光染色およびFISH検出に対応した再現性の高いスライド作製により、アッセイへの即時適用を可能にします。
- 分析：Zセクションイメージングとシグナルの共局在測定により、核構造の定量的な比較を実現します。
- トランスレーショナルリサーチ：エピジェネティックなメカニズムの検証に関連するクロマチン状態を保持することで、前臨床研究への継続性を確保します。
- 組織的な再利用：複数の生殖細胞段階にわたるクロマチン構造の保存に向けた、再利用可能なサイトスピンベースのプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：核組織研究におけるメカニズムの曖昧さを軽減し、ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を提供します。
- 運用的価値：定義された透過処理、固定、およびサイトスピンの手順により、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値：無傷のクロマチン環境における転写活性の直接的な可視化を可能にすることで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響：生殖細胞分化モデルにおけるクロマチンベースのターゲット機能バリデーションを通じて、リスク調整後の優先順位付けをサポートします。
実施上の検討事項
- 適切な実施および解析には、クロマチン生物学および蛍光顕微鏡法の専門知識が必要です。
- 一貫したスライド作製には、サイトシン遠心分離機および最適化されたバッファーシステムに依存します。
- 核内RNAの分布を維持するため、透過処理および固定時間のチーム間での標準化が不可欠です。
- 核の脆弱性が異なる他の細胞型に本手法を適用する場合、適応に関する検討が必要です。
- 管状構造の処理中にクロマチンの破壊を避けるため、慎重な機械的解離が必要であるという制限があります。
