タングウイルスに対する新規抗ウイルス剤の同定のためのアッセイ

この手順の全体的な目標は、CPEベースの細胞生存率アッセイを使用して、青舌ウイルスまたはBTVに対する低分子抗ウイルス薬を同定し、特性評価することです。これは、まず、細胞変性効果または細胞力価グロー試薬を用いたCPEベースのアッセイを用いて、抗ウイルス化合物のライブラリーをスクリーニングすることによって達成されます。次に、抗ウイルス効果を確認し、選択した抗ウイルス薬の細胞毒性を用量反応アッセイを用いて評価します。

最後に、選択された抗ウイルス薬の可能なウイルスライフサイクル段階を決定するために、添加時間アッセイを実施し、可能な作用機序を導き出す。最終的に、用量反応アッセイおよび添加時間アッセイに基づいて、強力な抗ウイルスCIEおよび低い細胞毒性を有する新規抗ウイルス薬を示す結果を得ることができる。したがって、プラークアッセイにおけるTCI D 50アッセイのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この技術が、感染細胞細胞で測定可能なCPを誘導するグルテンウイルスを含む特定のウイルスに対するアンチウイルスをスクリーニングし、分類するための測定可能な方法で高感度、堅牢、および高生殖性を提供することですサプリメントDMEMで維持されたBSR細胞からのCPEベースのアッセイの準備にマイクロフロー選択ディスペンサーを使用します20マイクロリットルの細胞を5, 000細胞/井戸で384に播種します。

ウェルマイクロプレートは、細胞を2〜3時間インキュベートしてプレートに完全に接着させた後、最終濃度10マイクロモルの抗ウイルス化合物を各ウェルに添加し、完全に混合します。アッセイ培地を使用して、精製および増殖させたBTVをプラークを所望の力価に希釈し、コントロールのために各ウェルにMOIを示す5マイクロリットルのBTVを添加します。よく5マイクロリットルのアッセイ培地を加え、アッセイプレートが入ったウェットボックスをインキュベーターに入れ、感染細胞を摂氏37度で5%の二酸化炭素と80〜95%の湿度で72時間インキュベートします。

次に、アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、次にCTGバッファーと凍結乾燥CTG基質を解凍して室温まで平衡化します。次に、製造元の指示に従って凍結乾燥酵素基質と緩衝試薬を混合することにより、均質なCTG試薬溶液を再構成します。15分間室温にアッセイプレートを平衡化した後、ディスペンサーを使用して各ウェルに25マイクロリットルのCTG試薬を追加し、暗所で15分間インキュベートします 0.1秒の統合時間を持つマルチモードリーダーを使用して発光信号を測定する前に、384ウェルマイクロプレートのウェルあたり5,000BSR細胞を播種します 抗ウイルス効果アッセイのための20マイクロリットルと25マイクロリットルを使用します細胞毒性アッセイ。

2〜3時間のインキュベーション後、ここに示すように、アッセイごとに化合物の濃度ごとに8回の繰り返しを割り当てます。化合物やウイルスを添加せずに最初のカラムをポジティブコントロールとして割り当て、最後のカラムをネガティブコントロールとして、抗ウイルス効果アッセイのみのウイルスをアッセイ培地中の50マイクロモルに希釈し、2番目のカラムにウェルあたり20マイクロリットルを添加します。8チャンネル半自動ピペットを使用。

化合物を25マイクロモルの濃度で5回混合します。次に、2番目のカラムの混合物の20マイクロリットルをカラム3に移し、よく混合して12.5マイクロモルの濃度にします。これを2回繰り返します。

11 番目のカラムまでの段階希釈で、最終濃度は 0.04 マイクロモルになります。次に、カラム1に5マイクロリットルの培地を細胞のみのポジティブコントロールとして追加し、1ウェルあたり5マイクロリットルのBTVをカラム12にA BTV感染のみとして追加します。ネガティブコントロールは、細胞毒性アッセイのためにカラム2からカラム11までのBTVのウェルあたり5マイクロリットルを追加し、化合物を初期濃度の200マイクロモルに希釈します。

化合物のウェルあたり25マイクロリットルをカラム2に追加し、5回混合して濃度を100マイクロモルにします。25マイクロリットルをカラム2から隣接するカラム3に移し、カラム12を通って続行することにより、2倍のシリーズ希釈を実行します。カラム12を混合した後、混合物の25マイクロリットルを吸引して廃棄します。

カラム1は、抗ウイルスアッセイと細胞毒性アッセイの両方に対応する細胞のみのコントロールです。アッセイプレートの入ったウェットボックスをインキュベーターに72時間入れ、その後プレートを取り出します。次に、CT Gキットを使用して細胞生存率を測定します。

生物統計学およびグラフィックソフトウェアを使用して、各化合物濃度の平均値、標準偏差係数、変動、および細胞生存率を計算し、非線形回帰分析を実行して各化合物のEC 50およびCC 50を決定します。384のカラム1から24の15マイクロリットルにウェルあたり5, 000細胞を播種することにより、添加またはTOAアッセイの時間に備えます。各化合物のウェルマイクロプレート。

各時点について8回の反復で24列すべてを利用します。アッセイ培地マークカラム24のウェルあたり10マイクロリットルをBTV感染のみとして追加することにより、カラム1を細胞のみのコントロールとして割り当てます。アッセイ培地のウェルあたり5マイクロリットル、ウイルスのウェルあたり5マイクロリットルを0.01のMOIで追加することによるネガティブコントロール。

ウェル当たり25マイクロリットルの最終容量において、これらのカラムの異なる時間における抗ウイルス有効性評価カラムとしてカラム2から22までの偶数番号のカラムを選択し、異なるHPIで0.01のMOIでBTVのウェル当たり5マイクロリットルの細胞を感染させ、また、希釈された化合物のウェル当たり5マイクロリットルを、示されたマイナス2のウェル当たり25マイクロリットルの最終容量で追加し、HPIを1つ減らします。BTV感染前にBSR細胞に化合物を添加し、HPIをゼロにするために、化合物とBTVを同時に培養液に加えます。並行して、3 から 23 までの奇数番号の列を、これらの列の異なる時点に対応する複合コントロールのみのコントロールとして指定します。

アッセイ培地のウェルあたり5マイクロリットル、希釈された化合物のウェルあたり5マイクロリットルを、ウェルあたり25マイクロリットルの最終容量で追加します。インキュベーターで細胞を72 HPIまでインキュベートした後、アッセイプレートを取り出し、細胞力価グローキットを使用して細胞生存率を測定します。最後に、マルチモードリーダーを介して取得した発光信号を処理するソフトウェアを使用して、平均値を決定します。

S-T-D-E-V CVおよび各治療の保護細胞生存率 CPEアッセイを使用して生細胞中の細胞A TPを定量することにより、強力な抗ウイルス効果、低毒性、高選択性を備えたいくつかの有望なリード化合物を以前に特定しました。例えば、化合物0 5 2は、0.27±0.12マイクロモルのEC50および82.69マイクロモルのCC50を有することが決定され、どちらも典型的な回帰曲線を示す。非線形回帰分析分析の下で、C 0 5 2のSI 50は、そのEC 50およびCC 50の値に基づいて、306がナノモルスケールの抗ウイルス効果、低毒性、およびその結果として高いSI 50に基づいて、C 0 5 2がここに見られるようにBTVに対する強力で選択的な抗ウイルス剤である可能性があることを示していると決定されました。 細胞を 10 の異なる濃度の C 0 5 2 の存在下で MOI 0.01 で BTV に感染させ、細胞生存率を 72 HPI で決定しました。

CTGキットを使用すると、各データポイントは5回の反復からの平均とSDを表します。TOAアッセイは、化合物が標的とするウイルスライフサイクルの可能な段階を決定するために使用されました。BTV感染の1時間前または2時間前にC 0 5 2を添加すると、この図に見られるように、抗ウイルス効果はナノモルスケールに留まりました。

さらに、C 0 5 2を32HPIおよび48HPIに添加すると、細胞生存率はさらに低下し、C 0 5 2がウイルスの侵入など、ウイルスのライフサイクルの初期段階を超えて作用する可能性があることが示されました。BTVウイルスの複製の最初のサイクルは通常、24 HPI以内の感染細胞で完了するため、私たちの結果は、C 0 5 2がウイルスの複製、パッケージング、成熟、出口などのBTVウイルスライフサイクルの後期に作用する可能性があることを示唆しました。一方、C 0 5 2は、ウイルスのライフサイクルの後期に機能する宿主細胞機構に作用する可能性もあります。

このビデオを見た後、CPEの最高のエッセイを利用して、感染後に測定可能なCPEを誘発するウイルスに対する潜在的なアンチウイルスを特定して分類する方法をよく理解しているはずです。