インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

次の実験の全体的な目標は、感染に応答して上皮細胞単層を通過した好中球の数を決定することです。これは、逆トランズウェルフィルター操作を使用して上皮細胞単層を慎重に培養する前に、コラーゲンをコードするトランスウェルによって達成されます。第2のステップとして、トランスウェルフィルター上で成長した上皮単層の頂端表面に感染するために細菌性病原体を培養し、上皮細胞に内因性の好中球化学療法誘引物質を産生させます。

次に、全血から単離された好中球を、トランスウェルフィルターで成長させた感染した上皮単層の基底外側に添加し、基底外側から頂端側への好中球の移動をアッセイします。その結果、感染した上皮単層に応答して観察された経上皮移動好中球の数の有意な増加を示す結果が得られました 移動した好中球からの骨髄ペルオキシダーゼの定量化に基づいて。逆トランズウェルフィルターによる上皮バリアの成長と感染の操作は型破りであり、馴染みのない研究グループが研究室で確立するには近づきにくいため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。

この技術の意味は、肺炎や嚢胞性線維症などの感染症を伴う気道炎症性疾患の治療にまで及びます。なぜなら、新しい治療法を開発およびテストして好中球のトランス上皮移動の量を減らすことができるため、熱心な好中球の有害な影響を軽減する可能性があります、粘膜バリアの違反。私の研究室の臨床フェローであるマークに加えて、上級技術者のワヒ・プレザとポスドク研究員のマイケル・ペソスが手順を実演します。まず、0.33平方センチメートルの成長領域を、パッケージから3マイクロメートルの細孔サイズのトランズウェルを取り外し、12個のトランズウェルを含む24ウェルプレートをフード内に逆さまに置きます。

底板を持ち上げて外し、脇に置きます。トランズウェルが逆さまになります。24ウェルプレートの炎の蓋の上に置いて、無菌のための止血剤を冷まします。

滅菌止血剤トランスファートランウェルを150×25ミリメートルのペトリ皿に使用し、それらを反転位置に保ち、エタノールで調製された30マイクログラム/ミリリットルのコラーゲン溶液の70マイクロリットルを各反転トランズウェル表面のフィルター膜にピペットで固定します。コラーゲン溶液がトランズウェルの側面に滴り落ちないように注意し、コーティング中にトランズウェルを動かさないように注意してください。このプロセス中に無菌性を維持するために、エタノールを蒸発させるために、ペトリ皿の蓋を最低4時間外しておきます。

テキストプロトコルに記載されているように、上皮細胞を包装した後は、フードファンと紫外線を点灯させてください。15ミリリットルのチューブから70マイクロリットルのResus懸濁細胞溶液を、各逆コラーゲンコーティングトランスウェルに加えます。トランズウェルの播種中に細胞が15ミリリットルチューブの底に沈殿するのを防ぐために、チューブを定期的に静かに反転させて細胞懸濁

すべてのインバーテッドトランスウェルに上皮細胞を播種したら、ペトリ皿カバーを交換し、翌日、細胞を組織培養インキュベーターに慎重に配置します。元の滅菌24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの培地を加え、滅菌した止血剤を使用して、各逆トランスウェルを1ミリリットルの培地を含む各ウェルに反転させます。0.2ミリリットルの培地を各トランスウェルの上部チャンバーに加え、組織培養インキュベーターに戻します。

Transwellフィルターメンブレンの下側で少なくとも8日間培養された上皮層を支持する24ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。各トランスウェルの端を止血器でつかみ、24ウェルプレートから持ち上げます。廃棄物バケツの上でトランズウェルを反転させて、トランズウェルの内部チャンバーから培地を廃棄します。

各トランズウェルを、カルシウムとマグネシウムを含むハンクのバランスの取れた塩溶液またはハンクスプラスを含むウォッシュビーカーに浸して、トランズウェルの内部チャンバーを満たします。次に、内部チャンバーから液体を廃棄物バケツに捨てます。この手順を少し繰り返します。

2回の洗濯の後、ハンクスプラスで洗ってください。トランズウェルを、1ミリリットルのハンクスプラスが入った新しい24ウェルプレートに入れます。各ウェルで、各トランズウェルの上部チャンバーを観察して、上皮細胞層の完全性を評価します。

Hank's Plusは、1ミリリットルのHank's Plusが入った24ウェルプレートのウェルに入れたときに、トランズウェルの上部チャンバーに漏れて充填してはなりません。各トランズウェルを注意深く観察した後、0.2ミリリットルのハンクスプラスを上部のチャンバーに追加します。プレートをインキュベーターに30〜60分間置き、上皮細胞層を平衡化して、好中球トランス上皮遊走アッセイを実施します。

ハンクスプラスで平衡化したウォッシュトランズウェルの24ウェルプレートから止血器で各トランズウェルをつかみ、上部ウェルの液体を廃棄物バケツに捨てます。各トランズウェルを逆さまにして、150 x 25 mmのペトリ皿に逆さまに置き、6つの逆トランスウェルに取り付けます。25マイクロリットルのハンクスプラスを3つの逆トランズウェルに追加します。

テキストプロトコルに記載されているように調製された25マイクロリットルのシュードモナス、アロサ、またはパオ1を細胞に感染させ、最後の3つの逆トランスウェルは、37°Cおよび5%二酸化炭素で60分間インキュベートした後、テキストプロトコルに記載されているように調製されたHanks Plusで希釈された25マイクロリットルの大腸菌、K12、またはmc1000で細胞を感染させます。止血器でつかみ、1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルウォッシュプレートに裏返して、トランズウェルを洗浄します。下部のチャンバーに。

0.2ミリリットルのハンクプラスを上部のチャンバーに追加します。止血器でトランズウェルをつかみ、最初の洗浄プレートから取り出します。上部チャンバーから液体を廃棄物バケツに捨てます。

トランズウェルを1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルウォッシュプレートに2番目のウェルウォッシュプレートに入れる前に、0.2ミリリットルのハンクスプラスをトップチャンバーに追加します。この手順をもう一度繰り返して、合計3回の洗浄を行います。3回目の洗浄後、トランスウェルの上部チャンバーから液体を止血剤を使用して廃棄物バケツに廃棄し、感染していないトランスウェルの3つを1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルマイグレーションプレートの3つのウェルに置き、1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルマイグレーションプレートの10マイクロリットルの10マイクロリットルのネガティブコントロールピペットを10マイクロリットルのFMLPの3つのウェルのそれぞれにハンクスプラスを配置しますさらに、感染していないトランスウェルのうち3つを、単離された好中球の移動能力に対するポジティブコントロールを表す100ナノモルFMLPを含む24ウェルマイグレーションプレートの3つのウェルに配置します。

次に、PAO 1に感染した3つのトランスウェルとmc 1000に感染した3つのトランスウェルを、1ミリリットルのハンクスを含む24ウェルマイグレーションプレートの3つの対応するウェルに配置し、さらに0.1ミリリットルのハンクスプラスを各トランスの0.1ミリリットルのハンクスプラスの上に各トランスウェルの上部チャンバーに追加します。テキストプロトコルに記載されているように調製した好中球懸濁液20マイクロリットルを慎重に追加します。好中球の経上皮移動を可能にするために2時間インキュベートします。

2時間の移行後、止血器でつかんでトランズウェルを持ち上げ、24ウェル移行プレートの内壁を軽くたたきます。トランスウェルを廃棄する前に、10 x 対物レンズを使用して倒立顕微鏡で 24 ウェル移動プレートのウェルを見ることにより、ウェル内の好中球の移動を全体的に評価します。次に、50マイクロリットルの10%Triton X 100を、24ウェルマイグレーションプレート、各標準、およびブランクで使用される各ウェルに追加します。

24ウェルマイグレーションプレートスタンダードを回転させ、低速で20分間ブランクにします。摂氏4度で。50マイクロリットルのクエン酸緩衝液を追加します。

24ウェルマイグレーションプレートで各標準とブランクに徹底的に使用される2つのウェル。各サンプルウェルの内容物を、溶液を少なくとも5回ピペッティングして混合します。次に、各サンプルウェルの100マイクロリットルを96ウェルプレートに二重に移送し、各標準試料の100マイクロリットルとブランクを96ウェルプレートに移します。

混合後、A BTS溶液とボルテックスに50マイクロリットルの30%過酸化水素を加えます。次に、各サンプルに100マイクロリットルのABTS基質溶液を加えます。96ウェルプレートで、プレートを暗闇で5〜10分間発達させます。

405ナノメートルの波長で読み取る前に、溶血好中球を含むプレートのウェルで緑色の発生を観察します。マイクロプレートリーダーを使用して好中球トランス上皮移動を評価する 上皮層を横切って頂端チャンバーに完全に移動した好中球は、倒立光学顕微鏡を使用して視覚化されているように、24ウェル移動プレートの底部ウェルで見ることができます。好中球は、走化性勾配を課さずに感染していない上皮層を横切って移動することが観察され、アッセイのバックグラウンドレベルを表すものはほとんどありませんでした。

対照的に、FMLP勾配が提供された場合、大量のtransmi好中球が明らかになりました。非病原性大腸菌mc 1000による上皮の感染は、目に見えるトランス移動好中球のほとんどをもたらさなかったが、上皮層が肺病原性シュードモナスエアロゲンに感染した場合、多くのトランス移動好中球が観察された。実験で遊走した好中球は、骨髄ペルオキシダーゼ活性を測定することで定量化されます。

好中球の数は、好中球の溶解後に測定されたペルオキシダーゼ活性の量と正の相関があり、値は標準曲線に選択された好中球数の範囲で線形関係を示します。かなりの数の好中球が、Aが提供するFMLP勾配に応答して、またはPAOに感染した上皮層に応答して、上皮層を移動します。刺激がない場合、または非病原性大腸菌mc 1000による頂上皮感染後に遊走する好中球の数は、アッセイの検出限界を下回っています。

この技術を習得すれば、トランスウェルフィルターでコラーゲンをコーティングし、上皮細胞を播種するために5時間で完了し、その後、上皮細胞を成長させるために少なくとも1週間で行うことができます。上皮単分子膜の準備ができたら。遊走アッセイは、好中球の単離や細菌の調製を含め、適切に実施されれば5時間で完了します。

この手順を試行する際は、汚染を防ぐためにトランズウェルフィルターを無菌条件下で準備することを忘れないようにすることが重要です。この手順は、この炎症過程に関連する追加の質問に答えるために適応させることができます。遊走した細胞、上皮、仰臥位、さらには病原体の分析を行うことができます。