Name: インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 14 s
Description: 学ぶ インビトロコーカルチャーアッセイによる病原体誘導性好中球トランス上皮移動の評価方法。好中球の遊走を定量化し、粘膜感染における免疫応答のメカニズム解明に貢献する実験モデルを確立します。

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<ol><li>Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unique+structural+features+that+influence+neutrophil+emigration+into+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung.</a> Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).</li>
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<li>Kohler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+regulates+intercellular+junction+proteins+and+facilitates+transepithelial+neutrophil+and+bacterial+passage%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Gastrointest.+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage.</a> Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).</li>
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<li>Grommes, J., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+neutrophils+to+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Contribution of neutrophils to acute lung injury.</a> Mol. Med. 17, 293-307 (2011).</li>
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<li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li>
<li>Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymorphonuclear+cell+transmigration+induced+by+Pseudomonas+aeruginosa+requires+the+eicosanoid+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).</li>
<li>McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+typhimurium+attachment+to+human+intestinal+epithelial+monolayers%3A+transcellular+signalling+to+subepithelial+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils.</a> J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).</li>
<li>McCormick, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+of+Salmonella+typhimurium+to+intestinal+epithelia+imprints+the+subepithelial+matrix+with+gradients+chemotactic+for+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils.</a> J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).</li>
<li>Mrsny, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+hepoxilin+A3+in+inflammatory+events%3A+a+required+role+in+neutrophil+migration+across+intestinal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).</li>
<li>Tamang, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepoxilin+A%283%29+facilitates+neutrophilic+breach+of+lipoxygenase-expressing+airway+epithelial+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers.</a> J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).</li>
<li>McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apical+secretion+of+a+pathogen-elicited+epithelial+chemoattractant+activity+in+response+to+surface+colonization+of+intestinal+epithelia+by+Salmonella+typhimurium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium.</a> J. Immunol. 160, 455-466 (1998).</li>
<li>Boll, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enteroaggregative+Escherichia+coli+promotes+transepithelial+migration+of+neutrophils+through+a+conserved+12-lipoxygenase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway.</a> Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).</li>
<li>Hurley, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two-component+sensor+response+regulator+RoxS%2FRoxR+plays+a+role+in+Pseudomonas+aeruginosa+interactions+with+airway+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+Infect%22%5BJournal%5D)">The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells.</a> Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).</li>
<li>Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-mediated+PMN+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).</li>
<li>McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+of+the+Shigella+flexneri+virulence+plasmid+in+the+ability+to+induce+trafficking+of+neutrophils+across+polarized+monolayers+of+the+intestinal+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium.</a> Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).</li>
<li>Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+of+a+noninvasive+enteric+pathogen%2C+enteropathogenic+Escherichia+coli%2C+to+cultured+human+intestinal+epithelial+monolayers+induces+transmigration+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils.</a> Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).</li>
<li>Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ERM+protein%2C+ezrin%2C+regulates+neutrophil+transmigration+by+modulating+the+apical+localization+of+MRP2+in+response+to+the+SipA+effector+protein+during+Salmonella+typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).</li>
<li>Pazos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance-associated+transporter+2+regulates+mucosal+inflammation+by+facilitating+the+synthesis+of+hepoxilin+A3%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3.</a> J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).</li>
<li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li>
<li>Bhowmick, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+Disease+during+Streptococcus+pneumoniae+Acute+Lung+Infection+Requires+12-Lipoxygenase-Dependent+Inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation.</a> J. Immunol. , (2013).</li>
<li>Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+eicosanoid-generating+capacity+of+cytoplasmic+phospholipase+A2+in+Pseudomonas+aeruginosa-infected+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Lung+Cell+Mol.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells.</a> Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).</li>
<li>Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+molecules+involved+in+hepoxilin+A3-mediated+neutrophil+transepithelial+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration.</a> Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+Topic+on+Pseudomonas+aeruginosa%2C+Biology%2C+Genetics%2C+and+Host-Pathogen+Interactions.%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions.</a> Front. Microbiol. 3, 20 (2012).</li>
<li>Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+infections+associated+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Lung infections associated with cystic fibrosis.</a> Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).</li>
<li>Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa-mediated+damage+requires+distinct+receptors+at+the+apical+and+basolateral+surfaces+of+the+polarized+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium.</a> Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).</li>
<li>Kierbel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exploits+a+PIP3-dependent+pathway+to+transform+apical+into+basolateral+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane.</a> J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).</li>
<li>Lee, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Salmonella+protein+induces+a+proinflammatory+response+in+epithelial+cells%2C+which+promotes+neutrophil+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).</li>
<li>Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+flexneri+type+III+secretion+system+effectors+OspB+and+OspF+target+the+nucleus+to+downregulate+the+host+inflammatory+response+via+interactions+with+retinoblastoma+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein.</a> Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).</li>
<li>Brazil, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+across+intestinal+epithelium%3A+evidence+for+a+role+of+CD44+in+regulating+detachment+of+migrating+cells+from+the+luminal+surface%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface.</a> J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).</li>
<li>Lawrence, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiadhesive+role+of+apical+decay-accelerating+factor+%28CD55%29+in+human+neutrophil+transmigration+across+mucosal+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia.</a> J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).</li>
<li>Hodges, K., Hecht, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+communication+in+the+gut%2C+from+bacterial+delivery+to+host-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response.</a> J. Physiol. 590, 433-440 (2012).</li>
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著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

粘膜上皮表面を越えて好中球の移動は、細菌病原体3に感染した後の疾患病理における共通の特徴である。本明細書に記載された方法論は、細菌感染によって引き起こされる炎症過程の特徴をモデル化するヒト細胞由来 のインビトロ 共培養アッセイシステムを用いて、この離散事象を実験的に分離するための迅速で簡単なアプローチを提供する。このシステムは、もともと サルモネラ・チフィムリウム、 シゲラ・フレックスネリ、および様々な病原性 大腸菌8,19,24,27,28を含む腸内病原体に感染した分極化した腸上皮細胞を用いて開発された。これらの病原性生物のそれぞれは、逆コラーゲンコーティングされた透過性トランスウェルフィルター上で成長した偏光腸上皮単層を横切って好中球を駆動することができる。本実験系は、肺上皮障壁および病原体誘導性好中球トランス上皮遊走18,26を探索するための改変を用いて適応されている。H292以外のいくつかの気道上皮細胞株は、一般的に引用されたA549、BEAS-2B、およびカル3肺上皮細胞株22,2...

粘膜表面は、環境1,2に広がった外部の脅威に対する保護を提供する物理的および免疫学的障壁として機能する。この保護上皮障壁は、病原性生物が2に侵入すると損なわれる可能性がある。細菌病原体の場合、この遭遇はしばしば自然免疫系を活性化し、好中球2-4として知られている最初の応答者顆粒球の急速な動員を引き起こすことによって炎症過程を誘発する。好中球の採用を促進する化学戦術剤は、問題の病原体2-4の宿主を取り除こうとする粘膜上皮細胞によって部分的に産生される。粘膜上皮表面の過剰または未解決の好中球浸潤は、重大な病理1,5を引き起こす可能性がある。これは、抗細菌性好中球兵器5-7によって引き起こされる非特異的組織損傷の結果である。このような場合、好中球の細菌クリアランス能力は、感染性の侮辱の間に宿主組織の破壊によって影を落とす。 保護上皮バリア機能の破壊は、微生物および/または毒素への基礎組織の暴露の増強をもたらし、病態8,9をさらに悪化させる。これらの結果は、肺および消化管1,5を含む多臓器系で観察することができる。さらに、喘息の重篤な発作、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、および炎症性腸疾患(IBD)などの非感染性炎症性疾患は、過剰好中球応答4,5,10-12による粘膜上皮バリアの病理学的違反によって特徴付けられます。
粘膜感染後の好中球の採用の複雑なプロセスは、いくつかの区画化ステップ1,5,13,14を伴う。第一に、好中球は、経内皮移動を促進する一連の細胞間相互作用を介して循環から逸脱しなければならない1,13。好中球は次に細胞外マトリックス1,14を含む既存の間質空間をナビゲートする。感染した粘膜の内腔に到達するには、好中球は上皮バリア1,4,5を越えて移動しなければならない。この複雑な多段階現象は、多くの場合、生体 内 感染の動物モデル15を用いて集合的に調査される。このようなモデルは、ケモカイン、接着分子、または全体的なプロセスに関与するシグナル伝達経路などの特定の因子の必要性を確立するのに有用であるが、各区分化ステップ16に対して重要な分子寄与を解決するのには大きく不十分である。好中球のトランス内皮、トランスマトリックス、またはトランス上皮移動をモデル化したイン ビトロ 系の共培養は、この点1,14、16、17において特に有用であった。
病原性感染に応答して好中球トランス上皮移動を担う機構を解読することを目的とした強固な共培養アッセイシステムが開発された。このモデルは、分極化したヒト上皮細胞層の有端表面を細菌病原体に感染させ、続いて新たに単離されたヒト好中球をバソラショナル表面18〜22に適用することを含む。好中球は、病原性感染後に分泌される上皮由来の化学戦術産物に応答して上皮バリアを越えて移動する18,21-23.このモデルシステムは、適切な組織特異的細菌病原体に曝露された腸及び肺上皮培養物を用いて採用されており、粘膜感染時の好中球の採用過程において重要である可能性が高い新しい分子機構を明らかにした3,8,19,24-28。この in vitro の共培養モデルの強みは、還元的アプローチにより、研究者が十分に制御され、高度に再現性の高い、かなり安価なシステムで病原体、上皮バリア、および/または好中球を実験的に操作することを可能にすることです。このアプローチから収集された洞察は、 生体内 感染モデル22,29,30を用いた好中球募集中の区分化事象の集中分析を効果的に行うために活用することができる。
本稿では、病原体誘導性好中球越上皮移動を探求するために、この再現可能なモデルを確立するために必要な複数のステップを示す。病原体 シュードモナス・エルギノーザ に感染した肺上皮障壁はこの記事で紹介されています。しかし、他の組織上皮および病原体は、軽微な修飾で置換することができる。逆コラーゲン被覆透過性トランスウェルフィルター上の偏光性肺上皮細胞層の播種および培養は、病原性 P.緑素吸除の 成長および全血からの好中球の単離と同様に、本明細書で詳述される。これらの成分を組み合わせて病原体誘導性好中球トランス上皮移動を観察する方法は、適切な陽性および陰性制御と共に提示され、再現可能なアッセイを確立する。このアプローチの多様性は、病原体誘導性好中球トランス上皮移動の様々な側面を調べるための、文献における特定の研究を参照して議論される。

<table><tbody><tr><td>NCl-H292 細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1848</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 培地</td><td>ATCC</td><td>30-2001<</td><td></td></tr><tr><td>em>Pseudomonas aeruginosa PAO1</td><td>ATCC</td><td>#47085</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli MC1000</td><td>ATCC</td><td>#39531</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) 液体</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td>(カルシウムおよびマグネシウムなし)</td></tr><tr><td>熱不活化ウシ胎児血清</td><td>Invitrogen</td><td>10082-147</td><td>10% 培地に添加</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>100x: 10,000 ユニットのペニシリンと 10,000 μ;g/mlあたりのストレプトマイシン。</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.05%)</td><td>Invitrogen</td><td>25300-062</td><td>50 ml アリコートは、-20°Cで冷凍保存されています。使用中のアリコートは4&ordmに保存できます。C短期.&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ハンクの平衡塩溶液 - HBSS(-)</td><td>Invitrogen</td><td>14175-079</td><td>無菌、カルシウムおよびマグネシウムを含まない</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061.</td><td>株式 = 0.4%</td></tr><tr><td>コラーゲン、ラットテール</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>標準プロトコルを使用して、ラットの尾から直接実験室で単離することもできます</td></tr><tr><td>クエン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909-500G</td><td>1 Mクエン酸緩衝液および酸性クエン酸デキストロース(ACD)溶液</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641-500G</td><td>1 Mクエン酸緩衝液の成分</td></tr><tr><td>無水デキストロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8066-250G</td><td>酸性クエン酸デキストロース(ACD)溶液の成分</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213330-500G</td><td>赤血球(RBC)溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td>赤血球(RBC)溶解緩衝液</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>の成分 Sigma-Aldrich</td><td>ED-100G</td><td>赤血球(RBC)溶解緩衝液の成分</td></tr><tr><td>HBSS(+)粉末</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1387-10L</td><td>HBSS+</td></tr><tr><td>HEPES</td>の主要コンポーネント <td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>HBSS+</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td>のコンポーネント <td>ベンダーの指示に従ってガラスピペットチップをコーティング</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>2,2'-アジノビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)ジアンモニウム塩 (ABTS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9941-50TAB</td><td>ABTS基板溶液の主要成分</td></tr><tr><td>30% 過酸化水素溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>ABTS基板溶液の成分</td></tr><tr><td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLPまたはfMLF)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-3506</td><td>DMSO中の10 mMのストック溶液を調製し、アリコートを-20°Cで保存する必要があります。</td></tr><tr><td>ゼラチンB型</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M-12026</td><td></td></tr><tr><td>シュードモナス分離寒天&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>DF0927-17-1</td><td>メーカーをフォローPIAプレート</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUSの作り方&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>45-001-749</td><td>オプション、好中球の純度を向上させることができます</td></tr><tr><td>24ウェルマイグレーションプレート</td><td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>#3524</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルウォッシュプレート</td><td>ファルコン</td><td>35-1147</td><td>70%エタノールに浸し、再利用する前に徹底的に洗浄すれば再利用できます</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>#12565501</td><td></td></tr><tr><td>トランズウェル透過性サポート&nbsp;</td><td>コーニングインコーポレイテッド</td><td>#3415</td><td>ポリカーボネート;直径:6.5 mm;成長面積:0.33 cm 2;ディッシュスタイル:24ウェルプレート。細孔径:3.0&マイクロ;m</td></tr><tr><td>ペトリ皿</td><td>Falcon</td><td>35-1013</td><td>各ペトリ皿には、0.33 cm2 トランズウェルが24個入っています。&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>500ミリリットル0.2μ;mフィルター/フラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>09-740-25A</td> ガラスパスツールピペットで<td>酸クエン酸デキストロース(ACD)溶液</td></tr><tr><td>5-3/4</td>を滅菌するには <td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-20A</td><td>使用前にシグマコートでチップをコーティング</td></tr><tr><td>ヘモスタット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-812-14</td><td>湾曲した鋸歯状の</td></tr><tr><td>インボトスコップ倒立顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td>#342222</td><td></td></tr><tr><td>バーサマックスマイクロプレートリーダー</td><td>Molecular Devices</td><td>#432789</td><td></td></tr></tbody></table>

インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

粘膜表面は、病原性生物に対する保護障壁として機能します。自然免疫応答は、主に好中球の炎症性細胞を移行させる組織の浸潤につながる病原体を感知すると活性化される。このプロセスは、過剰な場合や未解決の状態で保持されている場合、組織に破壊的になる可能性があります。 培養イン ビトロ モデルは、病原体誘導性好中球トランス上皮移動に関与する独自の分子機構を研究するために利用することができる。このタイプのモデルは、実験設計において、病原体、上皮バリア、または好中球の制御された操作の機会を持つ汎用性を提供します。透過性トランスウェルフィルター上で成長した偏光上皮単層の有端表面の病原性感染は、バソラテラル表面に適用される好中球の有端な経上皮移動に生理学的に関連するバソラターレを扇動する。本明細書に記載の in vitro モデルは、病原性 P.緑素吸 虫(PAO1)に感染した偏光肺上皮単層を横切って好中球の移動を実証するために必要な複数のステップを示す。ヒト由来肺上皮細胞による透過性トランスウェルの播種および培養は、全ヒト血液からの好中球の単離およびPAO1および非病原性K12 大腸菌 (MC1000)の培養と共に記載されている。 病原性感染に応答して動員された好中球の移行過程および定量分析は、陽性および陰性対照を含む代表的なデータで示されている。この インビトロ モデルシステムは、他の粘膜表面に操作し、適用することができます。過剰好中球浸潤を伴う炎症反応は、宿主組織に破壊的であり、病原性感染がない場合に起こり得る。本明細書に記載の インビトロ 共培養アッセイシステムの実験的操作を通じて好中球トランス上皮移動を促進する分子機構をよりよく理解することは、炎症性疾患と同様に感染性の様々な粘膜の範囲に対する新しい治療標的を同定する重要な可能性を有する。

いくつかの研究は、病原体感染上皮層が好中球トランス上皮移動を促進することを実証している3,8,19,24-28,31,32.これは、上皮細胞由来好中球化学修飾勾配3,23の病原体特異的誘導を介して起こる。例えば、肺上皮細胞の有端表面と相互作用する病原性 P.緑素球 は、上皮層18,22,25,26,33,34に渡ってかなりの数の好中球を移動させる。この臨床的に関連するアッセイシステムは、適切なコントロールと組み合わせると、主要な病原体および宿主分子寄与者を明らかにするために、さまざまな方法で操作することができる。
感染していない偏光上皮細胞層に添加された好中球は、かなりの数で移動できない。しかし、感染していない上皮層全体に化学誘引勾配を適用すると、かなりの数の好中球が広がる。感染した上皮層を越えて好中球の移動を調査する際には、各アッセイ内にこれらの陰性対照と陽性対照の両方をそれぞれ含めることが重要である。陰性対照は、シグナルが存在しない場合に上皮層を横切る好中球の背景数を確立する。この数は、培養上皮...

粘膜細菌感染に応答して好中球トランス上皮移動は、上皮損傷および臨床疾患に寄与する。この現象を調整する分子機構の解明に向けた研究を容易にするために、トランスウェルフィルター上で成長した病原体、ヒト好中球、偏光ヒト上皮細胞層を組み合わせた in vitro モデルが開発されました。

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

次の実験の全体的な目標は、感染に応答して上皮細胞単層を通過した好中球の数を決定することです。これは、逆トランズウェルフィルター操作を使用して上皮細胞単層を慎重に培養する前に、コラーゲンをコードするトランスウェルによって達成されます。第2のステップとして、トランスウェルフィルター上で成長した上皮単層の頂端表面に感染するために細菌性病原体を培養し、上皮細胞に内因性の好中球化学療法誘引物質を産生させます。次に、全血から単離された好中球を、トランスウェルフィルターで成長させた感染した上皮単層の基底外側に添加し、基底外側から頂端側への好中球の移動をアッセイします。その結果、感染した上皮単層に応答して観察された経上皮移動好中球の数の有意な増加を示す結果が得られました 移動した好中球からの骨髄ペルオキシダーゼの定量化に基づいて。逆トランズウェルフィルターによる上皮バリアの成長と感染の操作は型破りであり、馴染みのない研究グループが研究室で確立するには近づきにくいため、この手法の視覚的なデモンストレーションは非常に重要です。この技術の意味は、肺炎や嚢胞性線維症などの感染症を伴う気道炎症性疾患の治療にまで及びます。なぜなら、新しい治療法を開発およびテストして好中球のトランス上皮移動の量を減らすことができるため、熱心な好中球の有害な影響を軽減する可能性があります、粘膜バリアの違反。私の研究室の臨床フェローであるマークに加えて、上級技術者のワヒ・プレザとポスドク研究員のマイケル・ペソスが手順を実演します。まず、0.33平方センチメートルの成長領域を、パッケージから3マイクロメートルの細孔サイズのトランズウェルを取り外し、12個のトランズウェルを含む24ウェルプレートをフード内に逆さまに置きます。底板を持ち上げて外し、脇に置きます。トランズウェルが逆さまになります。24ウェルプレートの炎の蓋の上に置いて、無菌のための止血剤を冷まします。滅菌止血剤トランスファートランウェルを150×25ミリメートルのペトリ皿に使用し、それらを反転位置に保ち、エタノールで調製された30マイクログラム/ミリリットルのコラーゲン溶液の70マイクロリットルを各反転トランズウェル表面のフィルター膜にピペットで固定します。コラーゲン溶液がトランズウェルの側面に滴り落ちないように注意し、コーティング中にトランズウェルを動かさないように注意してください。このプロセス中に無菌性を維持するために、エタノールを蒸発させるために、ペトリ皿の蓋を最低4時間外しておきます。テキストプロトコルに記載されているように、上皮細胞を包装した後は、フードファンと紫外線を点灯させてください。15ミリリットルのチューブから70マイクロリットルのResus懸濁細胞溶液を、各逆コラーゲンコーティングトランスウェルに加えます。トランズウェルの播種中に細胞が15ミリリットルチューブの底に沈殿するのを防ぐために、チューブを定期的に静かに反転させて細胞懸濁液を混合します。すべてのインバーテッドトランスウェルに上皮細胞を播種したら、ペトリ皿カバーを交換し、翌日、細胞を組織培養インキュベーターに慎重に配置します。元の滅菌24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの培地を加え、滅菌した止血剤を使用して、各逆トランスウェルを1ミリリットルの培地を含む各ウェルに反転させます。0.2ミリリットルの培地を各トランスウェルの上部チャンバーに加え、組織培養インキュベーターに戻します。Transwellフィルターメンブレンの下側で少なくとも8日間培養された上皮層を支持する24ウェルプレートをインキュベーターから取り出します。各トランスウェルの端を止血器でつかみ、24ウェルプレートから持ち上げます。廃棄物バケツの上でトランズウェルを反転させて、トランズウェルの内部チャンバーから培地を廃棄します。各トランズウェルを、カルシウムとマグネシウムを含むハンクのバランスの取れた塩溶液またはハンクスプラスを含むウォッシュビーカーに浸して、トランズウェルの内部チャンバーを満たします。次に、内部チャンバーから液体を廃棄物バケツに捨てます。この手順を少し繰り返します。2回の洗濯の後、ハンクスプラスで洗ってください。トランズウェルを、1ミリリットルのハンクスプラスが入った新しい24ウェルプレートに入れます。各ウェルで、各トランズウェルの上部チャンバーを観察して、上皮細胞層の完全性を評価します。Hank's Plusは、1ミリリットルのHank's Plusが入った24ウェルプレートのウェルに入れたときに、トランズウェルの上部チャンバーに漏れて充填してはなりません。各トランズウェルを注意深く観察した後、0.2ミリリットルのハンクスプラスを上部のチャンバーに追加します。プレートをインキュベーターに30〜60分間置き、上皮細胞層を平衡化して、好中球トランス上皮遊走アッセイを実施します。ハンクスプラスで平衡化したウォッシュトランズウェルの24ウェルプレートから止血器で各トランズウェルをつかみ、上部ウェルの液体を廃棄物バケツに捨てます。各トランズウェルを逆さまにして、150 x 25 mmのペトリ皿に逆さまに置き、6つの逆トランスウェルに取り付けます。25マイクロリットルのハンクスプラスを3つの逆トランズウェルに追加します。テキストプロトコルに記載されているように調製された25マイクロリットルのシュードモナス、アロサ、またはパオ1を細胞に感染させ、最後の3つの逆トランスウェルは、37°Cおよび5%二酸化炭素で60分間インキュベートした後、テキストプロトコルに記載されているように調製されたHanks Plusで希釈された25マイクロリットルの大腸菌、K12、またはmc1000で細胞を感染させます。止血器でつかみ、1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルウォッシュプレートに裏返して、トランズウェルを洗浄します。下部のチャンバーに。0.2ミリリットルのハンクプラスを上部のチャンバーに追加します。止血器でトランズウェルをつかみ、最初の洗浄プレートから取り出します。上部チャンバーから液体を廃棄物バケツに捨てます。トランズウェルを1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルウォッシュプレートに2番目のウェルウォッシュプレートに入れる前に、0.2ミリリットルのハンクスプラスをトップチャンバーに追加します。この手順をもう一度繰り返して、合計3回の洗浄を行います。3回目の洗浄後、トランスウェルの上部チャンバーから液体を止血剤を使用して廃棄物バケツに廃棄し、感染していないトランスウェルの3つを1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルマイグレーションプレートの3つのウェルに置き、1ミリリットルのハンクスプラスを含む24ウェルマイグレーションプレートの10マイクロリットルの10マイクロリットルのネガティブコントロールピペットを10マイクロリットルのFMLPの3つのウェルのそれぞれにハンクスプラスを配置しますさらに、感染していないトランスウェルのうち3つを、単離された好中球の移動能力に対するポジティブコントロールを表す100ナノモルFMLPを含む24ウェルマイグレーションプレートの3つのウェルに配置します。次に、PAO 1に感染した3つのトランスウェルとmc 1000に感染した3つのトランスウェルを、1ミリリットルのハンクスを含む24ウェルマイグレーションプレートの3つの対応するウェルに配置し、さらに0.1ミリリットルのハンクスプラスを各トランスの0.1ミリリットルのハンクスプラスの上に各トランスウェルの上部チャンバーに追加します。テキストプロトコルに記載されているように調製した好中球懸濁液20マイクロリットルを慎重に追加します。好中球の経上皮移動を可能にするために2時間インキュベートします。2時間の移行後、止血器でつかんでトランズウェルを持ち上げ、24ウェル移行プレートの内壁を軽くたたきます。トランスウェルを廃棄する前に、10 x 対物レンズを使用して倒立顕微鏡で 24 ウェル移動プレートのウェルを見ることにより、ウェル内の好中球の移動を全体的に評価します。次に、50マイクロリットルの10%Triton X 100を、24ウェルマイグレーションプレート、各標準、およびブランクで使用される各ウェルに追加します。24ウェルマイグレーションプレートスタンダードを回転させ、低速で20分間ブランクにします。摂氏4度で。50マイクロリットルのクエン酸緩衝液を追加します。24ウェルマイグレーションプレートで各標準とブランクに徹底的に使用される2つのウェル。各サンプルウェルの内容物を、溶液を少なくとも5回ピペッティングして混合します。次に、各サンプルウェルの100マイクロリットルを96ウェルプレートに二重に移送し、各標準試料の100マイクロリットルとブランクを96ウェルプレートに移します。混合後、A BTS溶液とボルテックスに50マイクロリットルの30%過酸化水素を加えます。次に、各サンプルに100マイクロリットルのABTS基質溶液を加えます。96ウェルプレートで、プレートを暗闇で5〜10分間発達させます。405ナノメートルの波長で読み取る前に、溶血好中球を含むプレートのウェルで緑色の発生を観察します。マイクロプレートリーダーを使用して好中球トランス上皮移動を評価する 上皮層を横切って頂端チャンバーに完全に移動した好中球は、倒立光学顕微鏡を使用して視覚化されているように、24ウェル移動プレートの底部ウェルで見ることができます。好中球は、走化性勾配を課さずに感染していない上皮層を横切って移動することが観察され、アッセイのバックグラウンドレベルを表すものはほとんどありませんでした。対照的に、FMLP勾配が提供された場合、大量のtransmi好中球が明らかになりました。非病原性大腸菌mc 1000による上皮の感染は、目に見えるトランス移動好中球のほとんどをもたらさなかったが、上皮層が肺病原性シュードモナスエアロゲンに感染した場合、多くのトランス移動好中球が観察された。実験で遊走した好中球は、骨髄ペルオキシダーゼ活性を測定することで定量化されます。好中球の数は、好中球の溶解後に測定されたペルオキシダーゼ活性の量と正の相関があり、値は標準曲線に選択された好中球数の範囲で線形関係を示します。かなりの数の好中球が、Aが提供するFMLP勾配に応答して、またはPAOに感染した上皮層に応答して、上皮層を移動します。刺激がない場合、または非病原性大腸菌mc 1000による頂上皮感染後に遊走する好中球の数は、アッセイの検出限界を下回っています。この技術を習得すれば、トランスウェルフィルターでコラーゲンをコーティングし、上皮細胞を播種するために5時間で完了し、その後、上皮細胞を成長させるために少なくとも1週間で行うことができます。上皮単分子膜の準備ができたら。遊走アッセイは、好中球の単離や細菌の調製を含め、適切に実施されれば5時間で完了します。この手順を試行する際は、汚染を防ぐためにトランズウェルフィルターを無菌条件下で準備することを忘れないようにすることが重要です。この手順は、この炎症過程に関連する追加の質問に答えるために適応させることができます。遊走した細胞、上皮、仰臥位、さらには病原体の分析を行うことができます。

in-vitro-coculture-assay-to-assess-pathogen-induced-neutrophil-trans

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶ インビトロコーカルチャーアッセイによる病原体誘導性好中球トランス上皮移動の評価方法。好中球の遊走を定量化し、粘膜感染における免疫応答のメカニズム解明に貢献する実験モデルを確立します。

インビトロ病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

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