Name: 外植片培養での歯胚の開発に続いてのためのスライス培養法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-13T20:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: 学ぶ 胎生マウスの下顎をスライス培養し、歯胚の発生を数日間観察する方法。系譜追跡により細胞動態を可視化し、従来の外植片培養では困難な組織環境での歯の発生過程をリアルタイムで解析できます。

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サラA. Alfaqeehは歯科、高等教育省、サウジアラビア王国の種類サウド大学によって資金を供給される。

1。セットアップする<ol><li> （鉱物油で潤滑研ぎ石を使用して）解剖器具をシャープにし、70％エタノールスプレーや乾熱滅菌を使用して器官培養に使用する前に滅菌する。 12 V電源を使用して、2M水酸化ナトリウムで電気分解を使用して解剖針を研ぐ。 </li><li> 1％のグルタおよび1％ペニシリン - ストレプトマイシンを補充したアドバンスト·ダルベッコ改変イーグル培地、F12（DMEM F12キー）からなる、胚の器官の解剖と培養に用いる培養液を準備します。 </li></ol> 2。胚解剖<ol><li>ホームオフィスやその他の管理機関によって承認されたスケジュール1の方法を使用して、時限交配、妊娠女性を間引く。下腹部の周りの皮膚を離れて解剖し、ハサミを使って腹部を開いてカット。下正中線で一緒に接続する2つの子宮角を見つけます。 </li><li>氷の上の媒体で満たされたチューブ内の子宮と場所を解剖する。 WHEnは氷上で、組織は、数時間放置することができる。 </li><li>子宮を取り出して、顕微鏡下で培地中のペトリ皿に置く。可能な胚の解離は、汚染を最小限に抑えるために層流フード内で実行されるべきある。 </li><li>子宮から胚を解剖し、その胚体外組織からそれらを解放。 </li><li>タングステン針を使用して胚を斬首し、培地の新鮮な皿に頭を移す。 </li><li>口腔内に針を配置することで、ヘッドから下顎を隔離し、頭の後ろ（ 図1Aおよび図1B）に向かってカットスルー。チョッピングを待っている間に単離されたあごを一時的に氷上で媒体に格納することができる。 </li><li>全体下顎のスライスラインステージのためE11.5-E15.5歯胚培養のための理想的です。 E15.5の後に下顎骨の途上骨は、チョッピングのためにあまりにも難しいです。歯のスライスは、まだすることができますが、骨（歯骨や歯槽骨を形成する）は、最初にして除去されなければならない9チョッピングの前に解剖。タングステン針とピンセットを使って慎重に骨を除去。 </li></ol> 3。胚スライス<ol><li>標準テーブル組織チョッパー（ 図1C）を使用して、下顎骨組織切片を準備します。約200顎後に新鮮な刃を使用し、それが低下したときにはディスク装着と同一平面にあることを確認してください。 </li><li>使用前に70％エタノールでディスク装着し、ブレードを清掃してください。マシンを使用している場合、ブレードは非常にシャープでよう注意が必要があります。 </li><li>標本の年齢に応じて200〜400ミクロンの間の切断距離でチョッパーを設定し、全体の歯胚が必要であるかどうかに応じて。最大でブレード力を設定。 </li><li>ピペットまたはピンセットを用いてプラスチック製の取り付けディスクに下顎を転送します。向きがまだ明確で確認して、ディスク上に下顎を配置します。現像舌配向を決定するのに有用なランドマークとして使用することができる。臼歯ためのAFを使用切歯のために、彼らは（ 図2Aにチョッピングの面を参照）成長するにつれて、これらの歯の様々な方向を反映するように、下顎の矢状スライスを使用している間rontal /横方向（ 図1（b）にチョッピングの面を参照）。 </li><li>少し取り付けディスクに下顎を乾燥させるために、ろ紙を用いて組織の周りから過剰な培地を除去。 </li><li>すぐに乾燥させた後、チョッパーの円形のステンレス製のテーブルの上にディスクを置きます。マシンの電源を入れ、[開始]を押します。表は、同時にブレードを担持するチョッピングアームを上昇さ/分、最大200ストロークで滴下しながら左から右に自動的に横断する。 </li><li>組織が完全にスライスされた後、マシンの電源をオフにします。ブレードアームが上昇位置にあることを確認して、ディスクを取り出します。ブレードアームの下に指を入れたりチョッピング時に無人の機械を放置しないでください。 </li><li>ディスク装着を取るとすぐにメディアトンを追加過度の乾燥を防ぐために、ディスク上のスライスO。注意深く培地の小さなペトリ皿（ 図2A）内にタングステン針、次いでピペットを用いて、ディスクの底からスライスされた組織を取り除く。 </li><li>針を使用してスライスを分離した後、実体顕微鏡（ 図1D、1E、および図2B）の下で、目的の組織を含む組織切片を選択します。培地で新鮮な培養皿に選択したスライスを配置します。 </li></ol> 4。スライス文化<ol><li> 、脱水を防ぐために、外側のウェルにオートクレーブ処理水約2mlを添加して皿の中央を横切って金属グリッドを配置することによって、培養の準備が中央ウェル器官培養皿を準備し（ 図3Aおよび3B）。 </li><li>ステンレスメッシュのシートからX 1.5センチメートル約4センチのストリップを切断した金属グリッドを準備します。中央に穴を作るために穴パンチを使用し、曲げ千鳥エンドを作成するための側面。グリッドは、ディッシュ（ 図3Aと図3B）の底に平行に横たわって、中央だけでなく全体に平らに適合する必要があります。使用前に滅菌するグリッドをオートクレーブ。 </li><li>グリッドの穴を​​カバーするのに十分な大き透明なポリエチレンテレフタレート（PET）膜（孔径0.4μm）での片を切り取る。選択されたスライスと皿にカット膜を置きます。 </li><li>膜の上にスライスを配置し、慎重に中央に平らにスライスして、媒体からメンブレンを持ち上げます。 </li><li>中央にある円形の穴の上にグリッド上にフィルターを置き、膜のレベルまで、ウェルに培養液に約1ミリリットルを追加。 </li><li>操作のために（例えば、8）を培地にタンパク質または小分子阻害剤を追加します。 </li><li>文化の日の0時に形態学のレコードのスライスを撮影しています。 </li><li> 5％のCOの加湿雰囲気中で食器を置く<sインキュベーター内で37℃で&gt; 2 UB。 </li><li>平均して7日間、定期的に文化を撮影しています。培養液ごと48〜72時間を変更します。写真撮影のための下（ 図2C-E）からの光源を用いてスライスを表示します。 </li></ol> 5。リネージュトレース系譜トレースが必要な場合は、このようにDiIまたはDiOのような親油性染料は、ステップ4、スライス培養の前に歯胚に注入することができる。 <ol><li>ニードルプラーを用いてガラスキャピラリー針を引き出します。 </li><li>ピンセットを用いて、針の先端を破壊し、ダウン色素溶液にチップを置く。染料は、毛細管現象によってチップを埋めながら、数分間のままにしておきます。 </li><li>ホルダーに充填された注射針を配置し、注射器や口アスピレーターに管を介して取り付けます。 </li><li>ラベルされることになったスライスの領域をタッチし、培地中の針の先端の位置を決めます。針ANから少量の染料を変位させる空気圧を適用する組織上にD。 </li><li>針を取り外し、蛍光下にラベルを確認してください。 </li><li>正常に標識されたスライスは、フィルターに移し、工程4に記載のように培養することができる。 </li></ol>

<ol><li>Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+map+of+the+dental+mesenchyme%3A+dynamic+development+of+the+dental+papilla+and+follicle%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle.</a> Developmental biology. 366, 244-254 (2012).</li>
<li>Ferguson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+an+essential+early+mesenchymal+signal+in+tooth+development+that+is+required+for+patterning+of+the+murine+dentition%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+development%22%5BJournal%5D)">Activin is an essential early mesenchymal signal in tooth development that is required for patterning of the murine dentition.</a> Genes & development. 12, 2636-2649 (1998).</li>
<li>Trowell, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+culture+of+mature+organs+in+a+synthetic+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">The culture of mature organs in a synthetic medium.</a> Experimental cell research. 16, 118-147 (1959).</li>
<li>Matalova, E., Antonarakis, G. S., Sharpe, P. T., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+of+primary+and+secondary+enamel+knots%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+dynamics+%3A+an+official+publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Cell lineage of primary and secondary enamel knots.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 754-759 (2005).</li>
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<li>Buchtova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+and+patterning+of+the+snake+dentition+are+dependent+on+Sonic+hedgehog+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Initiation and patterning of the snake dentition are dependent on Sonic hedgehog signaling.</a> Developmental biology. 319, 132-145 (2008).</li>
<li>Buchtova, M., Stembirek, J., Glocova, K., Matalova, E., Tucker, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+regression+of+the+dental+lamina+underlies+the+development+of+diphyodont+dentitions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+dental+research%22%5BJournal%5D)">Early regression of the dental lamina underlies the development of diphyodont dentitions.</a> Journal of dental research. 91, 491-498 (2012).</li>
<li>Cho, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+primary+enamel+knot+determines+the+position+of+the+first+buccal+cusp+in+developing+mice+molars%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">The primary enamel knot determines the position of the first buccal cusp in developing mice molars.</a> Differentiation; research in biological diversity. 75, 441-451 (2007).</li>
<li>Sakano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+dynamics+in+cervical+loop+epithelium+during+transition+from+crown+to+root%3A+implications+for+Hertwig%27s+epithelial+root+sheath+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+periodontal+research%22%5BJournal%5D)">Cell dynamics in cervical loop epithelium during transition from crown to root: implications for Hertwig's epithelial root sheath formation.</a> Journal of periodontal research. , (2012).</li>
<li>Fisher, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphological+development+in+vitro+of+the+whole+and+halved+lower+molar+tooth+germ+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+oral+biology%22%5BJournal%5D)">Morphological development in vitro of the whole and halved lower molar tooth germ of the mouse.</a> Archives of oral biology. 16, 1481-1496 (1971).</li>
<li>Coin, R., Schmitt, R., Lesot, H., Vonesch, J. L., Ruch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+halved+embryonic+lower+first+mouse+molars%3A+correlation+with+the+distribution+pattern+of+non+dividing+IDE+cells%2C+the+putative+organizers+of+morphogenetic+units%2C+the+cusps%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+journal+of+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Regeneration of halved embryonic lower first mouse molars: correlation with the distribution pattern of non dividing IDE cells, the putative organizers of morphogenetic units, the cusps.</a> The International journal of developmental biology. 44, 289-295 (2000).</li>
<li>Kavanagh, K. D., Evans, A. R., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+evolutionary+patterns+of+mammalian+teeth+from+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting evolutionary patterns of mammalian teeth from development.</a> Nature. 449, 427-432 (2007).</li>
<li>Munne, P. M., Tummers, M., Jarvinen, E., Thesleff, I., Jernvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tinkering+with+the+inductive+mesenchyme%3A+Sostdc1+uncovers+the+role+of+dental+mesenchyme+in+limiting+tooth+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tinkering with the inductive mesenchyme: Sostdc1 uncovers the role of dental mesenchyme in limiting tooth induction.</a> Development. 136, 393-402 (2009).</li>
</ol>

著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

歯の文化のこの方法は、歯胚へのアクセスの利点は、上皮または間葉内のビーズの正確な系譜トレースと配置を可能にする優れています。発展途上歯胚の決定された領域は、したがって、特に標的とすることができる。培養中に歯胚の変化形態を続けることができ、かつ操作の効果はすぐに評価した。 これらは正確に細断することができないような方法は、しかし、そのような象牙質及びエナメル質などの硬組織の実質的な形成の前に若い歯胚にのみ適している。 E15.5後顎のためには、チョッピングの前に骨を除去する必要がある。これは、潜在的に密接E16.5からの骨に関連付けられている歯胚を損傷させるという欠点がある。我々が正常に歯がエナメル質の堆積のためにカットするチョッパーのために硬くなりすぎた後、生後4、解剖歯胚をスライスしています。スライスMethodは蕾の段階1,6、つまり 、E13.5からの歯胚に適しています。歯は、上皮肥厚の段階にあるときに、この時点の前に、歯の細菌が発達行うが、成功率が低下し、形態が長期的に影響を受けることができる。 <p class="jove_...

多くの実験のためには、培養組織ex vivoでの開発に従うことができることが重要である。組織を発症する培養物は、開発の定義された周期でアクセスを提供し、培養培地への因子の添加による遺伝子の操作、または装填ビーズ上、およびトランスフェクションおよびエレクトロポレーション1を用いて可能にする。多くの実験のために、それが成長するにつれて、組織は、形態形成を受けるように系統標識細胞の運命を追跡するために、例えば、組織を可視化できることが重要である。これは、胚からの組織のブロックを培養するときに明らかにされていません胚の中の深い開発組織に特に問題となり得る。彼らは下顎、上顎骨および前頭鼻プロセス内で開発するように歯が、この良い例です。全体顎骨を培養したときに歯の表面的な構造が見ることができますが、形態の変化は、固定された組織の切片化した後に分析することができます<s&gt; 2まで。私たちは、私たちが歯胚の発達に従うことを可能にし、開発中に歯の様々な部分へのアクセスを提供するライブスライス培養技術を適応している。修正されたTrowellの方法3を使用して気液界面での技術培養歯胚スライス、。これらのスライス培養を直接歯の形態形成に続いて、このようなエナメルの結び目と歯乳頭や毛包1,4-7などの個別のコンポーネントの系譜トレースを可能に非常に有用であった。技術は、マウス胚に限定されず、正常ブタの培養生のスライスとヘビ歯組織8,9に用いられてきた。歯の発生を可視化することができるという利点に加えて、スライス方法はまた、組織の薄いスライスをインキュベーターから媒体と空気から栄養分へのアクセスが増加しているという利点を有する。これが改善され、生体内での開発と一致する歯胚の成長、およびshow invasになり乳頭7への内皮細胞のイオン。これとは対照的に、全体の下顎の文化で歯胚は、 生体内でのものよりも遅く発展と文化の中心地は、多くの場合、長期培養中に壊死性である。スライス培養において、歯は、顎のスライス内で発達し、周囲の現像骨および他の組織との相互作用を監視することができる。本手法では、組織は、直線支持媒体10,11に埋め込 ​​む必要はありませんし、チョッピングブロックに組織を取り付けるための任意のシステムを必要とせず、解剖後に切り刻まれている。方法は、多くの下顎骨が1セッションで区分けすることができるように、そのための非侵襲的かつ迅速である。

<table><tbody><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>101077Y</td><td>100%エタノールを蒸留H2Oで70%に希釈した。</td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td>Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Sigma</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>DiI (Molecular probes)</td><td>Vybrant</td><td>V-22885</td><td>細胞標識溶液</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Cell tracker CM-DiI, C-7000</td></tr><tr><td>DiO (Molecular probes)</td><td>Vybrant</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Geminator 500</td><td>Thomas</td><td>No. 3885A20</td><td>Dry-heat sterilization</td></tr><tr><td>McIlwain tissue chopper</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>10180</td><td>スタンダードテーブル</td></tr><tr><td>オルガンカルチャーディッシュ (Center-Well Organ Culture Dish)</td><td>Falcon</td><td>353037</td><td></td></tr><tr><td>Membranes (Cell Culture Inserts, 0.4 &mu;m孔径)</td><td>BD Falcon</td><td>353090</td><td>PETトラックエッチング膜、6ウェルフォーマット</td></tr><tr><td>金属グリッド(ステンレス鋼-AISI 304-メッシュ)</td><td>Goodfellow</td><td>FE228710</td><td>(Fe/Cr18/Ni10)</td></tr><tr><td>AutoFlow Direct Heat CO2 インキュベーター</td><td></td><td>Nuaire NU-5500</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Intracel Ltd</td><td>051-0500-900 0-100 psi</td><td>シングルチャンネル ピコスプリッツァーIII</td></tr><tr><td>フィラメント付きガラスキャピラリー 1 mm</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td><td></td></tr><tr><td>タングステン線 0.1 mm</td><td>グッドフェロー</td><td>W005138</td><td></td></tr><tr><td>タングステン線 0.38 mm</td><td>グッドフェロー</td><td>W005155</td><td></td></tr><tr><td>アスピレーターチューブ</td><td>シグマ</td><td>A5177</td><td>口内吸引系統トレーサーに使用</td></tr></tbody></table>

外植片培養での歯胚の開発に続いてのためのスライス培養法

The Slice Culture Method for Following Development of Tooth Germs In Explant Culture

外植片培養物は、特定の時点で現像器官の操作を可能にし、従って、発生生物学者のための重要な方法である。多くの器官のために、ex vivoで培養中に監視できるように、発達中の組織にアクセスすることは困難である。形態形成運動に従うことができ、特定の細胞集団が、系統操作またはトレースの対象とすることができるようにスライス培養法は、組織へのアクセスを可能にする。 本論文では、種の範囲の歯胚の培養に非常に成功しているスライス培養する方法を説明します。この方法は、他の顎の組織に囲まれた、生体内で観察されたものと同様の速度にて開発歯胚への優れたアクセスを提供します。これは、歯と周囲組織との間の組織の相互作用を監視することを可能にする。本論文では、歯胚に集中していますが、同じプロトコルは数値の発展をたどるために適用することができますこのような唾液腺、メッケル軟骨、鼻腺、舌、耳などの他の臓器の。

第一大臼歯歯小嚢の動きに追従するためには、250μmの正面切片を上記の方法を用いて下顎を介して採取した。歯小嚢は、発生中の歯の外側のエナメル上皮（OEE）を取り囲む間葉の層であり、先に6の歯周組織の形成に関与することが示されている。顎はE14.5、歯の発生のキャップ段階で解剖した。スライスにおける歯科上皮の輪郭が明らかになった、と凝縮歯科間充織は、歯上皮（ 図4A）の周りに暗いリングとして同定することができた。のDiIは舌側（ 図4A）上の歯のスライスの外側のエナメル上皮の隣の間充織に注入した。標識後の切片を4日間培養した間隔（ 図4Bおよび4C）で写真撮影した。 インビボ歯胚に達したであろうE18.5によるベルステージと、別個のベル段形状がこの期間にわたって類似の進行を示す、切片で観察された。のDiIのスポットは、歯が（ 図4Bおよび4C）成長したように、外側の歯科上皮の周りに延びるセルの帯域に...

ここでは、詳細な組織チョッパーを用いて下顎骨のスライスにおける培養歯胚へのメソッド。この方法は、より伝統的な培養法を用いて、利用できない、操作および系統の追跡のための素晴らしい機会を提供し、開発中に歯に固有のアクセスを許可します。

Explant culture allows manipulation of developing organs at specific time points&#160;and is therefore an important method for the developmental ...

次の実験の全体的な目標は、歯の発達を数日間にわたって追跡することです。In vitro explan培養では、これは、胎児マウスの発育中の下顎骨を生きたスライスに解剖して、発生中の歯の細菌を第二のステップとして露出させることによって達成されます。スライスを選抜し、培地上のフィルターに載せ、インキュベートして発育させます。次に、培養期間中の細胞の動きを追跡するために、スライスを系統トレーサーで標識し、explan培養中に歯の組織が発達する際の歯組織の動的な性質を示す結果が得られます。この技術が従来の外植片培養と比較した場合の主な利点は、歯の宝石のような内部で発達する器官を、周囲の組織の状況下でその発達全体を通して観察できることです。この方法の視覚的なデモンストレーションは、機械のセットアップや組織の向きが不正確である場合、チョッピングと選択のステップが困難になる可能性があるため、非常に重要です。まず、1%グルタミン酸と1%ペニシリンストレプトマイシンを500ミリリットルの高度なECCO修飾イーグル培地F 12に添加することにより、胚器官の解剖および培養培地を準備します。次に、高橋角氏の動画記事に記載されているように、発生段階のE11.5からE15.5までのマウスの胚を解剖し、新鮮な培地を入れたシャーレに入れます。次に、研ぎたての滅菌タングステン針を使用して胚の首を切り落とし、頭を氷の上で事前に冷やした培地の新鮮な皿に移します。次に、口腔内に針を刺し、一時的に後頭部に向かって切断することにより、下顎骨を頭から分離します。分離された下顎骨は、切片化する前に氷の上で事前に冷却した培地に保管してください。下顎組織をスライスする前に、70%エタノールで組織チョッパーの取り付けディスクとブレードを清掃し、ブレードが取り付けディスクと同じ高さにあることを確認します。落下した場合、下顎骨を約200個スライスした後に刃を交換する必要があり、切断距離は標本の年齢に応じて200〜400マイクロメートルに設定し、歯胚の分離が必要なE14.5胚に歯胚全体の歯胚が必要かどうかに応じて、250マイクロメートルの切断距離が使用されます。次に、プラスチック製の取り付けディスクに下顎骨を移し、発育中の舌が正面横向きになるように配置します。大臼歯を解剖して切歯を分離するときは、下顎骨を通して矢状切片を採取します。正しい向きになったら、組織の周りから余分な培地を取り除きます。濾紙を使用すると、下顎骨がわずかに駆動され、取り付けディスクの所定の位置に固定されます。濾紙で乾燥させた直後、チョッパーの円形のステンレス製テーブルにディスクを置きます。次に、ブレードの力を最大に設定し、マシンの電源を入れてスタートを押します。テーブルは左から右に自動的に移動し、同時に刃を運ぶチョッピングアームは毎分最大200ストロークで上下します。ティッシュが完全にスライスされたら、マシンの電源を切ります。ブレードアームが持ち上げられた位置にあることを確認してから、ディスクを取り出します。ブレードアームの下に指を置いたり、機械を放置したりしないでください。ティッシュを刻むときは、過度の乾燥を防ぐために、取り付けディスクを取り、すぐにディスク上のスライスに媒体を追加します。次に、タングステン針またはピペットを使用して椎間板の底からスライス組織を慎重に取り除き、それらを中程度の小さなペトリ皿にピペットで移します。次に、針を使用して個々のスライスを分離し、実体顕微鏡下で関心領域を含む組織スライスを選択します。選択したスライスを新鮮な中程度の培養皿に置き、ステンレス鋼の平織りのシートから4センチメートル×1.5センチメートルのストリップを切断して、培養システム用の金属グリッドを準備します。次に、標準の固定穴パンチを使用して中央に穴を開け、グリッドが中央の井戸を横切って平らに収まり、皿の底と平行になるように側面を曲げます。グリッドが正しく形作られたら、使用前にオートクレーブで滅菌してください。次に、脱水症状を防ぐために外側の井戸に2ミリリットルのオートクレーブ水を追加して、中央の井戸臓器培養皿を培養用に準備します。次に、皿の中央に滅菌金属グリッドを配置します。孔径が0.4マイクロメートルの透明なポリエチレンテレフタレート膜をカットして、グリッドの穴を覆うのに十分な大きさになるようにします。次に、系統のトレースが必要な場合は、選択した下顎スライスを使用して、カットメンブレンを皿に入れます。まず、ニードルプラーでガラスを引き抜いてガラスキャピラリーニードルを準備します。次に、針の先端を折って、dai eyeやdai oなどの親油性染料溶液に先端を置き、毛細管現象によって染料溶液の一部を吸い上げます。数分後、充填した針をホルダーに入れ、口の吸引器に取り付けます。針の先端を培地に配置して、ここに示されている歯科用卵胞など、ラベルを付ける領域に触れるようにします。次に、少量の染料を組織に置換します。次に、スライスを蛍光顕微鏡ステージに移し、スライスが正常に標識されたことを確認します。ラベル付けに成功したら、スライスをメンブレンの上に慎重に持ち上げ、スライスを中央で平らにしてメンブレンを培地から移します。次に、培地のレベルが膜の高さになるまで、約1ミリリットルの培地をウェルに充填するグリッドの中央にある円形の穴にフィルターを置きます。この時点で、タンパク質や低分子阻害剤を培地に加えます。また、最高の写真を撮るために、解剖顕微鏡を使用してゼロ日目の形態の記録のためにスライスを画像化し、下から光源でスライスを表示します。皿を5°Cの二酸化炭素37°Cの加湿雰囲気に保ち、メディアは2〜3日ごとに定期的に交換してください。進捗状況を追跡するために、文化をイメージし続けます。ここに示されているのは、第一大臼歯の歯の卵胞の発達を記録した一連の画像であり、これは色素眼蛍光染色で標識されています。このスライスは、E 14.5でマウスの下顎骨から解剖された厚さ250ミクロンの前頭スライスです。黒い点で縁取られた歯は、0日目のキャップステージから始まります。4日目までに、歯の胚芽はベルステージに達し、歯の卵胞細胞が発達中の外側のエナメル質の周りに弧を描いて広がっているのが見られます。上皮 一度習得すれば、この技術は胚から最終培養まで3時間で行うことができます。このビデオを見た後、培養における臓器の発達をうまく視覚化する方法をよく理解しているはずです。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

E18ラット脳の器官型スライス培養

精密に切断されたスライスを含む器官型一次組織外植片培養物は、天然組織の三次元(3D)組織構造と多細胞相互作用を表しています。このビデオでは、組織を酸素と栄養素に断続的に曝露できるシステムである回転インキュベーションユニットを使用して、マウス肺腫瘍由来組織切片を培養する様子を説明しています。このプロトコルは、薬物反応研究のために精密にカットされた肺腫瘍スライスを生成および培養する方法を説明しています。...

肺腫瘍組織外植片培養:精密切片肺腫瘍スライスを作製および培養する手順

このビデオは、膠芽腫組織からの器官型スライス培養の生成と維持を示しています。単離された組織をアガロースマトリックスに包埋し、ビブラトームを用いて薄い切片を得る。次に、これらの切片をマイクロプレート内の透過性メンブレンインサートに配置し、スライス培養維持培地で培養して長期維持します。...

ヒト膠芽腫組織からのスライス培養物の生成と維持

このビデオは、歯の胚芽パルプと三叉神経節の間の相互作用を研究するためのマイクロ流体デバイスの使用を示しています。マイクロ流体デバイス内の組織の配置を示し、デバイスのマイクログルーブを介して歯の胚芽に向かっている三叉神経突起の成長を詳細に視覚化します。さらに、歯の胚芽髄への神経突起伸展を促進または阻害する歯由来の分子因子の役割を強調しており、これは出生後の効率的な歯の神経支配を確保するために重要です。...

マイクロ流体共培養システムを用いた歯胚芽と三叉神経節の相互作用の解析

共培養は、神経と標的組織や臓器との間の相互作用を研究するための貴重な方法を表しています。マイクロ流体システムは、神経節と発生中の臓器または組織全体を異なる培養培地で共培養することができるため、ニューロンとその標的との間のクロストークのin...

マイクロ流体共培養装置の使用歯胚神経支配の開発の分析

神経膠芽腫（GBM）の現在のex vivoモデルは、ヒト腫瘍浸潤の生理学的に関連する研究のために最適化されていない。ここでは、我々は、新鮮なヒトGBM組織からの器官型スライス培養物の生成および維持のためのプロトコールを提示する。経時顕微鏡法および定量的細胞移動分析技術の説明が提供される。...

腫瘍細胞移動の研究および抗浸潤性薬物の患者特異的効果の研究のためのヒト神経膠芽腫の器官型スライス培養モデル

世代、栽培、マウス肺腫瘍由来の切片スライスの系統的解析の手段します。我々...

診断テストのための前提条件として外植体腫瘍スライスの樹立と解析

成人の人間の脳から自由に浮遊するスライス培養を準備するプロトコルが提示される。このプロトコルは、膜挿入物を用いた広く用いられているスライス培養法のバリエーションである。これは、シンプルで費用対効果が高く、年齢に関連する脳疾患の背後にある神経変性のメカニズムを解明することを目的とした短期アッセイを実行するために推奨されます。...

成人人間の脳からの短期自由浮遊スライス培養

トロウェル型臓器培養法は、歯の発達を支配する複雑なシグナル伝達ネットワークを解明するために使用され、最近では、継続的に成長するマウス切歯の幹細胞に関与する調節を研究するために使用されています。蛍光レポーター動物モデルとライブイメージング法は、歯科幹細胞とその特定のニッチ微小環境の詳細な分析を容易にします。...

歯科幹細胞の制御を研究するためのトロウェル型臓器培養の使用

Ex Vivo Live Imagingを用いたマウス歯の再生中の細胞分裂と動きの調査

学ぶ 胎生マウスの下顎をスライス培養し、歯胚の発生を数日間観察する方法。系譜追跡により細胞動態を可視化し、従来の外植片培養では困難な組織環境での歯の発生過程をリアルタイムで解析できます。

外植片培養での歯胚の開発に続いてのためのスライス培養法

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