実験的自己免疫性脳脊髄炎の成体マウスにおけるガラス脊髄窓の埋め込み
2013年12月21日
実験的自己免疫性脳脊髄炎を研究するために、成体マウスの露出した脊髄にガラス窓を埋め込み、維持する方法を説明します。これらのウィンドウは、2光子顕微鏡を使用して生きた動物の細胞内レベルで細胞動態を監視するための脊髄への慢性的な光学アクセスを提供します。
この手順の全体的な目標は、脊髄と成体マウスのウィンドウビューを作成して、縦断的な生体内 2 光子顕微鏡法による実験的自己免疫性脳脊髄炎を研究することです。これは、最初に手術と画像撮影のために椎骨を支える脊椎クランプを埋め込むことによって達成されます。次のステップは、脊髄を露出させ、ガラス窓を支えるための椎骨の横方向の縁を準備することです。
これに続いて、窓と硬膜の間にシリコーンエラストマーの薄い層を窓に埋め込みます。移植後数週間の最終ステップは、移植されたマウスにEAEを誘導することです。最終的に、結果は、2光子顕微鏡を使用して、EAEマウスの脊髄における細胞分布と細胞相互作用の時空間的変化を示すことができます。
この手法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。この方法は時間に敏感で、高度な精度が必要なため、習得が難しい場合があります。手術ごとに成体マウスに麻酔をかけ、目の軟膏を剃ることから始めます。
背中は幅約2センチ、長さ5センチで、胸部のこぶを中心に、露出した皮膚をヨウ素石鹸で洗浄し、続いてヨウ素溶液で洗浄しました。ティッシュハサミを使用して、背側の皮膚をT11からLの1に対して縦に約2センチメートル切ります。次に、メスを使用して、T 11からLの棘突起と横突起の間に両側の縦切開を行います。
最初に右上の脊椎フォークを所定の位置に固定して、マウスを脊椎フォーク定位固定装置に吊り下げます。次に、アジン鉗子を使用してT11をつかみ、同じ手順を使用してT11横突起を固定脊椎フォークの上に配置します 脊椎フォーク内の位置L1。次に、23番のメスを使用して、レモネードがはっきりと見えるように、T11からL1までの棘突起と横突起の間の筋肉をそっとこすり落とします。
T 11の茎をよりよく見るには、横突起の先端から突出している腱を切断します。修正したステープルを補充されたPBSですすいでください。次に、ステープルの先端をT11とLの椎弓根の外側に挿入します。
先端間の距離を調整して、茎の接着剤に軽く触れるようにし、各挿入ポイントにシアノアクリレートを少し滴下してステープルを所定の位置に置き、マウスを脊椎フォークから取り外します。次に、シアノアクリレートの薄い層を皮膚の切り口と、きれいになった椎骨の周りの露出した筋肉に塗布します。椎骨を接着しないように注意してください。
改造したペーパークリップの先端を曲げて、埋め込まれたステープルの突出部分の下に入り、孤立した脊柱の長軸と平行に静止してこの位置から離れます。皮膚筋の界面から始めて、露出した椎骨を除く開口部全体を覆うように歯科用セメントのいくつかの層を塗布し、ペーパークリップを歯科用セメント内にしっかりと埋め込むように注意します。5〜15分後、歯科用セメントは硬化します。
次に、ペーパークリップの露出部分をしっかりとつかむことができるデバイスにマウスを取り付けます。クリップやチャンバーにストレスを与えることなく。鉗子を使用して、棘突起と露出した椎骨のラミネートの間の筋肉やその他の軟部組織を切除します。次に骨除去ドリルを使用し、次にT12とT13のラミネートを両側に使用します。
次に、背骨の除去に進みます。鈍い鉗子で棘突起をつかみ、脊髄に向かって下向きの力を加えないように注意しながら持ち上げます。骨がなかなか抜けない場合は、椎弓板を薄くし続けて背骨が加工され、簡単に取り除くことができます。
骨除去ドリルを使用して、椎骨の横方向のエッジを形作り続け、支持構造を形成します。窓用。硬膜に触れている小さな骨片をすべてそっと取り除きます。
鈍い鉗子を使用して、硬膜の湿度を維持するようにしてください。PBSを使用して、椎弓切除口よりわずかに幅の広い準備された窓の1つを選択し、露出した骨にどれだけうまく載っているかをテストします。理想的には、窓の中央が硬膜に接触するように、窓は両側に両側に載ります。
ただし、ウィンドウを脊髄に向かって押す場合でも、ウィンドウが脊髄を圧迫してはなりません。窓が不均衡であるか、硬膜より上にある場合は、椎骨の横方向の縁をさらに形作ります。椎弓切除術に満足したら、硬膜の乾燥を防ぐためにPBSに浸したティッシュペーパーの小片を脊髄に置き、マウスを脇に置きます。
窓を洗浄液に数秒間浸します。次に、顕微鏡のレンズティッシュを使用して、手術用顕微鏡で窓を拭いて乾かします。ウィンドウがクリーンであることを確認します。
それ以外の場合は、クリーニングプロセスを繰り返します。次に、窓を埋め込む準備ができている清潔な場所に保ちます。シリコーンエラストマーを脊髄に塗布し、その後に窓を配置するには、迅速に、理想的には15秒未満で行う必要があります。
すべての資料に簡単にアクセスできるようにワークスペースを配置することは非常に重要です。まず、マウスでティッシュペーパーをはがし、鈍い鉗子を使用して硬膜から破片をそっと取り除き、硬膜が少しべたつくまで乾かします。次に、シリコンミキサーチューブを摂氏27度未満のシリコンですばやく満たし、気泡が出なくなるまでシリコンをきれいなスライドに押し出します。
次に、露出した脊髄の正中線に沿ってシリコンの小さなビーズをすぐに投与します。鈍い鉗子を使用してきれいな窓を拾い上げ、シリコンの上に置きます。鉗子を使用します。
窓に少量の圧力を加えて、シリコンが窓の端に広がり、約1分間所定の位置に保持します。窓からゆっくりと圧力を解放します。圧力が解放されたときにウィンドウが上昇する場合は、ウィンドウに圧力をかけ続けて所定の位置に保持します。
次に、シアノアクリレート、吻側、窓のコドルを塗ります。つまようじを使用し、必要に応じてシアノアクリレートを端に導きます。次に、接着剤を窓の横方向の端に沿ってガイドして、周囲のすべての筋肉を覆います。
窓の外縁だけを覆うと、光学的な透明度が損なわれます。接着剤が不十分な場合、シリコーンと窓の間に気泡が発生し、シアノアクリレートを保護し、チャンバーの構造的完全性を高めます。シアノアクリレートで覆われたすべての領域に歯科用セメントを塗布します。
シアノアクリレートと同様に、吻側と寄りかき側の端から始めて、窓の端に沿って歯科用セメントを導きます。まず、デキサメタゾンとリルを骨盤領域に2日おきに10日間注射します。デキサメタゾンとリルを注射して、移植された窓を持つマウスを注射します。
まず、誘導室でイソフッ素で軽く鎮静します。窓を埋め込んだマウスを首筋にして画像を撮影したり、マウスに軽く麻酔をかけたり、埋め込み型ペーパークリップの露出部分でクリップホルダーにしっかりと取り付けたりしないでください。ほとんどのウィンドウはEAE導入時にクリアであり、EAEの進行全体を通してクリアなままです。
2光子イメージングは、36日間で最大12回実現可能でした。移植窓のある動物と移植されていない動物でEAEの臨床進行を比較したところ、EAEマウスでは臨床徴候の発症がわずかに遅れていました。しかし、発症後、全体的な進行やピーク臨床スコアに差はありませんでした。
EAEに代表される軸索変性のタイムラインを、生体内2光子顕微鏡法により、EAEの進行過程における脊髄で調べた。損傷していない軸索や、局所的な腫れを伴う軸索など、変性のさまざまな段階にある軸索が多数ありました。断片化された軸索も観察されました。
臨床徴候の発症に対する複数の時点での無傷の軸索の平均数を5つでカウントした。マウスカウントは、関心領域内の血管マーカーに配向することにより、セッションごとに同じ領域内で行われました。焦点が腫れている軸索の数は、断片化された軸索と同様に定量化されました。
EAEの臨床徴候の発症に伴って軸索の損傷数が増加し、その後、軸索の悪化は腫脹から断片化へと進行した。ポイント 一度マスターすれば、窓の埋め込み手術はきちんと行えば1時間半ほどで完了します。そこで、今日の手術について注意すべき点がいくつかあります。
まず、窓の移植中に中心静脈が少し圧迫されました。これは、軸索の損傷が発生する前に許容される最大圧縮量であると私が考えるものです。次に、配置後のクイックシールの窓の下にいくつかの気泡がありました。
これらの気泡のうちのいくつかは球形でクイックシールの内側にあり、一方、1つは細菌の外側とクイックシールの間に位置していました。約15分後。この2つ目の気泡は吸収され、実際にはイメージングに全く影響を与えません。
他の2つの泡は視野内で吻側と甘えん坊だったので、これら2つの場所の間にも非常に良い画像を得ることができます。
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概要
この記事では、成体のマウスの露出した脊髄上にガラス窓を埋め込むことで、実験的自己免疫性脳脊髄炎（EAE）を研究する方法について説明します。この技術により、二光子顕微鏡を用いて亜細胞レベルでの細胞ダイナミクスを監視するための慢性的な光学アクセスが可能になります。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 免疫学
- 顕微鏡学
背景
- 実験的自己免疫性脳脊髄炎は、多発性硬化症を研究するためのモデルです。
- 二光子顕微鏡は、生体組織の高解像度イメージングを可能にします。
- 慢性的イメージング技術は、疾患の進行を理解するために不可欠です。
- ガラス窓は、細胞間相互作用の長期観察を容易にします。
研究の目的
- 成体のマウスの脊髄のウィンドウビューを作成する。
- 縦断的イメージングを通じてEAEのダイナミクスを研究する。
- 細胞分布と相互作用の時空間的変化を観察する。
使用された方法
- 椎骨を支える脊髄クランプの埋め込み。
- 脊髄の露出と椎骨の縁の準備。
- シリコーンエラストマーを用いたガラス窓の埋め込み。
- 埋め込み数週間後にEAEの誘導。
主な結果
- 脊髄ダイナミクスの慢性的イメージングの成功。
- EAE影響下のマウスにおける細胞相互作用の観察。
- 自己免疫反応の進行に関する洞察。
- 生体イメージングにおける二光子顕微鏡の有用性の実証。
結論
- この方法はEAEを研究するための貴重なツールを提供します。
- 慢性的な光学アクセスにより細胞挙動の理解が深まります。
- 二光子顕微鏡は生体における縦断的研究に効果的です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables chronic intravital imaging of spinal cord pathology in a clinically relevant EAE model, providing biopharma researchers with a tool to longitudinally monitor cellular dynamics and therapeutic target engagement at subcellular resolution. By allowing repeated imaging sessions over extended periods, the method supports mechanistic de-risking of immunomodulatory candidates and improves predictive confidence in preclinical efficacy assessments. The approach aligns with discovery-stage needs for reproducible, quantitative readouts that inform go/no-go decisions in autoimmune disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct observation of axonal degeneration and immune cell recruitment dynamics to validate therapeutic targets in autoimmune pathways.
- Operational Value: Provides a reproducible surgical preparation for consistent baseline measurements across study cohorts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative axonal integrity metrics (e.g., swellings, fragmentation) suitable for high-content screening of compound libraries.
- Operational Value: Standardized window implantation reduces variability in imaging depth and optical clarity, supporting assay robustness.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates correlation of early axonal damage with clinical EAE onset, supporting biomarker qualification efforts.
- Operational Value: Chronic access enables longitudinal pharmacodynamic profiling of immunomodulators in the same animal, reducing cohort size requirements.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum by providing functional validation data after target identification but prior to lead optimization, allowing teams to de-risk mechanisms using disease-relevant pathophysiology.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of neuroimmune interactions through direct visualization of cellular interactions in the spinal cord parenchyma.
- Screening: Delivers quantitative, subcellular-resolution readouts on axonal health that enable comparison across treatment conditions.
- Analytics: Outputs include axonal swelling counts, fragmentation indices, and spatial distribution maps that inform dose-response modeling.
- Translational Research: Connects early axonal pathology to clinical disability progression, aligning with translational biomarker strategies in neuroinflammatory diseases.
- Enterprise Reuse: The implanted window platform can be reused across multiple imaging sessions and adapted for different disease models requiring spinal cord access.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in autoimmune CNS disorders by providing direct evidence of target-mediated axonal protection or injury.
- Operational Value: Standardized surgical and postoperative protocols enhance reproducibility across sites and operators in multicenter preclinical studies.
- Strategic Value: Enables earlier detection of target engagement signals, improving capital efficiency by reducing investment in biologically inactive candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying compounds that modify axonal degeneration trajectories before peak clinical symptoms.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgery, anesthesia management, and postoperative care for chronic window maintenance.
- Dependent on two-photon microscopy infrastructure, sterile surgical fields, and temperature-controlled silicone application.
- Necessitates cross-functional standardization between surgery, imaging, and animal care teams to ensure consistent window integrity.
- Adaptation considerations include adjusting vertebral exposure levels for different spinal cord regions or disease models.
- Practical limitations include surgical complexity, risk of spinal cord compression during implantation, and the need for anti-inflammatory prophylaxis to maintain optical clarity.
