自然送信時に結核マラリア重複感染を研究する実験モデル結核菌とマラリアベルゲイ

この手順の全体的な目標は、in vivo で結核とマラリアの同時感染の影響を調査するために使用できる実験マウスモデルを確立することです。これは、まず実験動物をEMに曝露することによって達成されます。吸入曝露システムを使用した感染性エアロゾル飛沫を含む結核。

第2ステップでは、肺組織のCFU分析により、所望の数のM結核の取り込みを確認します。エアロゾル感染の1日後、40日後、マウスは感染性の蚊にさらされ、マラリア原虫のスポロゾイトが自然に伝染します。これは、血液食中に皮膚全体に沈着します。最終ステップでは、マラリアの血液段階の寄生虫の発生は、ギムサ染色、血液塗抹標本の分析によって監視されます。

最終的には、肺における結核の負担と、共感染動物の血液中の寄生虫の数を列挙して、結核とマラリアの経過をそれぞれ決定できます。この方法は、マラリア原虫との同時感染が結核菌感染の病因と制御にどのように影響するかなど、結核、マラリアの重複感染の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。このプロトコルは、オジウムブリとの同時感染が免疫適格なC 57 PL 6マウスである結核微生物の慢性期にどのように影響するかを調査するために開発されました。

また、ノックアウトマウスを含む他のマウス系統に適用したり、他のマイコバクテリウムまたはオジウム種と一緒に使用したりすることもできます。結核菌を温めることから始めます。既知のCFU力価のストック。

細胞が融解したら、27ゲージの針が取り付けられた1ミリリットルの注射器を使用して、懸濁液を5回慎重に混合して細菌の塊を分散させ、エアロゾルの生成を避け、所望の感染用量に応じて、必要な量のマイコバクテリアストックを滅菌PBSを含む50ミリリットルのチューブに移し、最終容量の6ミリリットルにします。次に、実験動物を個々に仕切り分けられたメッシュバスケットに入れます。バスケットを円形のエアゾールチャンバーに入れ、チャンバーの蓋を閉めます。

ベンチュリネブライザーユニットを3つのステンレス鋼ソケットジョイントに取り付けます。マイコバクテリア懸濁液を10ミリリットルのシリンジに吸引し、18ゲージの鈍い針を取り付け、シリンジを密閉された輸送ボックス内のエアロゾルチャンバーに運びます。次に、ネブライザースクリューキャップを取り外し、マイコバクテリア懸濁液をユニットに慎重に注入します。

エアロゾルの発生にご注意ください。シリンジを2%バートンが入った鋭利物容器に廃棄し、ネブライザーを密封します。.サイクルが完了したら、吸入装置を運転します。

エアロゾルチャンバーを開く前に、マイコバクテリア懸濁液が完全に噴霧されていることを確認してください。電動空気清浄マスクヘルメットを装着し、動物をケージに戻し、エアロゾル感染の1日後にネブライザーバスケットとエアロゾルチャンバー内を滅菌し、クラス2のバイオセーフティキャビネット内の解剖板上の吸収紙に指定された安楽死した制御動物を置き、マウスごとに70%エタノールでマウスを消毒します。まず、腹部の中央に小さな切開を行い、次に動物の頭の上の皮膚を引っ込めます。

次に、手術用ハサミを使用して腹部と胸郭を開きます。肺にアクセスできるように胸壁を取り外してから、肺を取り除きます。肺を2ミリリットルの均質化緩衝液を備えた15ミリリットルのチューブに移し、次に5ミリリットルの注射器のプランジャーを使用して、100マイクロメートルのふるいを通して組織を小さなペトリ皿に濾します。

バリアチップを備えた1ミリリットルのピペットを使用して、ふるいを数回洗い流し、約250マイクロリットルの肺ホモジネートを8つの寒天プレートに分配します。使い捨てのスプレッダーを使用して、プレートが乾いたらサンプルを慎重にプレートします。各プレートをパーフィルで密封します。

それらをアルミホイルで包み、摂氏37度で少なくとも4週間直立させてインキュベートします。ナイーブマウスまたはマイコバクテリウムに感染したマウスに蚊に刺されてマラリアに感染させるには、麻酔をかけた動物を蚊かごのネットに置き、感染性の蚊が膜を介して餌を供給できるようにして、スポロゾイトの感染を確実にします。マウスをケージに10〜15分間放置します。

マウスをペーパータオルの上にケージに戻し、ペーパータオルで覆って、麻酔から目覚めるまで暖かく保ちます。ケージのネットを通して70%エタノールまたは他の消毒剤を蚊に噴霧して蚊を殺し、ケージをオートクレーブしてケージを滅菌します。パラを監視するには、針を使用して各感染動物の静脈の最後を穿刺し、1滴の血液を採取します。

スライドガラスの両端で、別のスライドを使用して、下部スライドの長さの半分に1滴の血液を引っ張ります。次に、スプレッドスライドを裏返し、もう一方の端を2番目の塗抹標本に使用します。スライドを染色ラックに置きます。

血液塗抹標本を絶対メタノールで簡単に固定し、次に風乾します。次にスライドするのは、ギザに汚れを浸します。10分後、脱イオン水で満たされた染色用VEEにスライドを数回浸したり入れたりして、余分な汚れを洗い流します。

最後に、スライドを垂直位置で風乾します。スポロゾイトが蚊に刺されることによる実験動物の感染は、4〜5日後に血液期寄生虫の存在によって確認されるように、100%の感染率をもたらします。表に示されているように、ナイーブ結核に感染したマウスと結核菌に感染したマウスの両方に蚊に刺されることで、実験グループ内のすべての動物に一貫した再現性のある感染が

pre patency と naive Control マウスを、それと結核菌の重複感染動物と比較することにより、pre patency がわずかに遅れていることが観察できます。結核菌に事前に感染したマウスでは、吸入曝露システムの使用により結核菌のマウスでは、個々のマウス間のばらつきが比較的少ない状態で、動物の肺への細菌の沈着が成功しました。感染したC 57ブラックシックスマウスの肺のマイコバクテリア負荷は、p burgaの存在下で増加します。.

対照的に、共感染マウスは、マラリア原虫の単一感染マウスと比較してパラ血症が減少しています。この手順に続いて、フローサイトメトリーPCR Elizaや組織学的手法などの方法を目的の組織または体液に対して実行し、悪性寄生虫や結節基底に対して同時に誘発される免疫応答と、共感染した宿主でのそれらの相互作用を解剖することができます。ヒトの病原体である結核菌の微生物を扱うことは非常に危険であり、感染性エアロゾルへの曝露を常に避けるための対策を講じる必要があることを忘れないでください。

結核菌に関するすべての実験作業は、適切なバイオセーフティレベル3の施設で実施されなければなりません。