cDNAからの組換えニューカッスル病ウイルスのレスキュー

この手順の全体的な目標は、クローニングされたDNAから組換えニューカッスル病ウイルスまたはNDVを救出することです。これは、最初に哺乳類細胞にT7ポリメラーゼをコードするヘルパーウイルスを感染させ、次にそれらの細胞をプラスミドでトランスセクトすることによって達成されます。これは、Tセブンプロモーターの制御下にあるウイルスの最小複製機構をコードします。第2のステップは、トランスフェクションされた哺乳類細胞を、ウイルスの天然宿主である鳥類細胞と共培養することです。

哺乳類細胞から放出された新しく生成されたバリアンは、最初の増幅ラウンドのために鳥類細胞に感染します。次に、共培養の上清を胚化したニワトリの卵に接種して、救助されたウイルスをさらに増殖させ、最終工程として接種した卵からLANトイック液を採取する。最終的には、単純なヘマグルチニンネーションアッセイを使用して、LANトイック液中のNDVの存在とレスキュープロセスの成功を示します。

この方法で救出された組換えウイルスは、感染に影響を与えるさまざまな因子についての洞察を得ることができ、ワクチン接種や抗腫瘍療法のための抗原送達のためのベクターとしても使用できます。トランスフェクションの6ウェルプレートの前日に哺乳類HEP 2または5 49細胞の分割を開始するには、細胞の密度は翌日に80〜90%のコンフルエンスに達する必要があります。レスキューするウイルスごとに、2〜4つの異なるウェルを含めます。

また、コントロールPCA、GFPおよびpiteのための2つの追加ウェルを含み、GFPはトランスフェクションおよびMVATの7つの感染効率をそれぞれ監視することを目的とした。温めたPBS1ミリリットルで細胞を2回洗浄し、培養した哺乳類細胞にMVA T 7ウイルスを1細胞あたり1PFUの複数回の感染で感染させます。PBS中の最終容量200マイクロリットルで、ウイルス感染インキュベーション中に細胞を室温で1時間インキュベートし、脂肪切除術の最適溶液を調製し、5分間予備インキュベートした後、書かれたテキストに記載されているようにトランスフェクションミックスを調製します。

DNAチューブに溶液の250マイクロリットルを注入し、MVAT 7とのインキュベーション後、室温で20〜30分間インキュベートし、吸引によりウイルス接種物を除去し、DNAリポトランスフェクションミックスと交換する。各皿に1ミリリットルのDMEM 10%FBSを追加します。感染したトランスフェクション細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で6〜8時間インキュベー

次に、トランスフェクション培地を1.5ミリリットルの新鮮なDMEM 10%FBSと交換します トランスフェクション後24時間で、蛍光顕微鏡でコントロールウェルを観察し、トランスフェクション効率とT 7ポリメラーゼ活性を評価してから、感染したトランスフェクションされた哺乳動物細胞と鳥の線維芽細胞との共培養を進めます。通常、ニワトリまたはアヒルの胚線維芽細胞のコンフルエントな100ミリメートル組織培養皿が、2つのトランスフェクションウェルごとに使用されます。事前に十分な準備をしてください。

ウイルスの効率的な救助のためのすべての救助の試みごとに鳥類細胞の100ミリメートル組織培養皿。DMEM 10%FBS培地には、5%エラントニック液と30ミリモルの塩化マグネシウムが添加されています。温めた1つのXPBSトリプシンで哺乳類細胞を2回洗浄した後、細胞が剥離するまで0.2ミリリットルのEDTAトリプシンで細胞を観察します。

補充したDMEMの1ミリリットルに細胞を再懸濁し、同じ培地の3ミリリットルで100ミリメートルの組織培養皿に移します。温めた1つのXPBSトリプシンと鳥の細胞を二回洗浄した後、EDTAトリプシンの1ミリリットルで細胞を目に入れ、細胞が離れるまで摂氏37度で1〜2分間インキュベートします。調製した培地を8ミリリットル加えて鳥細胞を再懸濁する。

次いで、4ミリリットルのトリプスインナイズ鳥類細胞を、共培養100ミリメートル組織培養皿中の哺乳動物細胞に添加し、総量8ミリリットルとする。共培養した細胞を100mm皿で静かに振って均一に分布させた後、37°Cのインキュベーターに3〜4日間置きます。卵子は、すべての共培養細胞がMVAT7ウイルス感染による細胞変性効果の影響を受けると感染します。

この時点で、組織培養上清を1ミリリットル取り出し、それをeend DPHチューブ遠心分離機に加えます。ベンチトップ遠心分離機で12, 000 RPMで1分間の組織培養上清。細胞の破片を取り除くには、軽いキャンドリングボックスを使用して卵にキャンドルを当て、気嚢とアラントイック空洞の間の界面を確認します。

血管の局在化を避けるために、インターフェースの境界にマークを付けます。卵に70%エタノールをスプレーして、無菌状態を確立します。マークされた場所の卵殻にそっと穴を開けます。

次に、1ミリリットルの注射器を使用して500マイクロリットルのスナットを接種し、針を垂直に直接アラントイックキャビティに向けます。卵殻の傷を溶かしたワックスまたはパラフィンで密封します。卵を摂氏37度で2〜3日間孵化させます。

感染した卵を2〜4時間または摂氏4度で一晩孵化させて、鶏の胚を殺し、血液を凝固させます。卵に70%エタノールを噴霧して、無菌状態を維持します。卵の頂端部をスプーンで空気空洞の上に慎重に軽くたたきます。

卵の卵殻が割れたら、鉗子で破片を取り除き、LANトニック膜を完全に露出させます。耳鼻咽喉科のトイック膜を鉗子やハサミで切除し、血管やオーク材の損傷を避けて、LANトイック腔を露出させます。ヘラで胚を慎重に押し下げ、10ミリリットルのピペットで上流のLANトニック液を回収します。

卵黄の膜を傷つけないようにしてください。LANトニック液を氷上の15ミリリットルの遠心分離管に移します。1500 RPMで5分間遠心分離することにより、LANトニック液を清澄化します。

ペレットを乱さずに上清を新しいチューブに移します。サンプルを摂氏 4 度で最大 1 週間保存し、Hemagglutinin Nation アッセイで NDV の存在を確認します。感染した卵子からのアラントイック液中のウイルスの存在は、1つのXPBSなどの8つのトルコ赤血球陰性対照サンプルまたは非感染のアラントイック液、および任意のNDVウイルスからのアルトイック液などの陽性対照サンプルを赤血球凝集素の能力によって肉眼的に決定することができますそれを検証するために、常にHAアッセイに含める必要があります。

HAアッセイを行うには、V底96ウェルプレートにウェルあたり1つのXPBSを50マイクロリットル、次にLANトイック液サンプル50マイクロリットルをプレートの最初のカラムのウェルにピペットで移します。プレートの残りの部分で2倍の段階希釈を行い、ウェルから最後の余分な50マイクロリットルを廃棄します。最後のカラムでは、ウェルごとに1つのXPBSに0.5%トルコ赤血球の50マイクロリットルを分注し、軽く叩いてプレートを静かに振る、プレートを摂氏4度で30〜45分間、またはネガティブコントロールウェルで透明なペレットが形成されるまでインキュベー

NDVレスキュー手順の初期ステップ、特にトランスフェクション効率とMVAT 7による感染をモニターできます。PAGs GFPをトランスフェクトした5 49細胞、またはMVAT7に感染し、P8 GFPをトランスフェクトした5 49細胞の代表的な蛍光および明視野画像を構成する。PCAによるGFP発現はトランスフェクション効率の指標であり、P部位によるT 7プロモーター駆動GFP発現はMVAT 7感染およびT 7ポリメラーゼ活性のコントロールです。

画像は、鳥類哺乳類の共培養物および胚卵での増幅ラウンドの後、救助されたウイルスの存在がHAアッセイの陽性ウェルによって検出されるNDVレスキューを成功させるのに十分なトランスフェクションおよびトランスフェクション感染効率を示しています。NDVは赤血球を結合させることで赤血球凝集素を誘導し、赤血球がV字型ウェルの底に沈殿するのを防ぎます。したがって、HA活性の欠如は、ここに示されているように、ネガティブコントロールとレスキューレスキュー後に得られた3つの未知のサンプルからの1つの陰性結果で示されているように、赤血球の赤い丸いペレットの形成によって容易に区別できる。

このビデオを見れば、CDNAから組換えニューカッスル病ウイルスを高い再現性で救出する方法を十分に理解できるはずです。