非複製イヌアデノウイルス2型由来ベクターの作製と精製

この手順の全体的な目標は、イヌのアデノウイルス2型由来ベクターを構築、製造、精製することです。これは、まず目的の遺伝子をシャトルプラスミドにクローニングすることによって達成されます。第2のステップは、相同組換えによって組換えゲノムプラスミドを得ることです。

次に、組換え欠損仔牛に、トランス相補細胞株で2つのウイルスを作製・増幅した。最後のステップは、得られた組換えウイルスを精製し、in vivoおよびin vitroでさまざまな用途に濃縮することです。最終的に、免疫蛍光共焦点顕微鏡法を使用して、げっ歯類の脳におけるウイルス形質導入の例を示します。

これらの技術が、ヒトの神経症に由来するベクターなどの既存の方法よりも優れている点は、ヒト集団には子牛2種に対する既存の免疫が存在しないことです。したがって、この方法は、特定の脳領域で発現するタンパク質の役割を評価するなど、ワクチン接種や遺伝子治療の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。したがって、この手順を示すのは、KYとCorin Bergeronです。

私たちの研究室の2人のポスドク研究者 トランスフェクションの1日前に、DKE 1つの細胞を6つのウェルプレートに播種することにより、この手順を準備します 摂氏37度と5%CO2で細胞を増殖させます 7%の熱を含む高グルコース、不活化子牛、血清ナトリウム、ピルビン酸、ペニシリン、およびストレプトマイシン。翌日、細胞は、プラスミドの非ウイルス配列を放出するために、2マイクログラムのpcal GOIを組換えcav 2ゲノムプラスミドとASC1でトランスフェクション消化するために70〜80%confluentであるべきであり、0.8%Agro gel電気泳動消化によって結果として生じる制限パターンを確認すると、組換えゲノムを含む約31キロベースペアのフラグメントとプラスミドバックボーンに対応する2キロベースペアのフラグメントが得られるはずです。消化したDNAを200マイクロリットルのジェットプライムバッファーと混合し、10秒間ボルテックスします。

4マイクロリットルのジェットプライムを加え、10秒間ボルテックスして混合します。短時間回転させて液滴を除去し、10分間インキュベートします。室温で、トランスフェクションミックスをDKE one細胞に滴下します。

プレートを静かに振って混合物を均等に分配し、摂氏37度でインキュベートします。トランスフェクションの1週間後、細胞と培地を15ミリリットルのポリプロピレンチューブに集めます。細胞を3回の凍結思考サイクルで破壊します。

1、800回G.Collectの上清を10分間遠心分離し、その後のウイルスの伝播のためにマイナス20で保存し、ウイルスがDKEの80〜90%のコンフルエント単層に感染するウイルスを伝播するために、上清を含むウイルスの0.5ミリリットルを含む6ウェルプレートの1つのウェルで成長した細胞。37°Cで1時間、軽度の攪拌下で1時間インキュベートします。接種物を取り外し、5%の熱不活化FCSを含む1.5ミリリットルの完全なDMEMと交換し、細胞を摂氏37度で3〜4日間インキュベートします。

細胞は、細胞変性効果またはCPEの出現について毎日監視する必要があります。明確なCPEが表示されない場合。培養の4日後に細胞を回収し、透明なCPEが細胞の大部分に影響を与えるときにウイルス増幅を繰り返します。

通常、ウイルス増幅ラウンドを2〜4回行った後、培養液で細胞を採取し、前述のように3回凍結融解します。80〜90%のコンフルエントに感染します。直径10cmの組織培養皿3個で増殖させたDKE1細胞は、CPEが完成する3〜4日後に、1皿あたり1.5ミリリットルのウイルス含有上清を用いて培養します。

これらの直径10センチメートルの皿から細胞を採取し、3つのフリースタイルサイクルでそれらを破壊し、10分間の遠心分離によって溶解物を1,800回透明にします。Gは上清を収集し、大規模なCav 2増幅のためにマイナス20で保存し、スケールアップ手順を開始するには、DKEの80〜90%のコンフルエント単層を感染させ、直径10センチメートルの組織培養皿40で増殖した1つの細胞を各皿に使用し、FCSなしで1ミリリットルの完全DMEMで希釈したウイルス含有上清0.1ミリリットルを使用し、穏やかな攪拌下で37°Cで細胞をインキュベートします。3〜4時間後、5%FCSを添加した5ミリリットルの完全DMEMを加え、3日間インキュベートします。

3日後、50ミリリットルのポリプロピレンチューブで40 10センチメートルの皿から感染細胞を採取し、細胞を1、200倍Gで摂氏4度で10分間ペレット化する。Resusは、15ミリリットルのDMEM培地にそれらを懸濁し、細胞を3回の凍結融解サイクルで破壊します。1, 800倍Gで10分間遠心分離することにより、細胞の破片を除去します。

ウイルス粒子の精製のために、ウイルス粒子の精製前に上清をマイナス20度で保存してください。14 mL UltraClear チューブに不連続な塩化セシウムグラジエントを調製します。まず、2ミリリットルの高密度塩化セシウム溶液をチューブの底に注ぎます。

次に、最初の溶液の上に2ミリリットルの低密度塩化セシウム溶液をゆっくりと加えます。塩化セシウムの勾配の上にウイルス上清を慎重にロードします。遠心分離後130,000倍g、摂氏18度で1時間30分、スイングSW 40ローターで上部遠心分離機から最大2〜3ミリメートルの鉱物油をチューブに充填します。

2つの塩化セシウム溶液層間の界面に2つの白い帯がはっきりと見えます。21ゲージの針と注射器を使用して、成熟したcav 2つの粒子を含む下部バンドを横から穿刺します。空のウイルス粒子に対応する上部のバンドを収集しないように、できるだけしてください。

14ミリリットルの透明チューブに、集合的なウイルス粒子を塩化セシウム溶液と混合することにより、連続的な塩化セシウムグラジエントを調製します。上部遠心分離機から最大2〜3ミリメートルのところに、スイングSW 40ローターで130,000倍のGと18度で18時間、チューブに鉱油を充填します。遠心分離後、前に示したように、バンドバイサイドの穿刺が入っている白い子牛2頭をシリンジで回収します。

繰り返しになりますが、残りのアッパーバンドを収集しないようにしてください。これは、2つのバンドをより適切に分離するこの連続的なグラデーションでより簡単になるはずです。収集された懸濁液の総量は2ミリリットルを超えてはなりません。

次に、cidex G 25 PD 10 カラムを 30 ミリリットルの PBS で平衡化します。ウイルス懸濁液をカラムにロードし、500 μLのPBSフラクションで溶出する流れを廃棄し、通常は脱塩されたキャブ2粒子を含むフラクション5〜7を収集します。フラクションを含むウイルスは、祝福された香りがあるため、簡単に特定できます。

最後に、1.5ミリリットルのCAV 2懸濁液に150マイクロリットルのグリセロールを加え、Eloquaでマイナス80°Cで保存し、Cav 2を最終点希釈で滴定し、精製ウイルスのアリコートを氷上で解凍し、無血清DMEMで10からマイナス2から10からマイナス12までの範囲で10倍の段階希釈を行います。96ウェルプレートの5つのウェルに各ウイルス希釈液50マイクロリットルを加え、4番目のDKEに1.5倍10を加え、各ウェルに1細胞ずつプレートをインキュベートし、5日目に5日間、摂氏37度および5%CO2でプレートをインキュベートする。感染後のモニターCPEの外観は、顕微鏡観察によって行われます。

感染力価は、ウイルスベクターを作製する前に、read and men統計法を用いて組織培養感染量の中央値として決定されます。導入遺伝子の発現カセットを持つ組換えCAV 2ゲノムは、標準的な分子生物学的手法を使用して構築されます。まず、目的の遺伝子を、サイトメガロウイルス初期プロモーターとポリアデニル化シグナルを備えた発現カセットとしてシャトルプラスミドにクローニングし、上流および下流の組換え標的配列を表す2つのCAV由来ゲノム配列に隣接する

第2のステップでは、発現カセットをシャトルプラスミドから相同組換えによりCAV 2ゲノムに挿入します。GOI発現カセットの挿入は、組換えゲノムのEAおよびE one B遺伝子の一部の欠失につながります。組換えゲノムプラスミドが得られたら、ウイルス粒子はCAV two E one、complementing DKE one cellsを使用して産生されます。

感染細胞で産生される大量のウイルス粒子による明らかな細胞変性効果は、明視野顕微鏡または導入遺伝子発現によって容易に視覚化できます。この例では、CAV 2 ベクトルを A GFP で表現しています。新鮮なDKE one細胞を用いて数回のウイルス増幅ラウンドを行った後、ウイルス粒子を塩化セシウムグラジエント上で超遠心分離することにより精製します。

濃縮されたウイルス粒子は、セシウム勾配内に2つの乳白色のバンドとして現れます。下のバンドは、収集すべき成熟組換えCav 2に対応します。上部のバンドには空の非感染性粒子が含まれていますが、これは避ける必要があります。

得られた組換え子牛2ベクターは、in vitroまたはin vivoのいずれかで、さまざまな種のほぼすべての細胞タイプの形質導入に使用できます。ここでは、CAV 2を発現するGFPをマウスの中枢神経系の異なる領域にステレオタキシーで注入した応用例を示します。このプロトコルは高力価で純粋で純粋なウイルスストックをもたらすため、歯状回またはDGにCAV 2ベクターを発現するPBS希釈GFPをわずか1マイクロリットルで注入すると、40〜50%のニューロン形質導入がもたらされます。

さらに、線条体中のCAV 2ベクトルを発現するPBS希釈GFPの2マイクロリットルの軸索注射で逆行性輸送されるC 2の能力により、亜細胞の黒線条AALニューロンのほぼ80%の形質導入が可能になり、黒粒子はその開発後に圧縮されます。これらの技術は、ワクチン学や神経科学の分野の研究者が、多くの多様な動物モデルで脳内の新しい抗原と遺伝子機能を探索するための道を開きます。したがって、CAFの2つの派生ベクターでの作業は、適切な封じ込めや廃棄物処理対策、個人用保護具を含む廃棄物処理、BSLの層流フードでの作業など、非常に危険で慎重であることを忘れないでください。