Caenorhabditis elegansをモデル系として使用して、多細胞生物におけるタンパク質恒常性を研究する
2013年12月18日
タンパク質の恒常性、ストレス、老化の関係を研究するために、遺伝的に扱いやすい後生動物Caenorhabditis elegansをモデルシステムとして、タンパク質の機能不全、細胞内のタンパク質局在、生物、細胞、タンパク質レベルでのタンパク質安定性を追跡して、タンパク質のフォールディングの変化を監視しました。
遺伝的に扱いやすい後生動物CENO R eleganceにおける以下の実験の全体的な目標は、生物、細胞、およびタンパク質の3つのレベルでタンパク質のミスフォールディングを監視することです。運動性や耐熱性などの行動表現型は、生物レベルでのタンパク質恒常性の変化、温度感受性の変化、または自然に発生する変化の読み出しとして機能します。メタ安定タンパク質は、タンパク質のミスフォールディングに関連する可能性のあるタンパク質のミスローカリゼーションを追跡するために使用されます。
ex vivo パーシャル消化アッセイは、タンパク質の安定性を直接モニターします。結果は、耐熱性アッセイ、免疫蛍光顕微鏡法、およびウェスタン血液分析に基づいて、さまざまな培養温度でのタンパク質スタッシス能力の変化を示すことができます。これらの手順は、私の研究室の大学院生に実演していただきます。
行動アッセイは ish ido によって実証され、Shai は免疫染色を実演し、ANA flunking と sheron は部分消化を実演します。温度耐性を測定するためのこのプロトコルには、動物を同期させるための準備手順と運動アッセイが伴います。両方とも、テキストプロトコルで説明されており、少なくとも20匹の同期した動物を含む複製を収集することから始まります。
24では、450マイクロリットルのヒートショックバッファーが入ったウェルをよく遊ばせました。各ウェルに9マイクロリットルのサイトキシンを補充します。次に、プレートを温浴に移します。
熱ショック、温度、持続時間は、成長条件に大きく依存します。特に、培養温度は、動物の死の取り込みを監視することにより、動物の生存をスコアリングします。蛍光ステレオスコープとTXRフィルターを使用すると、ダイを占有する動物は死んでいます。
kineのような既存の方法のこの手法の主な利点は、手動採点による耐性は、動物の死亡率の視覚的読み出しの使用であり、これによりこのエッセイははるかに速く、より再現性があります。必要な段階で、少なくとも30匹の動物をM nineバッファーの入ったマイクロ遠心チューブに移します。短い低速遠心分離ステップを実行し、ResusがMナインで動物を懸濁することにより、動物をMナインで数回洗浄します。
次に、チューブを氷の上に数分間置き、冷まします。冷却したら、余分な液体を取り除き、チューブをインキュベートします。氷冷の500マイクロリットルで、4%PARAFORMアルデヒド。
インキュベーション時間は、検査したタンパク質ごとにキャリブレーションする必要があり、室温で約5〜30分である必要があります。次に、固定した動物をPBSトゥイーンでpH 7.2の遠心分離により3回洗浄します。遠心分離は、特に指定がない限り、常に3000 RPMで1分または2分間行われます。
フード内で、上清の大部分を取り除き、ペレットを1ミリリットルのビームメルカプトエタノール溶液に再懸濁します。次に、動物を摂氏37度で一晩孵化させ、翌日フードで穏やかに揺らします。動物をPBSTで遠心分離機とResusで3回洗浄します。
50〜100マイクロリットルのPBSTで洗浄を終了し、別の遠心分離後にこのPBSTの大部分を取り除きます。次に、100〜150マイクロリットルのコラゲナーゼ溶液を加え、動物を摂氏37度で強く攪拌しながらインキュベートします。サーモミキサーまたは振とうインキュベーターを使用してください。
5分後、実体顕微鏡で定期的なチェックを開始します。動物の5分の1が壊れたら、チューブを氷の上に置いて反応を止めます。このステップは非常に敏感です。
治療期間は固定条件によって異なり、菌株によって大きく異なります。孵化が長引くと、動物が完全に劣化する可能性があります。各酵素バッチの前に条件を較正し、分解を注意深く監視する必要があります。
次に、PBSTで動物を2回洗います。遠心分離機で動物を回収し、PBSTの大部分を取り除きます。次に、BA溶液1ミリリットルを加え、室温で1時間穏やかに振とうとインキュベートし、遠心分離により動物を回収し、200マイクロリットルのbに再懸濁します。
これらのパラメータはキャリブレーションする必要があります。次に、動物を遠心分離機で洗浄します。それらをb、Aのミリリットルに再懸濁し、室温で15分から1時間穏やかに混合してインキュベー
トします。この時点で、オプションで蛍光色素を添加することができます。次に、BA緩衝液の洗浄をさらに3回繰り返し、適切な蛍光標識二次抗体を100マイクロリットルのBAに懸濁してResusによる洗浄を1〜100希釈で終了する。試料を室温で数時間揺さぶりながらインキュベートし、光から保護して二次試料を透明にします。
a、b、aで3回洗います。次に、最初にResusで動物をスライドにマウントし、10マイクロリットルのb、aに懸濁し、次にワイドボアピペットを使用してサンプルの1つまたは2マイクロリットルを各スライドに移し、等量のマウント媒体を追加し、スライドを覆います。スライドをマニキュアでやさしく密封します。
スライドはマイナス20°Cで長期間保管できます。一般に、このプロトコルを初めて使用する人は、プロトコルが長く、効率に影響を与える可能性のある多くの手順が含まれているため、トラブルシューティングが困難になるため、苦労します。約1560ミリメートルのプレートから動物を1ミリリットルまたは2ミリリットルのMナインバッファーに集めることから始めます。
動物は過密であってはなりません。動物を遠心分離機でMナインバッファーで数回洗浄し、動物を懸濁させます。最後の回転の後、resusはM nine緩衝液の100マイクロリットルの動物を中断する。
次に、動物を急速冷凍し、冷やした乳棒とドリルを使用して、氷の上でサンプルを粉砕します。動物が十分に地面に残っているかどうかを確認するために、頻繁に一時停止します。動物が完全に粉砕されたら、ワーム抽出物の量を見積もります。
次に、等量の2 x worm溶解溶液を加え、サンプルを氷上で15分間インキュベートします。次に、冷却された遠心分離サイクルによって破片を取り除き、上清をきれいなマイクロフュージチューブに移します。Bradfordアッセイ後、サンプルを1ミリリットルあたり3〜3.5ミリグラムのタンパク質に希釈します。
次に、新たに調製した冷やしたカモトリプシン溶液を1対1200の比率で加えます。この時点で、サンプルを1時間インキュベートするように設定します。インキュベーション中は、定期的に20マイクロリットルのアリコートを取り、すぐにSDSバッファーと混合し、続いて摂氏96度で5分間混合します。
サンプルを使い果たし、その後、ウェスタン血液分析を行って、タンパク質の相対的な安定性を決定します。この手順を試みる際には、消化サンプルにプロテアーゼ阻害剤カクテルを追加せず、代わりにサンプルを氷上にすばやく保存することを覚えておくことが重要です。45の筋シャペロンにおけるE 781 K ts変異は、ミオシンの折り畳みと組み立てに強く影響し、したがって動物の運動性に影響を与える。
これらの突然変異体を摂氏20度を超える温度で育てたとき、摂氏15度では麻痺しませんでしたが、完全に麻痺しました。摂氏25度で飼育された野生型の動物が長時間の熱ショックを受けたとき、ほとんどの動物が生き残った。熱ショック応答の効果的な修飾子を監視するために摂氏15度から20度で飼育した場合、生存率はわずか30%でしたが、制御ストレス条件は野生型動物の生存率70%に上昇しました。
動物は摂氏37度の熱ショックに6時間さらされました。成人期の初日に、生存率はcytオレンジ取り込みアッセイによってアッセイされました。死んだ動物は白い矢印で、生きている動物は黄色の矢印で示されます。
いくつかのメタ安定タンパク質の局在を、特異的抗体を用いて可視化しました。例えば、パラミンtsは、制限条件下では筋筋節ではなく多結晶集合体に局在する。同様に、ミオシンTSは、制限された温度で高度に秩序化されたフィラメント構造の代わりに無秩序なフィラメントを形成します。
myo threeと共発現する種々のTS変異タンパク質を発現する動物。GFPは、ミオシンのGFPの変化を監視することによって検出されるように、筋細胞の折り畳み能力の変化を反映している可能性があることを確認し、ミオフィラメント組織の急速な悪化を示しました。UNC 45 Tsと共発現するミオシン重鎖のタンパク質分解性断片化パターンは、野生型動物由来のミオシンの消化プロファイルと比較して明確な特性を示しており、ミオシンフォールディングがUNC 45の影響を受けているという主張を裏付けています。
機能の喪失。この方法は、シーエレガンスにおけるプロテオスタシスの調節に関する洞察を提供することができますが、さまざまなモデル生物などの他のシステムにも適用できます。
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概要
この研究は、モデル生物である線虫Caenorhabditis elegansを用いて、タンパク質ホメオスタシス、ストレス、老化の関係を調査します。生物体レベル、細胞レベル、タンパク質レベルでのタンパク質の誤折りたたみをモニタリングすることで、プロテオスタシスの背後にあるメカニズムを解明することを目指しています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 老化研究
背景
- タンパク質ホメオスタシスは細胞機能にとって重要です。
- 誤折りたたみタンパク質は細胞ストレスと老化につながる可能性があります。
- Caenorhabditis elegansはこれらのプロセスを研究するための効果的なモデルとして機能します。
- タンパク質ダイナミクスの理解は神経変性疾患への洞察を提供する可能性があります。
研究目的
- 異なる生物学的レベルでのタンパク質の誤折りたたみをモニタリングすること。
- 温度がプロテオスタシスに与える影響を評価すること。
- タンパク質ホメオスタシスの指標として行動表現型を探索すること。
使用された方法
- 運動性と耐熱性評価のための行動アッセイ。
- タンパク質局在化のための免疫蛍光顕微鏡法。
- タンパク質安定性の評価のためのウェスタンブロット分析。
- タンパク質安定性を直接モニタリングするためのEx vivo部分消化アッセイ。
主な結果
- 培養温度の変化により、プロテオスタシス能力の変化が観察されました。
- 行動アッセイは、タンパク質の誤折りたたみに関連する運動性の変化を示しました。
- 免疫蛍光顕微鏡法により、機能障害に関連する誤局在化タンパク質が明らかになりました。
- ウェスタンブロット分析により、メタ安定性タンパク質の安定性の変化が確認されました。
結論
- この研究は、タンパク質ホメオスタシスと老化の間の複雑な関係を強調しています。
- 結果は、温度などの環境要因がプロテオスタシスに大きな影響を与えることを示唆しています。
- 将来の研究は、タンパク質の誤折りたたみを標的とする治療戦略に焦点を当てる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Monitoring protein homeostasis in multicellular systems enables early detection of folding defects that impact target validation and lead identification. Using Caenorhabditis elegans as a genetically tractable model provides a disease-relevant system for assessing proteostasis modulation across organismal, cellular, and molecular scales. This approach supports mechanistic de-risking by linking protein misfolding to phenotypic outputs, improving predictive confidence in preclinical target selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogate therapeutic hypotheses by monitoring protein misfolding via behavioral assays that report on folding environment changes in vivo.
- Operational Value: Enable rapid screening of genetic or chemical modifiers using motility or thermotolerance as quantitative readouts of proteostasis capacity.
- Predictive Value: Support target triage by correlating protein stabilization with functional rescue in a multicellular context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepare validated biological systems for downstream workflows by using metastable proteins as sensors of folding efficiency in specific tissues.
- Operational Value: Address assay standardization through ex vivo partial digest assays that directly measure protein stability and conformation.
- Scalability: Highlight screening readiness via immunofluorescence microscopy that monitors protein mislocalization as a proxy for folding capacity across developmental stages.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discuss disease relevance by connecting protein mislocalization in muscle or neuronal tissues to functional decline in aging-related models.
- Operational Value: Describe continuity from discovery through preclinical validation by tracking conformational changes via western blot analysis of protein fragments.
- Risk-Adjusted Advancement: Support decisions on target modulation by linking folding improvements to phenotypic recovery in whole-organism assays.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing multi-scale readouts that inform lead identification and preclinical progression through measurable proteostasis outputs.
- Discovery Biology: Explain how the method supports hypothesis testing by using temperature-sensitive proteins to probe folding capacity under controlled stress conditions.
- Screening: Describe assay readiness through behavioral and imaging assays that deliver reproducible, quantitative readouts of protein misfolding across genetic backgrounds.
- Analytics: Highlight measurements such as motility indices, fluorescence localization patterns, and proteolytic fragmentation profiles that enable comparison of folding states.
- Translational Research: Connect the method to preclinical continuity by demonstrating how rescued protein folding correlates with improved motility and survival in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Frame the method as a reusable capability for evaluating proteostasis modifiers across multiple targets and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through direct observation of protein misfolding at organismal, cellular, and protein levels.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via calibrated assays for thermotolerance, immunofluorescence, and ex vivo digestion.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in target validation through phenotypic anchoring of folding data.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization by identifying compounds or genetic interventions that restore proteostasis in a multicellular system.
Implementation Considerations
- Required expertise in C. elegans culture, genetic handling, and phenotypic assay execution.
- Instrumentation needs include fluorescent stereoscopes, centrifuges, thermomixers, and western blot imaging systems.
- Cross-team standardization requires synchronized animal preparation and blinded scoring of motility and survival endpoints.
- Adaptation considerations involve calibrating heat shock, fixation, and digestion conditions for different metastable proteins and strain backgrounds.
- Practical limitations include protocol length and sensitivity to variations in animal synchronization and reagent activity.
