Name: ウニ接合体のハイスループットマイクロインジェクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-21T21:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 40 s
Description: 学ぶウニ接合体へのハイスループットマイクロインジェクション手法。産卵誘導、受精、マイクロインジェクションを通じてRNA・タンパク質発現を解析し、発生生物学における遺伝子機能の理解を深める効率的な技術です。

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私たちは、写真撮影の補助のための原稿やベティCowgillの重要な読書のためのサンティアゴ·スアレスに感謝します。我々はまた、彼らの重要なフィードバックのための匿名査読に感謝します。この作品は、デラウェア大学の研究基金によってサポートされています。

1。硫酸プロタミンの製造（PS）コートディッシュ<ol><li> 50mlコニカルチューブ中の脱イオン蒸留水（のddH 2 O）50mlに0.5gのPSを添加して硫酸プロタミン（PS）の1％溶液を調製する。 PSの完全な溶解を確実にするために1〜2時間室温でベンチシェーカー上で高速によく振る。この溶液を3（完全に、使用前にゲル状の沈殿物を溶解することを確認する）少なくとも3ヶ月間、4℃で保存することができる。 </li><li> 60ミリメートル×15ミリメートルのポリスチレンペトリ皿のスリーブを取り、ベンチに蓋と底の両方をレイアウト。 </li><li>少なくとも2分間残して、表面を覆うのにちょうど十分な各皿中の1％PS溶液（両方の底部及び蓋を使用することができる）注ぐ。 4℃で保存したときに残ったPS溶液を3ヶ月以内に何回も再利用することができる</li><li>蒸留水（DH 2 O）を満たしたビーカー内の場所、PS-処理皿を。少なくともためのdH 2 Oを実行しているの下にビーカーを残す10分。 </li><li> PSでコーティングされた皿を記憶するために直ちに又は空気乾燥を使用することができる。埃の蓄積を防ぐためにそれらをカバーしています。それらは、1ヶ月3を室温で保存することができる。 </li></ol> 2。ウニ​​配偶子を取得し、マイクロインジェクション用のPSコートディッシュ上で卵を固定する<ol><li>配偶子3（ 図2）を解放するために平滑筋の収縮を誘発するために振盪または0.5％のKClまでの1ミリリットルの体腔内注射によるスポーンウニ。 </li><li>動物は雄である場合、白色精子によって示されるように、1.5mlチューブに動物の表面から精子を採取、乾燥。乾燥した精子は、生物学的機能の著しい損失なし週間4℃で保存することができる。 </li><li>動物が雌である場合、卵黄含量に起因する黄色で示すように、海水の完全gonoporesビーカーに浸漬することにより、その配偶子を集める。卵はgonoporesから解放され、重力によって落ち着くことになります。&lt;/李&gt; <li>このような80ミクロンのナイロンフィルターメッシュを用いた動物の棘などの破片から卵をフィルタリングします。卵を産卵後5-7時間以内に使用された場合、最良の結果が達成される。 </li><li>卵をDejelly： <ol><li>卵の約1ミリリットルのための酸性海水100ミリリットルを用意します。 5.1-5.2のpH 8.0から海水のpHを調整するために0.5 Mクエン酸を使用する。 pHが低すぎる受精を減少し、pHが高すぎる、卵がPSでコーティングしたプレートに付着することはできません。 </li><li>酸性海水に卵（1ミリリットルを超えない）を追加し、卵を10分間氷上で落ち着くことができます。あるいは、ゼリーコートの除去が治療中に卵を穏やかに旋回することによって容易にすることができる。一つは、効果的にdejelly Sを 3〜4分でこのように卵をpurpuratusすることができます。 </li><li>慎重に、酸性の海の水を注ぐ新鮮な海の水を追加して、卵が再び氷上に落ち着くましょう。 Dejellied卵が受精の問題なしに最大6時間氷上で保存することができる</li></ol></李&gt; </ol> 3。卵を行<ol><li>のddH 2 Oで10mlに3-AT 0.84gを溶解することによって、3 -アミノトリアゾール（3-AT、MW = 84.08）の1 Mのストック溶液を調製この溶液を6ヶ月まで4℃で保存することができる。 </li><li>予冷海水50mlに1Mストック溶液50μlを添加することにより、3-ATの1 mMのワーキング溶液を調製する。氷の上で解決策を維持する。 </li><li>卵の穏やかな取扱いのための口のピペット（ 図3）を準備します。 <ol><li>ピペットチップは、手動でガラスのマイクロピペット（100×外径1.09ミリメートル）から引き出されている。直火の上に両手でマイクロピペットを保持する。ガラスは反対方向に、ピペットの端部を引っ張る注意深く、溶融し始めるように</li><li> 1は、パラフィルムで密封シール、プラスチックチューブ（ID 1.14ミリメートル）にピペットを引っ張って接続します。チューブの長さは約50〜70センチメートルにする必要があります。 </li><li>ガラスチューブに、チューブの反対側の端部に無菌濾過P20またはP200先端を挿入するマウスピースとして使用する。 </li><li>先端の直径を調整するためにはさみでガラスマイクロピペットの先端をクリップ。最適な直径は、わずかに卵（80ミクロン）の直径を超えています。 </li></ol></li><li>各PSコートディッシュ（底部または蓋）に1 mMの3-ATの海水の4ミリリットルを注ぐ。 </li><li>口のピペットを取り、口の中でP20/P200チップを入れて、歯で固定します。卵を吸引するために、第一の海水少量の水を吸引する。前の卵をロードする液体の列を持つことにより、1口の分注技術に対して最大の制御を持つことになります。 </li><li>卵の近くにマイクロピペットチップを置き、静かにピペットで卵の数百に吸引除去する。ガラスマイクロピペット内の卵を閉じ込める。 </li><li>行は、直線的に先端を移動させながら、ゆっくりと口のピペットからそれらを吹き付けて皿の上に一直線に卵をdejellied。受精の問題が原因で、Pに発生する可能性があるため、右の注射の前に卵を行3-ATの海水3への露出をrolonged。また、PSのような陽イオン性接着剤は、卵への毒性があることができ、受精の封筒が削除されている場合は特に、長時間これらの試薬に胚を公開することはお勧めできません。 </li><li>ガラスピペットを使用して漕い卵の線近傍の皿に傷を作る。この傷は、必要に応じて溶液の流れを調整するために注射針を破壊することが重要である。代わりに、傷が皿に3-ATの海水を注ぐ前に行うことができます。 </li></ol> 4。ウニ​​受精卵のマイクロインジェクション<ol><li>マイクロインジェクション·ステーションの電源をオンにします。ここでは、FemtoJet噴射システムの使用を記載している。 </li><li>ニードルプラーを用いて射出毛細血管を引き出します。良好な針の例が図4に示されている。注：RNAの注入は、注入キャピラリーRNAアーゼ31の汚染を避けるために前処理されるべきである。 <ol><li>を50mlの円錐内に噴射毛管を配置するチューブと濾過し、メタノール/塩酸（9:1）の50ミリリットルを追加します。よく振って、もはや10時間以上のために一晩放置しない。 </li><li>メタノール/塩酸を捨て、毛細血管が同じチューブ内で濾過し、メタノールで2回すすいでください。 </li><li>できるだけメタノールを排出し、メタノールの完全な除去を確実にするために、一晩キャピラリーを凍結乾燥。 </li></ol></li><li>慎重に針装填ホルダーに針毛細血管をマウントし、microloaderチップを使用して試料溶液の&lt;0.5μlでそれを読み込む。試料溶液は、通常、注入された材料3に応じて、20％グリセロールを含有する。 </li><li>顕微鏡ステージ上で漕い卵の皿を置きます（接眼レンズを通して見たときの卵が垂直配向する必要があります）と卵に焦点を当てています。 </li><li>慎重に針に微量ホルダーにロード針をマウントして、フィールドの真ん中に完全に集中先端を持つように針の位置を調整します。 </li><li>最大圧力FOを適用するには、ボタンを押すR針の清掃。解決策は、針から出てくるはずです。必要に応じて圧力を調整し、射出圧力は、少なくとも約1/3の噴射圧補正圧で、90から360ヘクトパスカルの範囲であるべきである。 </li><li>未受精卵に注入することによって、溶液の流れを調整します。ジョイスティックマイクロマニピュレーターを用いて、未受精卵に注射針の先端を演出します。針落ちを促進するために、このようなねじ回しなどの硬い物体とのステージの穏やかなタッピングによって若干の震えを作る。卵の中に射出成形ボーラス（ 図5）見られるべきである。 </li><li>注入ボーラスが表示されない場合は、少し、卵上記の針の先端を高めるディッシュの傷を見つけて、フィールドの中央に配置されるように調整します。優しく、注射針の先端を破るためにスクラッチマークに針の先端をタップします。注入ボーラスがTの1/5を超えないことを確実にするために、注射や補償の圧力を調整卵（1-2 PM）の彼は、直径。 </li><li>注入ボーラスを校正した後、希釈した精子（1:1,000）または精子の1〜2μLを追加することで卵を受精。卵の行を外れることを防ぐために慎重によく混ぜる。 </li><li>受精エンベロープは（ 図5）目に見えるようになる直後に注射を開始します。ステージコントローラを使用して漕い卵の線に沿って移動し、ジョイスティックマイクロマニピュレーターによって制御針でそれらを突っついによって、できるだけ多くの受精卵を注入する。 </li><li> 10〜15分後に、新たに受精した卵は硬くなり、もはや注入することができません。段階からお皿を取り外し、慎重にプラスチック製パスツールピペットを用いて3-AT海水中に精子を吸引除去する。 </li><li>接合体が乾燥しないようにしてください。すぐにお皿をカバーするために、新鮮な予冷海の水を加える。 15℃で胚を培養する</li></ol>

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著者らは、競合する経済的利益や関心のある他の衝突を宣言していません。

マイクロインジェクションは、DNA、mRNAを、組換えタンパク質、卵、胚、および様々な生物1-7の細胞への機能と関数試薬、染料およびそれらの組み合わせの利得の損失などの様々な治療を提供するための強力な手法です。マイクロインジェクション実験を設計する場合ただし、いくつかの考慮事項が心に留めておくべきである。 これは、送達処置および注入量の溶解性を考慮することが非常に重要である。顕微注入溶液はわずかな沈殿物を形成する傾向がある場合には、微量注入針を目詰まりされるであろう。一般的には、任意の沈殿物を溶液3から削除されていることを確認するために針の中にロードする前に、15分以上のためのソリューションを遠心分離することをお勧めします。他のアプローチは、ミリポアスピンカラムに溶液を通過させることである。それは目詰まりを回避することができない場合、それは、再度チップを壊すことによって穏やかに針詰まりを取ることも可能である先端が広すぎると、それは溶液の流れを制御することが困難となる。注入した溶液に多量の胚に有毒であることができる。また、幅広の先端は、個々...

効率的で再現性のある治療照射は、研究者のための主要な方法論的課題の一つである。いくつかの方法が一過卵、胚、および細胞への治療ソリューションを提供するために設立されました。これらの方法には、1,2、リポフェクション（膜を用いた治療を含むリポソームの融合による配送）1、微粒子衝撃1（DNAはミクロンに析出（短い電気パルスを用いて、膜内の生成過渡毛穴に基づく）エレクトロポレーションサイズの金属次いで高速で細胞に浸透するのに使用される粒子）、および形質導入（ウイルス導入遺伝子の送達ビヒクルとして使用される）。現時点では、マイクロインジェクション、最小限の試薬を用いた100％の効率で任意のソリューションを提供する利点を保持している唯一の方法である。また、単回注射液は処理の複雑な混合物から構成することができる。この技術は、成功するために使用されているLYなウニ3,4、ゼブラフィッシュ5、マウス6、カエル7、牛8だけでなく、組織培養9の単一細胞などの多数の種から卵や胚をマイクロインジェクション。後で発達段階での単一割球の注射はまた10月12日に実施されている。 マイクロインジェクションの現在の方法は、最初に平本10によって記載された加圧注入法に基づいているが、大きな進歩は、このプロセスの最適化に向けて行われている。優れたマイクロインジェクション技術は、他の場所で11を記載されており、ここで我々は現在、ウニ（Strongylocentrotus purpuratus）新たに受精卵をマイクロインジェクションするために使用され、特定のいずれかの方法を説明します。一世紀以上の場合は、ウニ、貴重な実験モデル15,16となっている。ウニ​​は、進化的に密接に（私たちも含む）脊索動物との分析に関連しているそれらのゲノムは、彼らが人間の17のように、すべての主要な遺伝子ファミリーが含まれていることを明らかにした。それらは、同期を容易に操作することができる透明な胚を現像多数を生成する。モデル生物としてウニを使用して、ウニのコミュニティが受精過程18〜21の我々の理解に貢献してきました、細胞生物学的プロセス22〜24、および遺伝子調節ネットワーク（GRNs）25〜28。 ウニ​​の受精卵へのマイクロインジェクションには、いくつかのステップが必要です。まず、卵は、従来の注射（後述）に固定化される必要がある。マイクロインジェクション皿を負に帯電した卵が3を接着することができ、正に荷電した表面を作成し、硫酸プロタミン（PS）でコーティングされている。卵は、自然海水又は人工海水（pH8.0）中で2回洗浄した酸性海水に10分間液（pH 5.15）中でインキュベートしdejelliedされる。 dejellied卵を慎重に一直線に漕いている受精29の結果、卵の皮質の顆粒から分泌されるovoperoxidaseの活性を阻害するのに必要とされる1 mMの3 -アミノトリアゾール（3-AT）の存在下でのPSでコーティングされた皿の中央にある。このステップは、受精エンベロープの硬化を防止し、マイクロインジェクション針進入を容易にすることが重要である。 1mMの3-ATの代替として、10mMのパラアミノ安息香酸（PABA）を用いることができる。注射液は、特殊なマイクロローディングピペットチップを用いてマイクロインジェクション針にロードされ、マイクロマニピュレータ及び圧力装置（ 図1）に取り付けられたホルダに取り付けられている。各針は、別々の日に複数の実験における個々の接合体のマイクロインジェクションするために使用することができる。接合体が硬化するまで、マイクロインジェクションは、10〜15分間行うことができる。接合体は、その後、15℃の海水培養で洗浄する胚は胞胚段階に孵化に到達すると、それらはFERのコンポーネントを消化孵化酵素をリリースtilizationエンベロープ30と、それらが自然に、PSでコーティングされた皿から切り離すことができます。必要ならば、胚は、胚に穏やかに穏やかに海水を吹き付け口ピペットまたはパスツールピペットを用いてディッシュから剥離することができる。記載された方法は、下流の分析のためのハイスループット法を提供する、単一皿上100-400新たに受精した卵の効率的かつ信頼性の高いマイクロインジェクションを可能にする。

<table><tbody><tr><td>ガラスパスツールピペットVWR</td><td></td><td>14673-043</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡&nbsp;軸方向 40 &deg;C</td><td>ツァイス</td><td>4109431007990000</td><td>インジェクション顕微鏡</td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242 956.003</td><td>ロードインジェクションソリューション</td></tr><tr><td>ナイロンフィルターメッシュ 80&nbsp;&mu;m</td><td>Amazon.com</td><td>03-80-37</td><td>卵をろ過して破片を取り除く</td></tr><tr><td>P20またはP200 エアロゾルバリアピペットのヒント</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>02707432または02707430</td><td>口ピペットの一部</td></tr><tr><td>パラフィルム フィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック</td><td>13 374 12</td><td>口ピペットの一部</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブ</td><td>イントラメディック</td><td>PE-160</td><td>口ピペットの一部</td></tr><tr><td>硫酸プロタミン</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194729</td><td>注射皿にデゼリー状の卵を取り付ける</td></tr><tr><td>ウニ S. purpuratus</td><td>Pt. Loma Marine Invertebrate Lab</td><td>N/A</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>海水</td><td>、ペットショップ、</td><td>インスタントオーシャン</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>滅菌済み 60 mm x 15 mm ポリスチレン ペトリ皿</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>0875713A</td><td>注射皿</td></tr><tr><td>3軸粗位置決め マイクロマニピュレーター MMN-1</td><td>成重</td><td>9124</td><td>注射針の操作</td></tr><tr><td>3軸ジョイスティックタイプ 油圧式 微小マイクロマニピュレーター MMO-202ND</td><td>成重</td><td>9212</td><td>注射針の操作</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>13-711-9AM&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>縦型&nbsp; ニードルプラー&nbsp;</td><td>ナリシゲ</td><td>PC-10</td><td>プルインジェクションニードル</td></tr></tbody></table>

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

細胞および胚へのマイクロインジェクションは、広範囲の生物学的プロセスを研究するために使用される一般的な技術である。この方法では、処理溶液の少量は、物理的に個々の固定化細胞または胚を注入するために使用されているマイクロインジェクション針の中に装填される。ハイスループット配信のためにこの手順を実行するには、最初のトレーニングの必要性にもかかわらず、マイクロインジェクションは、細胞、卵や胚に最大の効率と（サンプルの複雑な混合物を含む）処理溶液の多種多様な再生可能な配信を提供しています。微量注入への応用DNAの送達は、mRNAが、組換えタンパク質、機能の獲得、および機能試薬の損失を構築挙げられる。蛍光または比色染料がインスタント効率的な配信の可視化だけでなく、送達される溶液の量を確実に正常化するためのツールを有効にするために注入された溶液に添加される。記載されている方法は、100〜400ウニzのマイクロインジェクションを可能にします10〜15分内ygotes。

GFPとmCherryレポーター構築物は、in vitroで転写され、新たに受精卵に微量注入していた。胚（胞胚期まで）24時間15℃でインキュベートし、ツァイスオブザーバーZ1顕微鏡を用いて画像化した。レポーター構築物の注入は任意の発達障害（ 図6）には至らなかった。蛍光シグナルの定量化のため、画像取得を最大限蛍光画素（ 図6D〜F）を捕捉するために低倍率（100X）で行った。蛍光シグナルはAxioVisionの4.8.2.0を用いて定量した。 100-200胞胚の集団内の蛍光シグナルの強度のための標準誤差（データは示さず）、1.5％を超えなかった。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50841/50841fig1.jpg"> 図1。マイクロインジェクションのセットアップ。（A）、PS</str...

マイクロインジェクションは、卵、胚、および種々の種の細胞にDNA構築物、mRNAは、モルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは他の治療法を送達するために使用される一般的な技術である。

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

この手順の全体的な目標は、ウニの接合子のハイスループットマイクロ注射を行うことです。これを行うには、ウニで産卵が誘発され、オスとメスの配偶子が収集されます。その後、卵は酸性の海水を使用して証書され、ペトリ皿に一列に固定されます。その後、精子を卵子に加えて受精させ、マイクロインジェクション後に、目的のMr.N.Aの機能喪失、試薬、またはタンパク質のマイクロインジェクションを行います。精子を含む3つのAT水は、新鮮な海水と交換されます。これらの胚は、その形態や、特定のRNAやタンパク質の時間的・空間的発現を調べることができます。エレクトロポレーション、リップパーフェクション、マイクロパーティクル、ボンバードメント、形質導入などの既存の方法と比較した場合、この技術の主な利点は、最小限の試薬であらゆる溶液を100%の効率で送達できることです。この方法は、1回の実験で数千個のXが入る1つの皿に100〜400倍の効率的で信頼性の高いマイクロインジェクションを可能にし、ダウンストリーム分析のためのハイスループットな方法を提供します。この実験を行う前に、必要なすべてのストック溶液と機器を準備してください。レシピについては添付のドキュメントを参照してください、卵を優しく取り扱うためには口のピペットが必要になります。準備するには、ガラスが溶け始めたら、ガラスのマイクロピペットを両手で直火にかざすことから始め、ピペットが2つに分離するまでピペットの端を反対方向に慎重に引っ張ります。次に、引っ張ったピペットを1本、長さ50〜70cmのプラスチックチューブに接続します。パラフォームを適用して、しっかりと密閉します。マウスピースが最終的にハサミでガラスマイクロピペットの端をクリップしてチップの直径を調整すると、最適な直径が卵の直径をわずかに超えるため、チューブのもう一方の端に滅菌P 20またはP 200のろ過された先端を挿入して使用します。次に、プロタミン硫酸塩コーティング皿を準備します。ベンチトップに2060ミリメートル×15ミリメートルのポリスチレン製シャーレを敷き詰め、ディッシュの蓋を取り外します。これらは、以下、各皿に1%プロタミン硫酸塩溶液(PS溶液と呼ぶ)を注いで皿としても使用する。表面を覆うのに十分な量を加え、インキュベーション後少なくとも2分間インキュベートします。PSソリューションを取り外し、後で使用するために保存してください。残ったPS溶液は、4°Cで保存すれば3ヶ月以内に何度でも再利用できます。PS処理した皿を蒸留水で満たされたビーカーに入れます。次に、ビーカーを蒸留水の流下に少なくとも10分間置きます。PSコーティングされた皿は、すぐに使用することも、自然乾燥させて保存することもできます。ほこりがたまらないように覆ってください。室温で最大1ヶ月間保存できます。インジェクションキャピラリーを作製するには、ニードルプラーを使用します。ニードルプラーの設定は、原稿に記載されているように経験的に決定する必要があります。ウニを産卵するには、ネットを使用して動物を水槽から取り出し、ペーパータオルの上に置きます。次に、動物を持ち上げてしっかりと保持します。振ってください。または、次のようにエミック注射を行います。動物を水槽から取り出した後、動物を片手で持ち、10ミリリットルの注射器に接続された20ゲージの針を使用して、動物の唯一の柔らかい部分である周囲膜に1ミリリットルの0.5モル塩化カリウムを注入します。1分から10分後、動物の性別が明らかになります。オスは白い精子を放出し始め、メスは黄色の卵子を放出し始めます。動物が雄の場合は、ピペットを使用して動物の表面から乾いた精子を集め、1.5ミリリットルのチューブに移します。乾燥した精子は、生物学的機能を大幅に損なうことなく、摂氏4度で1週間保存できます。動物が雌の場合は、海水で満たされたビーカーにgnoの毛穴を浸して、そのga肉を収集します。gnoの毛穴から放出された卵子は、重力によって落ち着きます。産卵後、卵の入った海水を注いで、動物の棘などの破片から卵をろ過します。80ミクロンのナイロンフィルターメッシュを通して、氷の上のきれいなビーカーに。卵をデジェするには、プラスチック製のビーカーで最大1ミリリットルの卵を100ミリリットルの酸性海水に移し、卵をやさしく渦巻き、10分間氷の上に落ち着かせます。処理後、酸性の海水を慎重に注ぎます。次に、新鮮な海水を加え、卵を氷の上に落ち着かせます。又。De jelled卵は、受精に影響を与えることなく、最大6時間氷上に保存できます。マイクロインジェクションを行う直前に、各PSコーティング皿に1ミリモルの3〜4ミリリットル、TC水3を注ぎます。.Xは、特に受精動物が除去されている場合、特に受精動物が除去されている場合、3つの80°Cの水に長時間さらされたり、タンパク質硫酸塩などのオン接着剤が X.So に有毒である可能性がある場合、注射入院の前にすべての種類である必要があります。マウスピペットの先端を歯で固定し、少量の海水を吸引します。これにより、卵子が吸引されたときの制御が向上します。次に、マイクロピペットの先端を卵の近くに置き、数百個の卵をガラスマイクロピペット内に閉じ込めて静かに吸引します。次に、先端を直線に動かしながら、ピペットからそっとシャレに吹き出して列を作ります。ガラスピペットを使用して、ロードエッグのライン近くの皿に傷をつけます。この傷は、後で注射針を折るために使用できます。マイクロインジェクションプロセス中に必要に応じて溶液の流れを調整します。ここでマイクロインジェクションステーションの電源を入れます。フェムトジェットインジェクションシステムは、一対の鉗子を使用して慎重に使用されます。ニードルキャピラリーをニードルローディングホルダーに取り付けます。針の開口部の汚染を防ぐために、針の端に触れないでください。マイクロローダーチップを使用して、0.5〜1.0マイクロリットルのサンプル注入液をロードします。ロードエッグが入ったディッシュを顕微鏡ステージに置き、卵が垂直に揃うようにディッシュを配置します。接眼レンズを通して見たとき、卵に焦点を合わせます。装填した針をマイクロインジェクターの針ホルダーに慎重に取り付け、針の位置を調整して、先端が視野の中央に完全に焦点を合わせるようにします。次に針を清掃するには、ボタンを押して最大圧力を適用します view顕微鏡を通して観察します。解決策は、針から排出されるときに見られます。射出圧力を90〜360 HPの範囲に調整し、補償圧力を射出圧力の約3分の1にします。次に、未受精卵を注入して、注入セットアップの流れを調べます。ジョイスティックマイクロマニピュレーターを使用して、注射針の先端を未受精卵に向けます。針の挿入を容易にするために、ドライバーなどの硬いものでステージを軽く叩くことで、わずかな震えを引き起こします。フットペダルを押して卵を注入します。注射ボーラスが見えない場合は、針をスクラッチマークに持ってきます。.針先を引っかき傷の跡まで軽くたたいて、注射針の先端を折ってください。先端の開口部がわずかに広いため、溶液の流れが容易になり、壊れた先端の鋭いエッジが針の挿入を容易にします。受精エンベロープが見えた直後に精子を追加して卵子を受精させます。マイクロマニピュレーターを使用して注入を開始します。右手で針の先端を受精卵に押し付け、ほぼ同時にわずかなくぼみを引き起こします。左手で持ったドライバーで顕微鏡ステージを軽くたたきます。ステージコントローラーを使用してロードザイゴットのラインに沿って移動し、できるだけ多くのザイゴットを注入します。注射ボーラスは接合子の5分の1を超えてはなりません。.10分から15分後、新たに受精した卵子は固くなり、注入できなくなります。皿をステージから取り出し、プラスチック製のパスタピペットを使用して、精子を含む3つのA TC水を慎重に吸引します。受精卵を乾かさず、新鮮な予冷海水をすばやく追加します。皿を覆い、摂氏15度でインキュベートします。注射後。実験に適した表現型または分子の変化について胚をモニターし、レポーターコンストラクトの注入が発生に影響を与えたかどうかを判断します。GFPおよびmチェリーレポーターコンストラクトをin vitroで転写し、新たに受精した卵子にマイクロ注射しました。ここに示されている注入された胚は、矢印で示されている注入されていない胚と明確に区別できます。胚を15°Cで24時間インキュベートし、ここで見られるように画像化しました。着色された注入された胚は、灰色の非注入された胚と同じ形態を持っています。これは、レポーターコンストラクトの注入が発達上の欠陥を引き起こさないことを示唆しています。このビデオを見た後、ウニをマイクロインジェクションする方法をよく理解しているはずです。Zygotes Microinjectionは、遺伝学、細胞生物学、および発生生物学の研究に貴重なツールです。この技術を使用して、ウニコミュニティは、発生生物学の根底にある硫酸塩の仕様、遺伝子調節、遺伝子発現、生化学的経路などの発生経路の理解に大きく貢献しました。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

マイクロインジェクションは受精ゼブラフィッシュの胚への外来物質を導入するための十分に確立し、効果的な方法です。ここで、我々は、ゼブラフィッシュでのmRNAの過剰発現、およびモルフォリノオリゴヌクレオチドの遺伝子のノックダウンの研究を行うための堅牢なマイクロインジェクション法を示しています。...

ゼブラフィッシュ胚におけるmRNAおよびモルホリノアンチセンスオリゴヌクレオチドのマイクロインジェクション。

このビデオは、モルホリノまたはmRNAが、その後の開発中に特定の遺伝子産物のレベルを増減して1細胞段階でゼブラフィッシュ胚に注入する方法を示しています。...

遺伝子機能を解析するためにゼブラフィッシュ胚のマイクロインジェクション

我々は、分化段階の遺伝子から潜在的なエンハンサー要素を発見し、モザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシスを通じてその機能を評価するために我々のアプローチを示しています。...

エンハンサー配列を評価するためのモザイクのゼブラフィッシュのトランスジェネシス

このビデオでは、ゼブラフィッシュの卵黄嚢に化合物を送達するための胚マイクロインジェクションの技術について説明しています。...

胚マイクロインジェクション:ゼブラフィッシュの卵黄に化合物を送達する技術

出典: Shi, J. ら、 植物病原体の分泌効果子からのRNAサイレンシング抑制因子のスクリーニングと同定。 J. Vis. Exp. (2020年)このビデオでは、ア セ...

ゼブラフィッシュ胚の尾静脈への細菌の微小注射

モルファント胚を生産する方法は、発生メカニズムや遺伝子制御ネットワークを研究するために不可欠である。海の星Patiria miniataはこれらの研究のための新たなモデル系である。ここでは、胚の培養液を生産、配偶子を取得するためのプロトコルを提示しており、この種から接合体の急速なマイクロインジェクション。...

のマイクロインジェクション法 Patiria minata接合体

明確な遺伝的背景における個々のWT網膜前駆細胞のライブトラッキングは、神経発生時の細胞非自律的なシグナル伝達の寄与を評価することができます。ここでは、胚移植を介して、およびin vivoタイムラプス共焦点イメージングにおける遺伝子ノックダウン、キメラ世代の組み合わせは、この目的のために利用しました。...

細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

Zebrafish の胚・仔魚のマイクロインジェクションは多くのゼブラフィッシュ モデルで重要だが、挑戦的な手口です。ここでは、安定化を支援するためにマイクロ...

最適化されたマイクロインジェクションおよびゼブラフィッシュ幼虫の画像処理用微細構造デバイス

ここでは、光学トラップによる直接力測定を用いて、3次元閉じ込めで単離した胚ゼブラフィッシュ細胞の細胞内の機械的特性を調べるプロトコルを提示する。...

光ピンセットを用いた閉じ込めにおける細胞下力学の直接力測定

炎症シグナルが遺伝的に感受性の高い生物の神経発達にどのように影響するかをモデル化するために、ゼブラフィッシュ幼虫のキューヴィエ管(共通主静脈)にIL-6を微量注射するプロトコルを提示し、炎症の制御された誘導と結節性硬化症複合体(TSC)における発生影響の評価を可能にします。...

TSCゼブラフィッシュ幼虫の血流へのインターロイキン-6微注射による神経精神疾患様行動の研究

学ぶウニ接合体へのハイスループットマイクロインジェクション手法。産卵誘導、受精、マイクロインジェクションを通じてRNA・タンパク質発現を解析し、発生生物学における遺伝子機能の理解を深める効率的な技術です。

ウニ​​接合体のハイスループットマイクロインジェクション

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