FtsZは重合アッセイ：シンプルプロトコルと考慮事項

次の実験の全体的な目標は、簡単なアッセイと機器を使用して、FTSZ、重合、および活性を研究するための適切な条件を決定することです。これは、FDSZが重合する適切な条件を見つけるために、さまざまな条件下でFDSCポリマー沈降アッセイを行うことによって達成されます。第2のステップとして、FDSZ重合をリアルタイムで研究するための光散乱アッセイを行います。

次に、FT SCの重合に関連するg gtpa活性を決定するために、GTP加水分解アッセイを行います。沈降、光散乱、GTP加水分解に基づく特定の細菌源のFTSCの研究に最適な条件を示す結果が得られます。ここに示す手法は、どのラボでも簡単に実行でき、特定のFT a zの重合能力を迅速に把握できます。他のタンパク質の存在下でFTAZを使用する場合、適切なバッファーの選択が特に重要であることがわかり、この技術が私の研究室の大学院生であるEVA crawlになります。

まず、5マイクロリットルの100ミリモル塩化マグネシウム、および12マイクロモルの細菌タンパク質、FDSCおよび/またはSEP Fを、添付のテキストプロトコルに記載されているように、さまざまなpH値および組成を有する選択された重合緩衝液の1つに加えます。次に、チューブを振とう機能付きのインキュベーターに入れ、サンプルを摂氏30度、300RPMで2分間インキュベートします。チューブが完全に混合されたら、100ミリモルのストック溶液からGTPまたはGDP混合物を1マイクロリットル加えて重合を開始し、最終濃度が2ミリモルになるようにします。

次に、サンプルを振とうインキュベーターにさらに20分間戻します。次に、TLA 55ローターまたは同等の24, 600Gsを使用して、室温で15分間、20, 000 RPMでチューブをスピンダウンします。遠心分離機が終了したら、上清をきれいなチューブに移し、ペレットを後で使用するために保存してください。

移された上清を20マイクロリットル取り、20マイクロリットルの2倍濃縮サンプルバッファーと別のチューブで混合します。キャップを固定し、サンプルを摂氏98度で10分間沸騰させます。次に、あらかじめ取っておいた各ペレット画分に、2倍に濃縮されたサンプルバッファー50マイクロリットルを加え、サンプルを摂氏98度で10分間煮沸してポリマーを懸濁します。

サンプルの沸騰が終わったら、ペレットが入ったチューブにさらに50マイクロリットルの脱塩水を追加します。次に、各サンプルから上清とペレットの両方を10マイクロリットルずつ10μLの10%SDSページゲルに並べてロードし、ゲルを150ボルトで泳動します。ジェルが完成したらジェルをはがし、クマシブリリアントブルーのGツー50で染色します。

次に、ゲルをイメージングし、添付のテキストプロトコルに記載されているように、サイトメトリーを使用してタンパク質を定量します。まず、蛍光分光器をオンにし、熱変動を避けるためにランプを数分間ウォームアップさせます。また、循環水浴の電源を入れ、水温を摂氏30度に設定して、獣医室を一定の温度に保ちます。

システムがウォームアップしたら、分光器の動作パラメータを定義します。検出器の高電圧を300ボルトに、発光波長と励起波長を350ナノメートル、スリット幅を4ナノメートルに設定します。次に、3, 600秒の時間ベースの集録を選択して、データ集録プロトコルをプログラムします。

光路長1cmの200マイクロリットルの蛍光ベテを、水浴中の洗浄液で5分間淫行して慎重に洗浄します。次に、添付のテキストプロトコールに記載されている9つの重合緩衝液のそれぞれについて、それぞれ10ミリモルの塩化マグネシウムと12マイクロモルのFDSEを300マイクロリットルについて計算した最終濃度として、294マイクロリットルのマスターミックスを調製します。次に、混合物を短時間ボルテックスし、最初の重合緩衝液の196マイクロリットルを獣医に移します。

それを分光計に入れ、2分間インキュベートしてサンプルの温度を摂氏30度まで上げます。2分後、データ集録を開始し、90秒間待って信号が安定していることを確認します。次に、100ミリモルのGTPまたはGDPを4マイクロリットル追加します。

サンプルを混合し、1時間にわたってデータ取得を続けます。リストされている各バッファについて、これらの手順を繰り返します。選択した重合バッファーに1.5ミリリットルの2ミリモルGTPを調製します。

また、同じバッファーで0〜40マイクロモルの範囲のリン酸塩標準希釈液を調製します。次に、バイオアッセイキットに記載されているように、マラカイトグリーンワーキング試薬を調製します。次に、それぞれ合計容量360マイクロリットルの4つのマスターミックスを作ります:マスターミックス1つは枯草菌由来のFDSZを含み、マスターミックス2つは大腸菌由来のFDSEを含みます。

マスターミックス3とマスターミックス4はコントロールとして使用され、塩化マグネシウムの代わりにEDTAが含まれています。次にピペットマスターミックスとリン酸塩標準の20マイクロリットルアリコート。A-Q-P-C-R 96ウェルプレートでは、各マスターミックスに16のウェルがあり、ここに示すようにリン酸標準

プレートの最後のレーンに2ミリモルGTPストックの180マイクロリットルをピペットで。次に、プレートをPCRマシンに入れます。1サイクルを摂氏30度に設定して40分間プログラムを実行します。

2番目の96ウェルプレートピペットでは、マラカイトグリーンワーキング試薬の20マイクロリットルアリコートをウェルに、A 1からH 10まで。次いで、実験からの重合緩衝液の60マイクロリットルで、クレームA1からH8まで、次に2ミリモルGTP溶液の20マイクロリットルで、プレートの各レーンのウェルに注入する。ここに示すように所定の間隔で1つ、さまざまな時点での反応を調べる。

30分後に混合物を上下にパイプでつなぎ、プレート1のレーン1から始めて、プレート1のレーン1からプレート2のレーン1に20マイクロリットルを移し、上下にピペットで混合します。これは、30分半後の30分間の反応のためのマラカイトグリーンカラー開発の出発点であり、プレート1のレーン2からプレート2のレーン2に20マイクロリットルを移し、混合します。これが、20分間の反応に対するマラカイトグリーンの発色開始点です。

残りのレーン3から7で32秒間隔でこれらの手順を繰り返し、33分半後に20マイクロリットルのGTPでプレート1のレーン8に混合します。次に、20マイクロリットルを2番目のプレートのレーン8に移し、混合します。これはゼロ分間の反応を表し、マラカイトグリーンの発色開始点です。

34分後、リン酸塩標準物質を含むプレート1のレーン9からプレート2のレーン9に80マイクロリットルを加え、34分半後に混合し、第1プレートのレーン10の2番目のリン酸塩標準液から80マイクロリットルをプレート2のレーン10に移し、混合する。次に、サンプルからすべての気泡を取り除き、プレートを室温でさらに25分半インキュベートします。インキュベーション後。

実験開始から60分後からプレートを96ウェルプレートリーダーに入れます。プレートを630ナノメートルで30秒ごとに5分間測定し、10の時点が取得されるようにします。最初のプレート測定はレーン1に対応し、2番目のプレート測定はレーン2に対応し、各レーンがマラカイトグリーンの色が発達するまでにまったく同じ時間を持つことになります。

次に、リン酸塩標準検量線を使用して各サンプルの遊離リン酸塩を計算し、経時的なリン酸塩の放出としてデータをプロットします。次に、曲線の線形範囲からF-D-S-Z-G-T-P加水分解活性を計算します。ここに示されているのは、サンプルのペレット中のSEP FとFDSZの割合です。

FDSZは、SEP FとGTPの両方がサンプル中に存在する場合のみ、バックグラウンドレベルを超えるペレットで回収されました。これらの尿細管におけるSEPPEとFDSZの正確な化学量論は不明ですが、これらの結果は、FDSZよりも多くのSEPPEが存在することを示唆しています。ここでは、枯草菌および大腸菌からのFDSZの光散乱を示し、50ミリモルの塩化カリウム緩衝液に2ミリモルのGTPの存在下でアセンブルしました。

F-D-S-E-B-Sは、バッファーのpHにもよりますが、FDSC ECよりも20〜40倍高い光散乱信号を提供します。興味深いことに、緩衝液中の塩化カリウム濃度を増加させても、F-D-S-Z-E-Cの光散乱シグナルには大きな影響を与えませんでしたが、F-T-S-Z-B-Sのシグナルは、50ミリモルの塩化カリウムを含む緩衝液と比較して、pH 7.5で約80倍、pH 6.8で約30倍、pH 6.5で45倍減少しました。FDSZのGTP加水分解活性は、遊離リン酸の比色分析法を用いて、異なる緩衝条件下で測定しました。

FT SZのGTPS活性は、異なるpH条件のそれぞれで塩化カリウム濃度が増加すると増加することがわかりました。50ミリモルの塩化カリウムでは、50ミリモルでのF-D-S-Z-B-Sフィラメントの束ねにより、gtpa活性が低下しました。塩化カリウムFDSZ EECは、FDSC EECポリマーの分解が速いため、F-D-S-Z-B-Sよりも3倍から6倍高いGTPS活性を示しました。

最後に、F-D-S-Z-B-SとF-D-S-Z-E-Cとの間のGTP加水分解活性の差は、おそらくF-D-S-Z-B-Sフィラメントの結合が減少したため、300ミリモルの塩化カリウムで減少しました。この手順に続いて、サンプル中のftsポリマーの構造に関連する追加の質問に答えるために、電気顕微鏡などの他の金属を実行できます。