プランクトン細胞(MBC-P)およびバイオフィルム細胞(MBC-B)の抗菌剤の最小殺菌濃度の確立
2014年1月2日
このプロトコルは、96ウェルマイクロタイタープレートを使用して インビトロで バイオフィルムを形成することができる細菌株のプランクトニックとバイオフィルム耐性の間の直接比較を可能にする。プランクトニックまたはバイオフィルム細菌は、選択した抗菌剤の連続希釈液に曝露される。生存率は寒天プレート上の成長によってアッセイされる。
この手順では、バイオフィルムを形成する可能性のある細菌株のプランクトン耐性とバイオフィルム耐性を直接比較します。まず、バイオフィルムを作製し、培地を補充し、選択した抗菌剤の段階希釈液を塗布します。次に、細胞を新鮮な培地で回復させます。
次に、LBオーガーにプレーティングすることにより、細胞の生存率をアッセイします。最終的に、プランクトン細胞とバイオフィルム細胞の最小殺菌濃度を決定することで、バイオフィルムの成長に起因する耐性の増加を示します。一般に、この方法に不慣れな個人は、隣接する井戸を汚染したり、バクテリアを殺さないように多岐にわたるデバイスの突起を十分に冷却できなかったりするため、苦労します。
野生型で変異株の細菌である細菌の変異株を摂氏37度の濃厚培地で16時間培養すると、飽和した一晩の培養物を、マグネシウム、硫酸塩、アルギニンを添加した最小限の培地であるM 63のような新鮮な培地に希釈します。次にEloqua。ウェルあたり100マイクロリットル。
各菌株に24ウェルを割り当て、摂氏37度で24時間インキュベートします。次に、7つのウェルに希釈シリーズの抗生物質の10倍ストック溶液を調製し、氷上に保存します。マルチチャンネルピペットを使用して、プランクトン細胞を含む使用済み上清を取り除きます。
次に、90マイクロリットルのM 63をすべてのウェルに加え、10マイクロリットルの適切な抗生物質ストック溶液を抗生物質なしコントロールに加えます。さて、複製とひずみごとに、10マイクロリットルの水を追加します。マイクロ力価プレートを摂氏37度で24時間インキュベートします。
マルチチャンネルピペットを使用して、プランクトン細胞を含む使用済み上清を取り除きます。115マイクロリットルのM 63をすべてのウェルに加え、24時間培養を続けます。摂氏37度で。
1つの半分96ごとに1ポンドのオーガープレートにラベルを付けます。多股のデバイスを滅菌するためのマイクロタイタープレートを100%エタノールに浸し、ブンゼンバーナーの直火にプロングを通します。プロングを少し冷まします。
プロングの先端を使用します。マイクロタイタープレートの各ウェルからプランクトン培養物をLBオーガープレートの表面に移します。LBオーガープレートを摂氏37度に16時間置きます。
次に、抗生物質培養物、野生型および変異株の細菌の最小殺菌濃度として、細菌増殖のカットオフを視覚的に決定し、摂氏37度の濃厚培地で16時間、飽和した一晩培養物を新鮮な培地に希釈し、96ウェルマイクロタイター皿の各ウェルに抗生物質耐性アッセイを行います。細菌希釈液の90マイクロリットルを追加します。次に、浮遊性細胞を抗生物質の濃度勾配にさらします。
まず、トブラマイシンマイシンのような抗生物質の希釈シリーズの10倍ストック溶液から始めます。実験デザインに従って、10マイクロリットルの抗生物質茎を追加します。次に、各複製および菌株について、抗生物質を使用しない制御井戸に10マイクロリットルの水を追加します。
マイクロタイタープレートを摂氏37度で24時間インキュベートし、生細胞をアッセイします。まず、96ウェルマイクロタイタープレートの半分ごとに1つのLBオーガープレートにラベルを付けます。多岐にわたるデバイスを100%エタノールで炎上させて滅菌します。
一度繰り返します。次に、マルチプロングデバイスを使用して、マイクロタイタープレートの各ウェルからLBオーガープレートの表面に約3マイクロリットルのプランクトン培養物を移します。プレートを摂氏37度で16時間インキュベートします。
次に、細菌の増殖のカットオフを目視で特定することにより、抗生物質の最小殺菌濃度を決定します。この実験では、2つの異なる最小BACTERICIDAL濃度アッセイを使用して、PA 14野生型と抗生物質耐性を欠く変異株の感度を比較しました。遺伝子NDVB。
ここでは、抗生物質トブラマイシンの最小殺菌濃度をバイオフィルムについて測定しました。PA 14のMBCBは100マイクログラム/ミリリットルであるのに対し、変異体は1ミリリットルあたり12.5マイクログラムです。対照的に、プランクトン細胞に対するトブラマイシンの最小殺菌濃度は、PA 14野生型と変異体の両方で1ミリリットルあたり8マイクログラムでした。
一度マスターすれば、NBCBは5日間に分けて、約1時間で完了することができます。
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概要
このプロトコルでは、96ウェルマイクロタイタープレートを用いてin vitroでバイオフィルムを形成できる細菌株について、プランクトン状態とバイオフィルム状態の耐性を直接比較することができます。抗菌剤の段階希釈液に曝露させた後、プランクトン細菌またはバイオフィルム細菌の生存率を評価します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 薬剤耐性
- バイオフィルム研究
背景
- バイオフィルムは、抗菌剤に対して耐性が高まる細菌のコミュニティです。
- プランクトン状態とバイオフィルム状態の耐性の違いを理解することは、効果的な治療戦略を立てる上で極めて重要です。
- 本研究では、効率的な比較のために96ウェルマイクロタイタープレートを使用しています。
- この分野の新人研究者にとって、コンタミネーションや手順上のミスは一般的な課題です。
研究目的
- プランクトン状態およびバイオフィルム状態の細菌における抗菌剤への耐性を比較する。
- 両方の状態における最小殺菌濃度（MBC）を決定する。
- バイオフィルム形成によってもたらされる耐性の向上を明らかにする。
使用方法
- 96ウェルマイクロタイタープレートにおけるバイオフィルムの形成。
- 抗菌剤の連続希釈系列の適用。
- 処理後の新鮮な培地における細胞の回収。
- LB寒天培地への塗布による生存率の評価。
主な結果
- プランクトン状細菌とバイオフィルム形成細菌の間で、耐性レベルに差があることを実証した。
- 両方の細菌状態で最小殺菌濃度を特定した。
- バイオフィルムに関連する耐性メカニズムに関する知見を提供した。
結論
- バイオフィルムの形成により、細菌の薬剤耐性が著しく向上します。
- これらの差異を理解することは、効果的な治療戦略を開発する上で不可欠です。
- 今後の研究では、バイオフィルムに関連する耐性の克服に焦点を当てるべきです。
よくある質問
業界における重要性
プランクトン状態およびバイオフィルム状態の両方における最小殺菌濃度を直接定量することで、抗菌剤探索におけるメカニズム面のリスク低減が可能になります。このアプローチにより、重要な変曲点における耐性プロファイルが明確になり、初期段階の抗感染症ポートフォリオにおける予測的信頼性が向上します。MBC-PとMBC-Bの比較データは、ターゲットの妥当性確認に寄与し、バイオフィルム関連感染症に対する化合物の優先順位付けの指針となります。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 異なる細菌表現型に対する抗菌薬の有効性を直接的に検証できます。
- プランクトン状態とバイオフィルム状態の間での耐性変化を定量化することで、機能的なターゲットバリデーションをサポートします。
- 抗バイオフィルム薬候補のメカニズム的なリスク低減を促進します。
- 耐性閾値に基づいたポートフォリオ選別（トリアージ）に有用なデータを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- プランクトン形式およびバイオフィルム形式の両方について、検証済みで再現性のあるマイクロタイターベースのアッセイを確立します。
- ハイスループットスクリーニングのワークフローに適した定量的なMBC出力を提供します。
- 化合物ライブラリ全体で抗菌試験の標準化を可能にします。
- 疾患に関連する細菌モデルにおける化合物の効力の信頼性の高い評価をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- in vitroの耐性データを、バイオフィルム関連感染症のトランスレーショナルモデルと整合させます。
- 抗バイオフィルム剤の初期探索から前臨床検証までの継続的なプロセスを提供します。
- 持続性感染を標的とする化合物の、リスク調整後の開発進展に関する意思決定に情報を供します。
- バイオフィルム関連疾患における臨床応用の予測価値を高めます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、初期探索とリード化合物同定のインターフェースに組み込まれており、仮説駆動型のターゲットバリデーションと定量的なスクリーニング結果を橋渡しするものです。
- 探索生物学：耐性メカニズムおよびバイオフィルムによる保護に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：細菌の両方の状態で再現性のある定量的なMBCデータを提供し、堅牢な化合物ランキングを可能にします。
- 分析：異なる条件下での抗菌薬の有効性を統計的に比較するための明確なリードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：in vitroの耐性プロファイルを、持続性感染の前臨床モデルへと結びつけます。
- 企業での再利用：継続的な抗感染症R&Dプログラム向けに、標準化され拡張可能なアッセイプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：抗菌剤開発における予測の信頼性を高め、メカニズムに関する曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：創薬チーム間でのアッセイの標準化、再現性、およびスケーラビリティを可能にする。
- 戦略的価値：抗バイオフィルム候補薬のgo/no-go判断および資本配分を改善する。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けを支援し、差別化された耐性プロファイルを持つ化合物の推進を後押しする。
実施上の考慮事項
- 無菌操作およびマイクロタイタープレートを用いたアッセイの専門的な技術が必要です。
- 標準的な微生物学用機器および分析インフラへのアクセスが不可欠です。
- コンタミネーションと操作ミスを最小限に抑えるため、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- in vitroでバイオフィルム形成能を持つ多様な細菌株に適応可能です。
- ウェル間のコンタミネーションを回避し、アッセイの信頼性を確保するための慎重な取り扱いが不可欠です。
