のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動その場での 3Dマッピング

次の実験の全体的な目標は、マイクロメートルスケールで細菌のバイオフィルムの局所的な物理的特性の2つの測定をCで実行することです。これを行うために、磁性粒子を成長中のバイオフィルムに導入して、バイオフィルムの構造特性を乱すことなく遠隔操作できるプローブとして機能します。次に、専用の磁気ピンセットを使用して、各粒子に定義された力を加えます。

バイオフィルムフィルムに埋め込まれたこのフィルムでは、磁気引っ張りによって誘発される粒子の変位をビデオ顕微鏡で監視し、局所的な粘弾性パラメータを導き出し、バイオフィルムの機械的特性の3D空間分布を提供します。大腸菌バイオフィルムの機械的不均一性を示し、どのバイオフィルム成分がバイオフィルムの物理的特性をサポートしているかについての手がかりを与える結果が得られます。したがって、顕微鏡法、cology、または全生物植生などの既存の方法に対するこの手法の主な利点は、材料の元の構造を乱すことなく、その場で機械的特性の空間分布を報告することです。

このプロトコルのための磁性粒子を準備するために、それらを再懸濁するために2.8マイクロメートル粒子のボルテックスのストックバイアル。次に、10マイクロリットルをマイクロ遠心チューブに移します。次に、粒子を洗浄するために、190マイクロリットルの最小媒体を追加し、チューブを渦巻き、磁気サンプルラックに置き、ペレットの形成を待ってスーパーナート溶液を吸引します。

この洗浄手順をさらに2回繰り返し、ビーズを最小培地190マイクロリットルに再懸濁します。次に、洗浄したビーズ溶液50マイクロリットルに0.4%グルコースを含むM63Bワン950マイクロリットルを加えて、粒子濃度を1ミリリットルあたり約500万ビーズに調整します。チャネルを準備するには、ダイヤモンドガラスカッターを使用して、長さ10センチメートルの2つの正方形のケイ酸ホウガラスキャピラリーを切断し、長さ8センチメートルのピースを2つ取得します。

ガラスカッターを使用して、スライドガラスを半分に切ります。次に、速効性シアノアクリレート接着剤または瞬間接着剤を使用して、この図に示すように、2つのキャピラリーピースを2つのスライドガラスピースに取り付けます。2センチ間隔で、両端に1センチのオーバーハングがあり、オートクレーブにはセットアップ全体と必要なチューブが必要です。

さらにチャネル接続を行うには、次の滅菌材料をラナーフローフードの下に集めます。取り付けられたチャネルチューブとコネクタ、2つの小児用バブルフィルターまたはトラップ。2つのクランプ、M 63 B、1.4%グルコース、および廃液ボトルで満たされた30ミリリットルの注射器。

2 つのキャピラリーを同じ方法で接続します。チューブの1つを使用します。廃液ボトルを1つのキャピラリーエンドに接続します。

次に、ルアーロックコネクタをジャンクションとして使用して、キャピラリーのもう一方の端を自家製のバブルトラップに接続するか、1つをトラップして1つをトラップ2に接続します。次に、30ミリリットルのM63B1シリンジをトラップ2に接続します。次に、0.4%グルコースを含む滅菌M 63 Bでセットアップを充填します。

シリンジをシリンジポンプに取り付け、実験速度よりも1時間あたり約5ミリリットル高い速度でシリンジポンプをオンにします。必要に応じて、回路内のすべての気泡を慎重に追跡し、除去します。この手順を試みている間、回路を切断して再接続します。

細胞粒子混合物をチューブに導入する前と導入時に気泡を取り除くように注意してください、それは毛細血管の上にゴミを置くのを助けます、そしてこれはバイオフィルムの継続的な成長を助けるでしょう。媒体がシステム内を10〜15分間流れるのを待ちます。その間に、マイクロ遠心チューブ内で、光学濃度0.5の細菌懸濁液1ミリリットルを、以前に調製した洗浄したビーズ溶液1ミリリットルと混合します。

フローをオフにし、チューブを再度取り付けてから、clを閉じますamps。次に、1ミリリットルの注射器にバクテリアビーズ混合物を充填し、キャピラリーに導入します。自家製のバブルトラップの後、装置をそこの顕微鏡に移します。

キャピラリーを顕微鏡ステージに取り付け、廃棄物容器を少し高い位置に置きます。シリンジポンプを顕微鏡の横のカウンタートップに置きます。装置を15〜20分間放置して、細菌が沈殿して毛細血管の表面に付着できるようにします。

細菌が毛細血管に付着したら、クランプを開き、シリンジポンプの流量を調整して流れを開始します。24時間から48時間の間に、バイオフィルムが毛細血管表面に発生し、毛細血管の底面に焦点を合わせ、サンプル画像のタイムラプス記録を開始します。通常、1分間に2枚の画像を取得する頻度で、バイオフィルムの成長を適切に報告できます。

この動画は、細胞粒子混合物を注入した直後のバイオフィルムの初期段階を示しています。キャピラリー取得では、周波数は1秒あたり1画像で、動画は1秒あたり10フレームで再生されます。成長の4時間後、粒子は表面から徐々に分離し、バイオフィルムボリュームに分配されます。

青い矢印は分遣隊のイベントを示していました。ここでは、取得周波数は1分間に2画像で、動画は毎秒15フレームで再生されます。成長の20時間後、均等に分布した12個の粒子を焦点面で監視できます。

この動画は、毛細血管の底面から20マイクロメートル上の中間面で撮影されています。1分間に2枚の画像を取得しました。ムービーは毎秒 15 フレームで再生されます。

磁性粒子を播種したバイオフィルムが手動で成長したら、磁気ピンセットを顕微鏡ステージにねじ込みます。観察ゾーンに適切な磁場勾配が生成されるように、ピンセットがこの図に示すように配置されていることを確認してください。赤で示されている測定領域は、ピンセットの左右極の端からY軸に沿って300マイクロメートルの位置にあります。キャピラリーの底部は、ピンセットの底部から200マイクロメートル下に配置されています。

このステップを実現するには、顕微鏡ステージのXY移動制御を使用して、左側の磁極の端とキャピラリーの左側の端を合わせます。同じ観察フィールドで、ピンセットの左側のマイクロメートルマニピュレーターのxダイヤルを使用して、キャピラリーの端から300マイクロメートルのポールの位置を調整します。右側でも同じ操作を行います。

次に、毛細管の底部に対してZ軸に沿ってピンセットの位置を調整します。まず、ポールの底をキャピラリーの底に合わせ、ポールをずらします。200マイクロメートルアップ。

マイクロマニピュレーターのZダイヤルを使用して、ファンクションジェネレーターのパラメーターをゼロ信号の24秒と4アンペアの16秒に設定します。トリガー付きの直流。20秒後に明視野光シャッターに送ります。

信号の同期には、パワーアンプを介してピンセットをファンクションジェネレーターに接続します。極を直列に正しく接続して、空間的に分散したクリープ曲線を取得するように注意してください。空間的な原点を取り、キャピラリーの内側の底部にあるZ軸の原点を取ります。

顕微鏡のZコントロール位置をメモします。次に、キャピラリーのエッジとポールピースのエッジによってそれぞれ定義されるx軸とY軸の交点を見つけます。これが解析の原点です。

座標をメモします。以下では、すべての座標がこの原点を基準にして取得されます。バイオフィルムが成長したら、ファインフォーカスコントロールノブを使用して、最初の平面がキャピラリーの底から4〜7マイクロメートル上に位置するように、キャピラリーの垂直位置を調整します。

このスライスは、空間参照の原点が左上隅にあるバイオフィルム スライスに対応します。次に、電流発生器のスイッチを入れ、画像取得シーケンスを手動でトリガーします。イベントの 42 番目のシーケンスを開始するために、ここで取得された画像ストリームは、特定の平面と XY フィールドに対応します。

シーケンスがキャプチャされたら、キャピラリーを動かして新しいフィールドのビデオをキャプチャします。このプロセスを繰り返して、データの分析に必要なすべてのビデオを取得します。画像Jまたは同等の粒子追跡ソフトウェアで、すべての粒子で取得されたすべてのスタックの画像を開きます。

パーティクルの変位を追跡して、画像をテキストファイルに変換します。次に、データ処理ソフトウェアを使用して、変位曲線を描画し、変位曲線をコンプライアンス曲線に変換し、ここに示すコンプライアンス式に従って、材料JFTの合計コンプライアンスが時間の関数として計算されます。 または、粘弾性および非圧縮性媒体に埋め込まれた粘弾性および非圧縮性媒体は、クリープコンプライアンス曲線の調整から、粘弾性材料のための一般的なバーガーモデルに粘弾性パラメータJゼロJを導出し、バイオフィルムクリープ曲線の粘弾性特性の空間分布を提供するために、バイオフィルムクリープ曲線の粘弾性特性の空間分布を提供し、バイオフィルムのマイクロボリューム約200で収集されました200 x 40立方マイクロメートル。一般的な結果をここに示します。

J ゼロの値、弾性コンプライアンスは、バイオフィルムの深さに沿った Z 軸と横方向の寸法に沿った y 軸の関数として与えられます。各ポイントは、クリープ曲線解析で J ゼロ値が提供されたビードに対応します。このデータは、バイオフィルムの深さに沿って局所的なコンプライアンスがほぼ3桁にわたって変化することを示しています。

また、すべてのバイオフィルムの高さで強い横方向の不均一性が見られました。また、このデータは、広範で非対称な形状を示すコンプライアンス値の分布も提供します。これらの結果を以前に他の生体高分子で得られた結果と比較すると、バイオフィルムの機械的特性は高度に架橋されたポリマーゲルによって支えられていることが示唆されます。

Cのバイオフィルムの2つの測定では、ここで見られるように、より低い流量など、さまざまな環境条件下で局所特性も行われました。1時間あたり0.1ミリリットルで成長したバイオフィルムのコンプライアンス値は、依然として非常に不均一な機械的プロファイルを示しています。しかし、1時間に1ミリリットルで成長したバイオフィルムに観察されたバイオフィルムの剛性の明確なZ深さ依存性はなくなりました。

これらの結果は、外部条件がバイオフィルム組織に大きな影響を与えることを示しています。完全に制御された成長条件下でBiofilm InstituteのVisco特性をマッピングする方法を十分に理解している必要があります。