のためのマイクロメトリックプローブの遠隔磁気作動

本実験の全体的な目的は、細菌バイオフィルムの局所的な物理的特性をマイクロメートルスケールで2つの測定によって評価することである。この目的を達成するため、成長中のバイオフィルムに磁性粒子を導入し、バイオフィルムの構造的特性を乱すことなく遠隔操作可能なプローブとして利用する。その後、専用の磁気ツイーザーを用いて、各粒子に規定の力を加える。

バイオフィルムに埋め込まれた粒子の、磁気牽引によって誘起される変位をビデオ顕微鏡でモニタリングし、局所的な粘弾性パラメータを導出することで、バイオフィルムの機械的特性の3次元空間分布を明らかにします。その結果、E. coliバイオフィルムの機械的な不均一性が示され、どのバイオフィルム成分が物理的特性を支えているかという手がかりが得られます。したがって、顕微鏡観察やコロニー解析、あるいはバイオフィルム全体の解析といった既存の手法に対する本手法の主な利点は、材料の元の構造を乱すことなく、機械的特性の空間分布をin situで報告できる点にあります。

本プロトコルのための磁性粒子の調製は、2.8 µm粒子のストックバイアルをボルテックスして再懸濁させることから始めます。次に、10 µLをマイクロ遠心チューブに移します。粒子を洗浄するため、190 µLの最小培地を加え、チューブを揺らした後、磁性サンプルラックに設置し、ペレットが形成されるまで待機して上清を吸引します。

この洗浄工程をさらに2回繰り返し、ビーズを190 µLの最小培地に再懸濁します。次に、洗浄済みビーズ溶液50 µLに、0.4% glucoseを含むM 63 B oneを950 µL添加し、粒子濃度を約5 million beads/mLに調整します。チャネルを準備するために、ダイヤモンドガラスカッターを使用して、長さ10 cmのホウケイ酸ガラスキャピラリー2本を切り、長さ8 cmのピースを2本作成します。

ガラスカッターを使用して、ガラススライドを半分に切断します。次に、速乾性のシアノアクリレート系接着剤または瞬間接着剤を用いて、この図に示すように2本のキャピラリー片を2枚のガラススライド片に取り付けます。2 cmの間隔を空け、両端に1 cmのオーバーハングを持たせた状態で、セットアップ全体と必要なチューブをオートクレーブで滅菌します。

さらにチャンネルを接続するため、ラミナーフローフード内で以下の滅菌材料を準備します。取り付け済みのチャンネルチューブとコネクタ、小児用バブルフィルターまたはトラップ2個、クランプ2個、M 63 Bおよび1.4% glucoseを満たした30 milliliterシリンジ、および廃棄ボトルです。

2本のキャピラリーを同様に接続します。チューブの1本を用いて、廃液ボトルをキャピラリーの一端に接続します。

次に、ルアーロックコネクタを接合部として使用し、キャピラリーのもう一方の端を自作のバブルトラップ（トラップ1）、またはトラップ1からトラップ2へ接続します。その後、30 mLのM 63 B oneシリンジをトラップ2に接続します。続いて、このセットアップに0.4% glucose含有の滅菌済みM 63 B oneを満たします。

シリンジをシリンジポンプに取り付け、実験速度よりも約5 mL/h速い速度でシリンジポンプを起動します。必要に応じて、回路内の気泡を注意深く追跡して除去してください。この操作を行う際は、回路を一度切り離してから再度接続してください。

細胞粒子混合物をチューブに導入する前および導入時に、気泡を完全に取り除くように注意してください。キャピラリーの上にゴミ箱を配置すると、バイオフィルムの連続的な成長に役立ちます。培地をシステム内に10分から15分間流します。その間に、マイクロ遠心チューブ内で、光学密度0.5の細菌懸濁液1mLと、あらかじめ準備した洗浄済みビーズ溶液1mLを混合します。

フローを停止させ、チューブを再接続し、クランプを閉じます。次に、1 mLシリンジに細菌ビーズ混合液を充填し、キャピラリーに導入します。自作のバブルトラップを通した後、装置を顕微鏡へと移します。

キャピラリーを顕微鏡ステージに取り付け、廃液容器をわずかに高い位置に配置します。シリンジポンプを顕微鏡の横のカウンターに置きます。細菌が沈降してキャピラリーの表面に付着するように、装置を15～20分間静置します。

細菌がキャピラリーに付着したら、クランプを開き、シリンジポンプの流量を調整してフローを開始します。24～48時間かけてキャピラリー表面にバイオフィルムが形成されるため、キャピラリーの底面にフォーカスを合わせ、サンプル画像のタイムラプス記録を開始してください。通常、1分間に2枚の頻度で画像を取得すれば、バイオフィルムの成長を十分に記録できます。

この動画は、細胞と粒子の混合液を注入した直後のバイオフィルムの初期段階を示しています。キャピラリーによる取得では、頻度は1秒につき1画像であり、動画は10フレーム/秒で再生されています。4時間の増殖後、粒子は表面から徐々に剥離し、バイオフィルムの体積内に分散しました。

青色の矢印は脱離イベントを示しています。ここでは、取得頻度は1分あたり2枚の画像であり、動画は15 fpsで再生されています。20時間の培養後、焦点面内で均等に分布した10数個の粒子を観察することができます。

この動画は、キャピラリー底面から 20 µm 上方の中心平面で撮影されています。画像は1分間に2枚取得されました。動画の再生速度は 15 fps です。

磁性粒子を播種したバイオフィルムが自然成長したら、磁気ピンセットを顕微鏡ステージにねじ込みます。観察領域に適切な磁場勾配が生成されるように、ピンセットをこの図のように配置してください。この図では、赤色で示された測定領域が、Y軸に沿ってピンセットの左右の極の端から300 µmの位置にあります。キャピラリーの底部は、ピンセットの底面から200 µm下に配置します。

このステップでは、顕微鏡ステージのXY移動制御を使用して、左手側の磁極の端をキャピラリーの左端に合わせます。同じ観察視野内で、ピンセットの左手側マイクロマニピュレーターのxダイヤルを用いて、磁極の位置をキャピラリーの端から300 micrometersに調整してください。右手側でも同様の操作を行います。

次に、キャピラリーの底部に対してZ軸方向のピンセットの位置を調整します。まず、電極の底部をキャピラリーの底部に合わせ、そこから電極を200 µm上に移動させます。

マイクロマニピュレーターのZダイヤルを使用して、ファンクションジェネレーターのパラメータを、ゼロ信号24秒および4 Aの直流をトリガーで16秒間出力するように設定します。20秒後に明視野照明シャッターへ送信してください。

信号を同期させるため、ピンセットをパワーアンプ経由で関数発生器に接続します。空間的に分布したクリープ曲線を取得するには、極を直列に正しく接続することに注意してください。空間原点を設定し、Z軸の原点をキャピラリーの内側底部とします。

顕微鏡のZ軸制御位置を記録します。次に、キャピラリーの端とポールピースの端によってそれぞれ定義されるX軸とY軸の交点を確認します。ここが解析の原点となります。

座標を記録します。以降のすべての座標はこの原点を基準として測定します。バイオフィルムが成長した後、微動フォーカスノブを使用してキャピラリーの垂直方向の位置を調整し、最初の平面がキャピラリー底面から4〜7 µm上の位置に来るようにします。

このスライスはバイオフィルムのスライスに対応しており、空間基準の原点は左上隅に位置しています。次に、カレントジェネレーターをオンにし、画像取得シーケンスを手動でトリガーします。42番目のイベントシーケンスを開始すると、ここで取得される画像ストリームは、特定の平面およびXY視野に対応します。

シーケンスのキャプチャ後、キャピラリーを移動して新しい視野のビデオをキャプチャします。このプロセスを繰り返し、データ解析に必要なすべてのビデオを取得します。すべての粒子で取得したすべてのスタックを、ImageJまたは同等の粒子追跡ソフトウェアで開きます。

粒子の変位を追跡することにより、画像をテキストファイルに変換します。次に、データ処理ソフトウェアを用いて変位曲線を描き、変位曲線をコンプライアンス曲線に変換します。ここでは、材料の全コンプライアンス J(t) が、ここに示すコンプライアンス式に従って時間の関数として計算されます。この式は、以前に既知の粘弾性で非圧縮性の媒体に埋め込まれた粒子の、印加応力と材料歪みの関係を記述したものです。クリープコンプライアンス曲線を粘弾性材料の一般的なバーガースモデルに適合させることで、粘弾性パラメータ J₀、J₁、η₀、η₁' を導出し、バイオフィルムの粘弾性特性の空間分布を提示します。クリープ曲線は、バイオフィルム内の約 200 × 200 × 40 µm³ の微小領域において、異なる深さで収集されました。代表的な結果をここに示します。

弾性コンプライアンスであるJ₀の値が、バイオフィルムの深さに沿ったZ軸および側方次元に沿ったy軸の関数として示されています。各点は、クリープ曲線解析によってJ₀値が得られたビーズに対応しています。このデータから、局所的なコンプライアンスがバイオフィルムの深さに沿ってほぼ3桁にわたって変動することが明らかになります。

また、すべてのバイオフィルムの高さにおいて、強い側方向の不均一性が認められました。データからはコンプライアンス値の分布も得られており、広範囲にわたる非対称な形状を示しています。これらの結果を、他の生物学的ポリマーで以前に得られた結果と比較すると、バイオフィルムの機械的特性は高度に架橋されたポリマーゲルによって支持されていることが示唆されます。

Cにおいて、バイオフィルムの局所的な特性の測定を、ここに見られるような低流量などの異なる環境条件下でも実施しました。0.1 milliliter per hourで成長させたバイオフィルムのコンプライアンス値は、依然として非常に不均一な機械的プロファイルを示しています。しかし、1 milliliter per hourで成長させたバイオフィルムで観察された、バイオフィルムの剛性の明確なZ方向の深さ依存性は消失しています。

これらの結果は、外部条件がバイオフィルムの構造に大きな影響を与えることを示しています。ビデオを視聴することで、完全に制御された増殖条件下でバイオフィルムの粘弾性特性をマッピングする方法について、十分に理解できるはずです。